Mekanismen for Cistanche Deserticola fremmer tarmfunksjon

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, Yun Qi

Abstrakt

Fenylethanoidglykosider(PhGs), en klasse av polyfenolforbindelser, regnes som en av de viktigste bioaktive bestanddelene avCistanchedeserticolaY.C. Ma (CD), hvis ekstrakt brukes oralt i tradisjonell kinesisk medisin. Selv om tidligere farmakologiske studier har rapportert at phgs utøver mange aktiviteter, har deres tarmtransportprofiler ikke blitt avklart. I denne studien undersøkte vi tarmpermeabiliteten til et PhG-rikt ekstrakt (PRE) fraCistancheDeserticolasom et integrert system i Caco-2 cellemonolayermodellen ved hjelp av et bioassay-system. Resultatene viste at PRE primært transporteres via dårlig absorbert passiv diffusjon ned en konsentrasjonsgradient uten efflux, noe som gir det farmakokinetiske grunnlaget for klinisk anvendelse av phgs iCistanche Deserticola. Vi bestemte også tarmpermeabiliteten til tre storePhGs[acteoside (AC), isoacteoside (IS) og echinacoside (EC)]ved HLPC. Videre utviklet vi en ny HPLC-fluorescensdeteksjonsmetode for å nøyaktig bestemme fluxmengden av AC og IS. Som forventet er transportegenskapene til de trePhGser i samsvar med PRE, noe som indikerer at dagens bioassay-system er hensiktsmessig og pålitelig for evaluering av transportegenskapene til aktive ingrediensgrupper (AIG) i PRE. Videre kan dette systemet også være egnet for andre planteekstrakter gitt passende bioaktivitet.

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche deserticola har mange effekter, klikk her for å vite mer

Introduksjon

Caco-2 cellelinjen, som ble avledet fra humane kolon adenokarsinomer, viser enterocyttlignende egenskaper. Under normale forhold skiller Caco-2 celler spontant fra modne celler og danner intakte monolayers [1]. De tilstøtende cellene holder seg via tette koblinger dannet på den apikale siden av monolayeren, som kan diskriminere de passivt og aktivt transporterte stoffene over epitellaget [2]. På grunn av den morfologiske og biokjemiske likheten med normale enterocytter, fungerer Caco-2 cellemonolayers som en godt akseptert in vitro-modell for studiet av tarmabsorpsjonspotensialet og transportegenskapene til legemidler [3, 4].

I motsetning til kjemikalier er planteekstrakter (PE) blandinger hvis biologiske aktivitet og aktive bestanddeler ofte ikke er godt identifisert [5]. Videre er tarmtransportegenskapene til PE, i motsetning til egenskapene til dens bestanddeler, nært knyttet til klinisk bruk. Fluxmålinger for en testprøve på tvers av en Caco-2 cellemonolayer involverer vanligvis kjemiske metoder, for eksempel HPLC, LC / MS, etc. Selv om disse metodene er kraftige verktøy, er de komplekse, tidkrevende, dyre og krever av og til sofistikert utstyr. Enda viktigere er at verken en enkelt eller en minoritetskomponent kan reflektere PE som helhet. Dermed må en ny tilnærming uavhengig av bestemmelse av bestanddeler etableres for å identifisere og evaluere transportegenskapene til PE.

CistanchedeserticolaY.C. Ma (CD), en holoparasittisk plante, er en vanlig tradisjonell kinesisk medisin som hovedsakelig brukes til å behandle nyremangel, kroppssvakhet og forstoppelse, og disse bruksområdene er offisielt registrert i den kinesiske farmakopéen [6]. Fenylethanoid glykosider (PhGs), inkludert echinacoside (EC), acteoside (AC), isoacteoside (IS), etc., er en klasse av polyfenolforbindelser [7]. De regnes som en av de viktigste bioaktive bestanddelene iCistanchearter [8]. Farmakologiske studier har vist at bioaktiviteten tilPhGser mangfoldig og inkluderer antioksidativ [9], anti-fatigue [10], hepatoprotective [11], immunmodulerende [12], antiinflammatoriske [7, 13] og nevrobeskyttende effekter [14]. Imidlertid er tarmtransportegenskapene tilPhGsikke er undersøkt. I denne studien utforsket vi tarmpermeabiliteten til et PhG-rikt ekstrakt (PRE) fra CD som et integrert system og permeabiliteten til tre store phgs (AC, IS og EC) i differensierte Caco-2 celler. Våre resultater indikerte at PRE primært transporteres via dårlig absorbert passiv diffusjon ned en konsentrasjonsgradient uten efflux, noe som gir det farmakokinetiske grunnlaget for klinisk anvendelse av phgs i CD.

