Cistanche Rb1 demper aldersrelatert vaskulær svekkelse ved å modulere Gas6-banen

Resultater Rb1 lindret senescens i aortas hos aldrende mus

For å identifisere antisenescenseffekten av Rb1, undersøkte vi først cellulær senescens, som er preget av ekspresjonen av proteiner involvert i cellesyklushemming og irreversibel vekststans (Yang et al. 2019). Ettersom immunhistokjemiresultatene er vist i figur 1(A,B), sammenlignet med de i Young-gruppen, viste Old þ Vehicle-gruppemus at aldring akselererte oppreguleringen av p21Cip1 og p16INK4a i thoraxaortaceller. Imidlertid lindret Rb1-behandling cellulær senescens i blodårer, spesielt i gruppen Old þ Rb1-20. I tillegg var Western blot-resultatene i samsvar medresultater fra immunhistokjemi. Som vist i figur 1(C), ble proteinekspresjonen til p21Cip1 og p16INK4a signifikant økt med omtrent 2- ganger i thoraxaorta til gamle mus sammenlignet med unge mus. Etter behandling med 20 mg/kg Rb1 ble proteinnivåene til p21Cip1 og p16INK4a nettopp økt med 41,92 prosent og 37,52 prosent sammenlignet med de for Young-gruppen, som var betydelig lavere enn for Old plus Vehicle-gruppen. I tillegg var det ingen signifikant forskjell i uttrykket av p21Cip1 eller p16INK4a mellom unge mus med og uten Rb1-behandling.

Figur 1. Effekt av Rb1 på thorax aorta senescens. Bilder av den immunhistokjemiske fargingen (400) av p21Cip1 (A) og p16INK4a (B) i tverrsnitt av aorta fra mus. (C) Western blot-analyse av mus thorax aorta p21Cip1 og p16INK4a uttrykk. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. p < 0,01 vs. Young-gruppen; # p < 0,05 vs. Oldþ kjøretøygruppen.

Rb1 forbedret vaskulær reaktivitet hos gamle mus

Et vaskulær ringeksperiment ble brukt for å evaluere endotelavhengig vasodilatasjon. Som vist i figur 2, i alle aortaringer i thorax hos mus, resulterte administrering av Ach i vasorelaksasjon. Ved maksimale konsentrasjoner (10–5 mol/L) induserte Ach omtrent 88,84 prosent ± 1,20 prosent og 58,35 prosent ± 2,50 prosent vasorelaksasjon i henholdsvis Young-gruppen og Old Þ Vehicle-gruppen, noe som viser at aldring er assosiert med vaskulær reaktivitetssvikt. Imidlertid resulterte 10 og 20 mg/kg Rb1-behandling i henholdsvis ca. 70,48 prosent ± 2,20 prosent og 80,90 prosent ± 3,24 prosent avslapning i aldrende mus thorax aortaringer som respons på 10 5 mol/L Ach.

Klikk her for å få Cistanche for anti-aldring

Rb1 reduserte cellulært adhesjonsmolekyluttrykk i thoraxaorta til aldrende mus

Vi undersøkte proteinuttrykket til visse celleadhesjonsmolekyler for å bestemmeinflammatoriskoganti-inflammatoriske effekterav Rb1 på gamle mus. Resultatene viste at proteinekspresjonen til ICAM-1, VCAM-1 og PAI-1 var signifikant økt med omtrent 2-4 ganger i thoraxaorta til gamle mus sammenlignet med de i gruppen Ung (Figur 3). I motsetning til dette, hemmet Rb1-behandling signifikant disse endringene i aldrende thoraxaorta hos mus, men hadde ingen effekt på gruppene med unge mus. Den kvantitative analysen indikerte at 20 mg/kg Rb1-behandling resulterte i ca. 36,58 prosent, 46,66 prosent og 49,34 prosent nedregulering av henholdsvis ICAM-1, VCAM-1 og PAI-1-proteinekspresjon, i aldrende thoraxaortavev, sammenlignet med mus fra Old plus Vehicle-gruppen.