Materialer og metoder

Materialer

Den menneskelige tarm Caco-2 cellelinjen ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS og EC (>98%) ble kjøpt fra Must Biotechnology Co. (Chengdu, Kina). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), fetal bovint serum (FBS) og ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) ble produsert av Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-brønns TranswellTM-plater (sett inn membranvekstområde 4,67 cm2 ) ble hentet fra Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Rat-tail kollagen ble hentet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle reagenser og kjemikalier for HPLC-analysen var av analytisk karakter.

Forberedelse av PRE fra Cistanche deserticola

Det lufttørkede CD-materialet ble pulverisert og ekstrahert ved perkolasjon med 70% etanol. Den PhG-rike fraksjonen ble tilberedt som tidligere beskrevet [10] og ekstrahert med vannmettet n-butylalkohol. Ekstraktspriten var konsentrert og tørket under redusert trykk. Makroporøs harpiks-UV spektrofotometri [15] målte et PhG-innhold på 78,4%. Den endelige prøven representerte et 1,75% utbytte av råmateriale etter tørr vekt. Den oppnådde prøven ble lagret ved -20 °C inntil videre bruk.

Bestemmelse av AC, IS og EC av HPLC

Et Shimadzu HPLC-system utstyrt med LC-løsningsprogramvaren ble brukt til å analysen av innholdet i AC, IS og EC i PRE. En omvendt intersil C18-kolonne (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) ble brukt og opprettholdt ved romtemperatur. De mobile fasene var acetonitril og vann som inneholdt 0,1% fosforsyre (v/v) med gradient elution (tabell 1) med en strømningshastighet på 1,0 ml/min. UV-spektrofotometerdetektoren ble satt til 334 nm. For å nøyaktig bestemme fluxen til AC og IS utviklet vi en ny HPLC-fluorescensdeteksjonsmetode (HPLC-FLD). Etter en strukturell analyse og fluorescensbølgelengdeskanning (data ikke vist), fikk vi de optimale fluorescensdeteksjonsforholdene for VEKSEL (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) og IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm)

HPLC analytisk metode ble validert ved hjelp av følgende ytelsesegenskaper: stabilitet, linearitet, følsomhet, presisjon (intra- og inter-day variabilitet) og nøyaktighet. Analyttene i transportbufferen ble lagret ved 25 °C i mørket i 24 timer, og stabiliteten ble målt. Analyttene var svært stabile i nærvær av vitamin C (0,4 %) fordi de relative standardavviksverdiene (RSD) i toppområdene var< 3.5%.="" the="" linear="" regression="" equation,="" correlation="" coefficient,="" range="" of="" linearity,="" lod,="" and="" loq="" for="" ac,="" is,="" and="" ec="" are="" shown="" in="" table="" 2.="" the="" lods="" (18–30="" nm)="" and="" loqs="" (60–100="" nm)="" values="" illustrate="" that="" the="" hplc-fld="" and="" hplc-uv="" methods="" are="" highly="" sensitive.="" the="" rsd="" values="" that="" express="" the="" precision="" of="" the="" method="" were="" all="">< 2%="" for="" intra-="" and="" inter-day="" variability,="" indicating="" good="" precision.="" for="" recovery="" evaluation,="" ac,="" is,="" and="" ec="" was="" added="" to="" the="" transport="" buffer="" to="" yield="" three="" (high,="" medium,="" and="" low)="" concentration="" levels.="" the="" recovery="" values="" of="" the="" method="" for="" the="" analytes="" are="" summarized="" in="" table="" 3.="" the="" average="" recoveries="" ranged="" from="" 90.0%="" to="" 96.4%,="" indicating="" good="" accuracy.="" in="" conclusion,="" the="" established="" hplc="" methods="" are="" satisfactory="" with="" respect="" to="" linearity,="" sensitivity,="" precision,="" and="" accuracy="" for="" the="" quantification="" of="" ac,="" is,="" and="" ec="" in="" transport="">

Bestemmelse av PRE ved bioassay system

Bioassay (total antioksidativ kapasitet) var basert på FRAP (ferric reduksjon / antioksidant kraft) analyse vi tidligere beskrev [16] og validert i form av linearitet og presisjon (intra- og inter-day variabilitet). Lineariteten til bioassay-metoden ble bestemt basert på kalibreringskurvene. Konsentrasjonsområdet for linearitet var 0,0625 − 40 μg/ml (y = 0,0258x+0,0968, R2 = 0,996). Presisjonen til den etablerte bioassaymetoden ble bestemt i form av intra- og inter-day variabilitet for en analyse av PRE (10,0 μg/ml). Den intra-dagers repeterbarheten av metoden ble bestemt basert på fem påfølgende bestemmelser på samme dag. Repetisjonsevnen mellom dagen ble målt basert på fem påfølgende bestemmelser på tre forskjellige dager. RSD-verdiene for metodens presisjon var henholdsvis 1,014 % og 4,72 % for variasjon mellom intra og mellom dager, noe som indikerer god presisjon. Dermed er den etablerte bioassay-metoden tilfredsstillende med hensyn til linearitet, presisjon og nøyaktighet for kvantifisering av PRE i transportbuffer.

Cellekultur

Caco-2 celler ble dyrket ved 37°C og 95% relativ fuktighet i en atmosfære som inneholder 5% CO2 og medium bestående av DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutamin, penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 μg / ml). Mediet ble endret annenhver dag under cellevekst og differensiering. Cellene ble dyrket i 75 cm2 plastflasker og høstet hver 3-5 dager med 0,05% EDTA-trypsin. For transporteksperimentene ble cellene sådd med en tetthet på 1×105 celler/cm2 på Transwell-innsatser belagt med kollagen. Omtrent 21 dager etter sådd ble monolayers brukt til transportforsøkene. Deres integritet ble bestemt ved å måle den trans-epiteliale elektriske motstanden (TEER) over monolayers med en EVOM utstyrt med ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). TEER-verdiene for Caco-2-cellemonolaget måtte overskride 500 O∙cm2.

Transporteksperimenter

Monolayeren ble vasket med transportbuffer (P-buffer som inneholder 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyuvat, 10 mM glukose, 3 mM CaCl2 og 145 mM NaCl, pH 7,4) og deretter forhåndsinkubert i 20 minutter ved 37 °C. Etter fjerning av transportbufferen ble fersk transportbuffer som inneholder testprøver lagt til det apikale (AP) kammeret (1,5 ml) i AP til basolaterale (BL) retningsstudier eller BL-kammeret (2,5 ml) i BL til AP-retningsstudier. For AC-, IS- og EC-analyser som bruker HPLC, ble en aliquot (300 μl) fjernet fra hvert mottakerkammer med forskjellige tidsintervaller (30, 60, 90 og 120 min). Mottakerkammeret ble etterfylt med samme volum av nyforvarmet (37 °C) transportbuffer etter hver prøvetaking. De innsamlede prøvene ble lagret ved −20 °C for videre bruk. For PRE-bestemmelse ved bruk av bioassay ble det bare tatt prøvene på 120 min. På grunn av ustabiliteten til PRE, AC, IS og EC ble 0,4% (w / v) vitamin C lagt til for å stabilisere prøvene for å bestemme AC-, IS- og EC-innholdet av HPLC, og prøvene for PRE bioassay ble analysert umiddelbart etter å ha blitt samplet. Den tilsynelatende permeabilitetskoeffisienten (Papp eller Papp) for hvert utvalg ble beregnet.

Dataanalyse

Papp-verdiene i AP BL- eller BLAP-retningene til AC, IS og EC ble beregnet basert på følgende ligning: Papp = (4Q/4t)/(A C0), der Papp er den tilsynelatende permeabilitetskoeffisienten (cm/s) bestemt av HPLC. (4Q/4t) er frekvensen av utseende på testforbindelsen (AC, IS eller EC) på mottakersiden (μmol/s); A er overflaten av innsatsen (cm2 ); C0 er den første testsammensetningskonsentrasjonen på donorsiden (μmol/ml). Spesielt ble masseenheten "μg" brukt i stedet for "μmol" da 'Papp-verdiene ble beregnet. Dataene uttrykkes som midler ± SD.

Resultater

Sammensetning av Acteoside, Isoacteoside og Echinacoside i PRE fra Cistanche Deserticola

Fordi AC, IS og EC regnes som de viktigste bioaktive phgs av Cistanche arter [8], analyserte vi innholdet i PRE via HPLC-UV. Det representative kromatogrammet er vist i fig. 1. Identifiseringen av disse bestanddelene var basert på å sammenligne oppbevaringstidene og UV-spekteret med de av autentiske standarder ved en bølgelengde på 334 nm. Innholdet i AC, IS og EC i PRE var henholdsvis 26,60 %, 1,84 % og 32,83 %. Dermed står disse tre forbindelsene for 61,27% av PRE; Videre indikerer resultatene ovenfor at ph.d.-innholdet i PRE er 78,4 %. Derfor står AC, IS og EC for ca. 80% av phgs i PRE.