Rb1 hemmet aldersrelatert vaskulær forkalkning og fibrose

Vi utførte HE-farging og alizarin red S-farging for å vurdere aortavevsstruktur og vaskulær medial forkalkning i henholdsvis aldrende mus. HE-farging viste at aldringsinduserte fortykkede vegger i thoraxaorta og uorganisering av den ekstracellulære aortamatrisen kunne lindres ved Rb1-behandling (Figur 4(A)). Som vist i figur 4(B), utviklet aldrende mus mer alvorlig medial forkalkning (rødfarget område) enn unge mus, mens Rb1-intervensjon reduserte denne patologiske endringen. Deretter undersøkte vi thoraxaorta-tverrsnitt ved Massons trikromfarging for å vurdere vaskulær medial fibrose hos aldrende mus. Resultatene viste at det var en merkbar økning i kollagenavsetning (blåfarget område) i Old þ Vehicle-gruppen sammenlignet med Young-gruppen (Figur 4(C)), og denne effekten ble signifikant hemmet av Rb1-intervensjon. Dessuten viste Western blotting at ekspresjonen av kollagen I og kollagen III økte signifikant med 4.34- og 2.62- ganger i gamle þ kjøretøygruppemus sammenlignet med unge mus; Rb1-behandling nedregulerte imidlertid ekspresjonen av kollagen I og kollagen III i gamle mus (Figur 4(D)). Dessuten hadde behandling med Rb1 ingen innflytelse på graden av thorax aorta forkalkning og fibrose hos unge mus (Figur 4(A–D)).

Rb1 regulerte Gas6-signalveien

Vi undersøkte videre om Rb1 fungerte gjennom Gas6/Axl-signalveien for å forbedre aldersassosiert thorax aorta svekkelse hos mus. Nedreguleringen av Gas6-proteinekspresjon med 41,72 prosent og mRNA-ekspresjon med 52,73 prosent i gamle mus sammenlignet med unge mus ble opphevet ved Rb1-behandling (figur 5(A,B)). Vi bestemte også proteinekspresjonen til Axl ved Western blotting. Interessant nok var det ingen signifikant forskjell i Axl-proteinuttrykk blant de fem eksperimentelle gruppene (figur 5(A)). Vi oppdaget heller ikke en signifikant forskjell i mRNA-nivåene til Axl blant gruppene (figur 5(B)).

Figur 2. Rb1-behandling svekket aldersassosiert endotelavhengig vasorelaksasjonssvikt i thorax aorta vaskulære ringer. Figurer som viser analyseresultatene. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. p < 0.05, p < 0.01 vs. den unge gruppen; # p < 0,05, ##p < 0,01 vs. Old þ Kjøretøy-gruppen.

Figur 3. Rb1-redusert cellulært adhesjonsmolekylekspresjon i aldrende thoraxaorta hos mus. Western blot-analyse av ICAM-1-, VCAM-1- og PAI-1-ekspresjon i thoraxaorta-vev. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. p < 0.01 vs. den unge gruppen; # p < 0.05, ##p < 0.01 vs. Oldþ kjøretøygruppen.

Diskusjon

I denne studien demonstrerte vi at Rb1 ble bedrealdersrelatert vaskulær svekkelseved å undertrykke forkalkning og fibrose gjennom regulering av Gas6-ekspresjon, men ikke Axl-uttrykk, som gir en potensiell terapeutisk strategi for å forhindre aldersrelatert vaskulær sykdom. Det er godt akseptert at senescens i vaskulær celle, som er preget av endotelial dysfunksjon og den fenotypiske overgangen til glatte muskelceller, kan resultere i økt vaskulær stivhet og økt tykkelse på vaskulære vegger (Liu et al. 2019). Vaskulær cellealderdom er et vanlig trekk ved ulike komplekse, aldersrelaterte sykdommer, spesielt hjerte- og karsykdommer (O'Rourke et al. 2010). Med utviklingen av vaskulær cellesenescens svekkes vaskulær funksjon (Gong et al. 2014). Aldersrelatert vaskulær dysfunksjon er eksemplifisert ved patofysiologiske endringer, inkludert en progressiv nedgang i endotelium-avhengig vasodilatasjon (Herrera et al. 2010; Gong et al. 2014). I vår studie bekreftet vi cellulær senescens i thoraxaortas til gamle mus, noe som ble indikert ved økt ekspresjon av de aldersrelaterte proteinene p21Cip1 og p16INK4a, samt en nedgang i endotelavhengig vasodilatasjon. Konsistensen av resultatene våre med de ovennevnte studiene antyder at det var noen viktige molekylære mekanismer assosiert med endringene i vaskulær cellepatofysiologi under aldring. Midler som virker på disse mekanismene vil sannsynligvis redusere og forsinke vaskulær cellealderdom.