Total antioksidantkapasitet for PRE, AC, IS og EC

Studier av antioksidativ aktivitet av phgs fra CD er rapportert [9], og AC, IS og EC står for ca. 80% av phgs i PRE. Dermed ble den totale antioksidantkapasiteten til PRE, AC, IS og EC analysert og uttrykkes ved hjelp av FRAP-verdiene (× 10-6 mmol). Som vist i fig. 2, da FRAP-verdien var 8 × 10–6 mmol, De endelige konsentrasjonene av PRE, AC, IS og EC var henholdsvis 6,20 μg/ml, 3,14 μg/ml, 22,92 μg/ml og 4,89 μg/ml, noe som indikerer at den totale antioksidative kapasiteten til disse fire prøvene er rangert som følger: AC > EC > PRE > IS. Bioaktiviteten til PRE tilskrives de aktive ingrediensgruppene (AIG). For ca. 60 % av PRE viste AC og EC sterkere total antioksidantaktivitet enn PRE og IS. Fordi IS (1,84 %) utgjør en svært liten brøkdel av PRE, er andre komponenter, som den svakt antioksidantiske IS, også tydelig aktive i PRE. Overraskende nok varierte den totale antioksidantaktiviteten med nesten 7 ganger mellom VEKSEL og isomer IS, noe som indikerer ikke bare antall fenoliske hydroksylgrupper [9] men også posisjonen til fenoliske hydroksylgrupper i molekylet påvirket den antioksidative effekten.

Validering av Caco-2 monolag

Hvis du vil validere Caco-2-cellemonolayersystemet, Papp-verdiene propranolol (en godt transportert markør) og Lucifer gul (en dårlig transportert markør) fra AP til BL over Caco-2 monolayers ble bestemt som henholdsvis 1,51 × 10-5 cm/s og 2,8 × 10–7 cm/s, og disse verdiene var enige med de som ble publisert i tidligere rapporter [17, 18]. Den alkaliske fosfataseaktivitetsanalysen bekreftet også at Caco-2-cellemonolagene var kvalitativt sammenlignbare med det lille tarmepitelet [19]

Permeabiliteten til Acteoside, Isoacteoside og Echinacoside

Generelt var Papp-verdiene til godt absorberte legemidler høye (> 1,0 × 10-5 cm/s), mens de av dårlig absorberte legemidler var lave (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

Permeabiliteten til PRE

Ovennevnte resultater indikerer at den totale antioksidative kapasiteten til PRE er minst på grunn av 61,27% av AIG fra PRE. Dermed evaluerte vi TR av PRE basert på konsentrasjonseffekten av total antioksidativ kapasitet og beregnet 'Papp-verdiene for å gjenspeile transportegenskapene til PRE. Papp-verdiene til PRE for AP! BL og BL! AP var (2,16 ± 0,26) × henholdsvis 10–7 cm/s og (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/s, noe som indikerer at denne forbindelsen var dårlig gjennomtrengelig. Videre var efflux eller aktiv transport ikke tydelig fordi forholdet mellom 'Papp BL til AP / 'Papp AP til BL for PRE var 1,45 [20]. Videre økte den toveis TR av PRE lineært mellom ca. 300 og 900 μg/ml (fig. 5). Mangelen på retningspreferanse av resultatene antyder at passiv diffusjon er den viktigste transportmekanismen til PRE.

Diskusjon

Sammenlignet med svært rensede legemiddelprodukter er PE generelt en blanding som består av hundrevis av bestanddeler med vidt forskjellige fysiokjemiske egenskaper. Derfor utøver PE systematisk, multitarget og flerkanals synergistisk virkning på grunn av deres komplekse AIG [21], noe som hindrer analysen av transportegenskapene til PE. For å evaluere transportegenskapene til PE mer vitenskapelig, har noen forskere identifisert flere komponenter, i stedet for en enkelt komponent, i PE [22-24]. Likevel kan et begrenset antall bestanddeler ikke gjenspeile PE som helhet. Det er imidlertid umulig å bestemme alle komponenter i PE. Videre, hvis forskjellige komponenter i PE viser helt forskjellige transportegenskaper, vil de holistiske transportegenskapene til PE være vanskelig å identifisere.

På 1990-tallet ble bioassaysystemer brukt til å evaluere TR av antimikrobielle midler [25]. I 2005 hadde Eguchi og hans kolleger [26] evaluert den antioksidative aktiviteten til gulrotekstrakt ved å bruke BL-medier fra differensierte Caco-2-celler; denne tilnærmingen er mer hensiktsmessig å reflektere in vivo situasjoner.