Figur 4. Rb1-behandling forbedret aldringsindusert vaskulær forkalkning og fibrose. (A) Haematoxylin og eosin (HE)-farging (400), (B) Alizarin red S-farging (400) og (C) Massons trikromfarging (400) ) av representative thoraxaortaseksjoner i hver gruppe. (D) Western blot-analyse av kollagen I og kollagen III uttrykk i thorax aorta vev. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. p < 0,01 vs. Young-gruppen; # p < 0,05, ##p < 0,01 vs. Oldþ kjøretøygruppen

Figur 5. Påvirkningen av Rb1 på Gas6/Axl-signalveien. (A) Western blotting ble utført for å undersøke proteinekspresjonen til Gas6 og Axl. (B) qPCR ble utført for å undersøke mRNA-ekspresjonen til Gas6 og Axl. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. p < 0.05, p < 0.01 vs. den unge gruppen; # p < 0,05 vs. den gamle þ Kjøretøygruppen.

Akkumulerende bevis har avdekket at Rb1 anses som et lovende medikament for å forhindre vaskulær skade (Zhou et al. 2017, 2019a, 2019b; Zheng et al. 2020). Tidligere studier har avslørt at Rb1 forhindrer vaskulær cellealderdom og hemmer vaskulær forkalkning (Nanao-Hamai et al. 2019; Zhou et al. 2019b; Zheng et al. 2020). Det er imidlertid fortsatt usikkert om Rb1 kan beskytte arterielle funksjoner mot aldring og den aktuelle molekylære mekanismen. Her fant vi at Rb1 reduserte og forsinket arteriell senescens hos gamle mus, som demonstrert ved redusert ekspresjon av relaterte proteiner og forbedret vaskulær vasodilatasjon, noe som indikerer at Rb1 effektivt kan blokkere overdreven senescens i aldrende mus thorax aortas og kan brukes som et effektivt middel for å behandle eller forebygge aldersrelatert arteriell svekkelse.

Tidligere bevis har vist akkumulering av kronisk lavgradig arteriell betennelse med økende alder, noe som bidrar til aldersassosierte vaskulære strukturelle og funksjonelle endringer (Wang et al. 2014). Ytterligere studier har indikert at et mikromiljø beriket i inflammatoriske profiler induserer et fenotypisk skifte i VSMC-er fra den kontraktile til den syntetiske typen. Dette fenotypiske skiftet er preget av svekket ekspresjon av SMC-spesifikke kontraktile proteiner og sekresjon av ytterligere proinflammatoriske cytokiner, kjemokiner, ECM-proteiner og celleadhesjonsmolekyler, slik som kollagen, ICAM-1, VCAM-1 , og PAI-1 (Wang et al. 2011; Lacolley et al. 2018). Dessuten bidrar adhesjonsmolekyler til inflammasjonsindusert ombygging av arteriene, spesielt ved å reorganisere ECM-VSMC-interaksjoner og påvirke den fenotypiske moduleringen av VSMC-er (Intengan et al. 1999). Videre har studier vist at Rb1 har anti-inflammatoriske effekter in vivo og in vitro (Miao et al. 2017; Zhou et al. 2017). I denne studien fant vi at Rb1-behandling betydelig kunne redusere ekspresjonsnivåene til celleadhesjonsmolekyler relatert til inflammatoriske prosesser hos gamle mus, noe som tyder på at Rb1 kan fungere som et antiinflammatorisk medikament og beskytte vaskulaturen under aldring.

I tillegg til inflammatorisk skade, er ombygging av arterieveggen preget av forkalkning og fibrose den andre viktigste patofysiologiske endringen i aldersrelaterte avaskulær modifikasjoner og forårsaker vaskulær stivhet som bidrar til en nedgang i vasodilatasjon (McEniery et al. 2005; Iyemere et al. 2006; Kovacic et al. . 2011). Storskala studier har vist at koronar aterosklerotisk forkalkning øker med alderen (Tesauro et al. 2017). Annen forskning viste også tilstedeværelsen av økt forkalkning med aldring i halspulsåren (Wendorff et al. 2015). Tilsvarende indikerte resultatene våre at aldrende mus utviklet mer alvorlig vaskulær medial forkalkning enn unge mus. Rb1-intervensjon hemmet disse endringene vesentlig. Dette resultatet antydet at Rb1-administrasjon lindret graden av aldersrelatert vaskulær forkalkning in vivo. Tilstrekkelig bevis har vist at vaskulær forkalkning involverer en rekke patobiologiske prosesser snarere enn enkel kalsiumavsetning, blant annet spiller VSMC-bytting til osteoblastlignende celler en kritisk rolle (Zhou et al. 2019b). En begrensning av studien vår er at, til tross for at Rb1-intervensjon signifikant hemmet vaskulær forkalkning i aldrende mus thorax aortas, kontraktile VSMC-markører (som A-glattmuskelaktin og calponin) og osteogene VSMC-markører (som run-relatert transkripsjonsfaktor 2) ) krever ytterligere utforskning.

Dessuten observerte vi i denne studien reduserte interstitielle kollagennivåer og redusert relatert proteinekspresjon i Rb1-behandlede gamle mus sammenlignet med bærerbehandlede gamle mus, noe som antydet at Rb1 kan ha en gunstig effekt på vaskulær funksjon i aldrende thoraxaorta ved å lindre aldersindusert vaskulær fibrose. Harvey et al. (2016) rapporterte at arteriell stivning forårsaket av overdreven fibrose og økt kollagenavsetning kan resultere i økt vasomotorisk tonus og endret vevsperfusjon. Midler som demper fibrose anses å beskytte mot aldersrelaterte karsykdommer (Kim et al. 2018).

Det kan utledes ataldersrelatert vaskulær svekkelseer en kompleks prosess som involverer ulike unormale endringer, inkludert betennelse, forkalkning og fibrose. Enda viktigere fant vi at Rb1 var i stand til å hemme disse kjente unormale endringene i thoraxaorta hos gamle mus. Den underliggende mekanismen er imidlertid fortsatt ukjent. Gas6 ble identifisert som lig og for TAM-reseptorfamilien, spesielt Axl-tyrosinkinasereseptorer (Rothlin et al. 2015). En tidligere studie demonstrerte rollene til Gas6/Axl i regulering av flere cellulære funksjoner (Chen et al. 2019). En fersk studie antydet at Gas6/Axl spilte en avgjørende rolle i vaskulær forkalkning (Son et al. 2010; Kaesler et al. 2016; Nanao-Hamai et al. 2019) og kan også være involvert i behandlingsindusert nedregulering av kollagensyntese i VSMC og aldrende hjertevev (Chen et al. 2016; 2019). Dessuten avslørte tidligere studier at Rb1 aktiverte Gas6-transkripsjon på det spesifikke ARE-stedet i promotorregionen (Son et al. 2010; Nanao-Hamai et al. 2019). Her demonstrerte vi at Gas6-proteinekspresjon ble nedregulert i aldrende mus, men ble reversert ved Rb1-behandling, noe som indikerer at Gas6 kan delta i Rb1-mediert regulering av arteriell svekkelse hos gamle mus. Våre resultater viser imidlertid at det ikke var noen endring i Axl-protein- og mRNA-uttrykk, noe som var inkonsistent med en tidligere studie (Chen et al. 2019). TAM-reseptorfamilien inkluderer Tyro3, ​​Axl og MerTK. Selv om Gas6 viser den sterkeste affiniteten til Axl blant de tre medlemmene (Rothlin et al. 2015), har Sun et al. (2019) fant at Gas6-aktivering dempet inflammatorisk skade og apoptose hos mus, men ingen endringer i Axl-aktivering skjedde blant forsøksgruppene. Annen forskning antydet at Axl-ekspresjon, som hemmer apoptose og dermed vaskulær forkalkning, også var uendret hos Gas6–/– mus (Kaesler et al. 2016). Resultatene våre indikerte klart at Rb1 spesifikt svekket aldersrelatert Gas6-nedregulering, men hadde ingen innflytelse på uttrykket av Axl, som ble rapportert å være den primære hendelsen ansvarlig for vaskulær forkalkning og fibrose, for å forbedre aldersrelatert vaskulær betennelse og endotelavhengig vasodilatasjon . Det stabile uttrykket av Axl kan skyldes en tilstrekkelig mengde før Gas6-aktivering eller indikere at Gas6 fungerer gjennom andre reseptorer. Ytterligere undersøkelser for å utforske effekten av Rb1 på andre TAM-er som også kan aktiveres av Gas6, som Tyro3 og MerTK, er nødvendig.

Konklusjoner

I denne studien bekreftet vi at Rb1 hemmet vaskulær forkalkning og fibrose og reduserte uttrykket av cellulære adhesjonsmolekyler, som alle senere forbedret aldersrelatert vaskulær endotelavhengig vasodilatasjon, i det minste delvis ved å regulere Gas6-uttrykk, men ikke Axl-uttrykk. Ved ukontrollerbar aldring er det av stor betydning å finne midler som kan forebygge eller behandle aldersrelatert vaskulær cellesvikt. Vår studie gir bevis som validerer effekten av Rb1 på lindrende vaskulær skade hos aldrende mus.

Avsløringserklæring

Ingen potensielle interessekonflikter ble rapportert av forfatteren(e).

Finansiering Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China [81370447], Science and Technology Planning Project i Guangdong-provinsen i Kina [2016A050502014], Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund [SZXK002] og Medical Scientific Research Stiftelsen av Guangdong-provinsen i Kina [A2019079].