Basert på en tidligere rapport om aktiviteten til phgs [9] og våre resultater (fig. 2), kan TR av AIG i PRE evalueres ved å bestemme den totale antioksidative kapasiteten til mediet i mottakerkammeret. Etter transporteksperimentene fant vi ut at TR av PRE var lik i begge retninger, og denne transporten var umettet og dårlig absorbert ('Papp< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3],="" and="" it="" did="" not="" indicate="" efflux,="" suggesting="" that="" passive="" diffusion="" down="" a="" concentration="" gradient="" is="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" pre="" (fig.="" 5).="" furthermore,="" the="" transport="" characteristics="" of="" pre="" are="" consistent="" with="" those="" of="" ac,="" is,="" and="" ec,="" the="" effective="" components="" that="" display="" anti-oxidative="" activity="" in="" pre="" (fig.="" 4="" and="" table="" 4).="" this="" result="" was="" expected="" and="" indicated="" that="" the="" present="" bioassay="" system="" is="" appropriate="" and="" reliable="" for="" the="" evaluation="" of="" the="" transport="" characteristics="" of="" aig="" in="" pre="" in="" differentiated="" caco-2="">

I motsetning til den kanoniske Papp-verdien, som vanligvis brukes til å reflektere transporten av en enkelt forbindelse, kan 'Papp-verdien oppnådd fra TR basert på konsentrasjonseffektkurven ikke bare gjenspeile komponentene som trenger inn i monolayers med en intakt struktur, men også involverer andre faktorer relatert til målaktiviteten, for eksempel komponentenes metabolitter, kjemisk degraderte produkter, og til og med noen cytokiner utskilt fra Caco-2 celler som svar på stimulering som kan påvirke målet bioaktivitet. Dermed bestemmer multifaktoren nevnt ovenfor, i stedet for bare de transporterte intakte komponentene, 'Papp-verdien. Derfor kan 'Papp korrelere sterkere i Vivo-situasjoner enn den kanoniske Papp-verdien [26]. I denne studien avklarte vi pres passivt diffuserte og dårlig absorberte natur basert på 'Papp-verdien, og denne arten kan være relatert til den høye doseringen og den lange kliniske behandlingsperioden på CD [27]. Likevel vil disse funnene gi mer systematisk veiledning for klinikere i anvendelsen av CD når bare transportegenskapene til de fleste AIG i CD, ikke bare phgs, er identifisert.

Imidlertid må det valgte bioaktivitetselementet være tilstrekkelig følsomt for å bli oppdaget i mottakerkammerets medium, noe som gir en utfordring for etableringen av et bioassay-system for å evaluere transportegenskapene til PE. Videre bør bioaktiviteten også avhenge av så mange komponenter som mulig. I vår studie var den totale analysen mot oksidativ kapasitet mer hensiktsmessig enn flere andre metoder (S1 Fig.). Men likevel kan vår analyse bare oppdage TR av PRE på 120 min.

Samlet etablerte den nåværende studien et nytt bioassay-system for å evaluere tarmpermeabiliteten til PRE i differensierte Caco-2-celler. De oppnådde resultatene viste at en dårlig absorbert passiv diffusjon ned en konsentrasjonsgradient uten efflux er den viktigste transportmekanismen til PRE (fig. 5), som gir farmakokinetisk grunnlag for klinisk anvendelse av phgs i CD. Bruk av et nytt bioassay-system for å evaluere TR og dermed beregne 'Papp-verdiene for å vurdere tarmtransportegenskapen til AIG i PEs er klart mulig. Denne tilnærmingen kan også være egnet for andre PE gitt passende bioaktivitet

Informasjon om støtte

S1 Bilde. Effekter av PRE på (A) superoksid anion, (B) hydroksylradikale, (C) lipidperoksidasjonsprodukt og (D) DPPH radikal. Analyseprosedyrene ble utført i henhold til tidligere rapporter [1, 2] uten å bruke transportbuffer. Verdiene for IC50 (50 % hemming) og SC50 (50 % scavenging concentration) ble beregnet basert på standard konsentrasjonsresponskurver. (DOCX)

Forfatterbidrag

Unnfanget og designet eksperimentene: YG XC YQ. Utførte eksperimentene: YG CZ FL LF RC YS. Analyserte dataene: CZ YG YQ. Medvirkende reagenser/materialer/analyseverktøy: RC. Skrev avisen: YG YQ

Institutt for forskningssenter for farmakologi og toksikologi, Institutt for medisinsk planteutvikling, Det kinesiske akademi for medisinske vitenskaper &Peking Union Medical College, Beijing, P.R. Kina,

Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang, P.R. Kina