Datatilgjengelighetserklæring

Data og materiale er tilgjengelig på forespørsel til den korresponderende forfatteren.

Forfatterbidrag

SYK, DHL og XXQ bidro til utformingen og utformingen av dette arbeidet. LW, GYS og MW bidro til dataanalyser. SYK, LW og JMZ skrev manuskriptet. Alle forfattere leste og godkjente den endelige versjonen.

Referanser

Acosta JC, O'Loghlen A, Banito A, Guijarro MV, Augert A, Raguz S, Fumagalli M, Da Costa M, Brown C, Popov N, et al. 2008. Kjemokinsignalering via CXCR2-reseptoren forsterker senescens. Celle. 133(6): 1006–1018.

Brandes RP, Fleming I, Busse R. 2005. Endotelaldring. Cardiovasc Res. 66(2):286–294.

Chen FF, Song FQ, Chen YQ, Wang ZH, Li YH, Liu MH, Li Y, Song M, Zhang W, Zhao J, et al. 2019. Eksogent testosteron lindrer hjertefibrose og apoptose via Gas6/Axl-veien hos eldre mus. Exp Gerontol. 119:128–137.

Chen YQ, Zhao J, Jin CW, Li YH, Tang MX, Wang ZH, Zhang W, Zhang Y, Li L, Zhong M. 2016. Testosteron forsinker vaskulær glattmuskelcelle alderdom og hemmer kollagensyntese via Gas6/Axl-signalveien . Alder. 38(3):60.

Fridell YW, Villa J, Attar EC, Liu ET. 1998. GAS6 induserer Axl-mediert kjemotaksi av vaskulære glatte muskelceller. J Biol Chem. 273(12): 7123–7126.

Gong X, Ma Y, Ruan Y, Fu G, Wu S. 2014. Langsiktig atorvastatin forbedrer aldersrelatert endotelial dysfunksjon ved å lindre oksidativt stress og normalisere eNOS/iNOS-ubalanse i rotteaorta. Exp Gerontol. 52:9–17.

Harvey A, Montezano AC, Lopes RA, Rios F, Touyz RM. 2016. Vaskulær fibrose i aldring og hypertensjon: molekylære mekanismer og kliniske implikasjoner. Can J Cardiol. 32(5):659-668.

Herrera MD, Mingorance C, Rodriguez-Rodriguez R, Alvarez de Sotomayor M. 2010. Endotelial dysfunksjon og aldring: en oppdatering. Aldring Res Rev. 9(2):142–152.

Hsu JJ, Lu J, Umar S, Lee JT, Kulkarni RP, Ding Y, Chang CC, Hsiai TK, Hokugo A, Gkouveris I, Tetradis S, et al. 2018. Effekter av teriparatid på morfologien til aortaforkalkning i gamle hyperlipidemiske mus. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 314(6):H1203-H1213.

Hurtado B, Abasolo N, Munoz X, Garcia N, Benavente Y, Rubio F, Garcia de Frutos P, Krupinski J, Sala N. 2010. Assosiasjonsstudie mellom polymorfier i GAS6-TAM-gener og carotid aterosklerose. Thromb Haemost. 104(3):592–598.

Integan HD, Thibault G, Li JS, Schiffrin EL. 1999. Resistensarteriemekanikk, struktur og ekstracellulære komponenter i spontant hypertensive rotter: effekter av angiotensinreseptorantagonisme og konverterende enzymhemming. Sirkulasjon. 100(22):2267–2275.

Iyemere VP, Proudfoot D, Weissberg PL, Shanahan CM. 2006. Fenotypisk plastisitet i vaskulær glatt muskelcelle og regulering av vaskulær forkalkning. J Intern Med. 260(3):192–210.

Kaesler N, Immendorf S, Ouyang C, Herfs M, Drummen N, Carmeliet P, Vermeer C, Floege J, Kruger T, Schlieper G. 2016. Gas6 protein: its role in cardiovascular calcification. BMC Nephrol. 17(1):52. Kim EN, Kim MY, Lim JH, Kim Y, Shin SJ, Park CW, Kim YS, Chang YS, Yoon HE, Choi BS. 2018. Den beskyttende effekten av resveratrol på vaskulær aldring ved modulering av renin-angiotensin-systemet. Aterosklerose. 270: 123–131. Korshunov VA, Mohan AM, Georger MA, Berk BC. 2006. Axl, en reseptor tyrosinkinase, medierer strømningsindusert vaskulær ombygging. Circ Res. 98(11):1446–1452.