I denne studien, galaktan exopolysaccharide (EPS) fraCistancheKR780676 ble evaluert for sitt potensial til ålindre oksidativt stressved bruk av in vitro-analyser og in vivo-studier, saccharomyces cerevisiae (vill type) og densantioksidant(sod14, sod24, tsa14, cta2 og ctt12)anti-apoptotisk(pep4 og fs14) oganti-aldring(sod24, tsa1 og ctt12)) isogene gendelesjonsmutanter. Galactan viste sterk DPPH ognitrogenoksidfjernende aktivitetmed en lCso-verdi på henholdsvis 450 og 138 ug/mL. I gjærmutantmodellen ble oksidativt stress generert av H,0. omfattende fjernet av galaktan i mediet som bekreftet ved bruk av punktanalyser etterfulgt av fluorescerende DCF-DA-farging og mikroskopiske studier. Galaktanbehandling resulterte i en reduksjon i ROS generert i gjærmutantcellene som demonstrert ved redusert fluorescensintensitet. Videre viste galaktan beskyttelse mot oksidativ skade gjennom H,O,-indusert apoptoseinhibering i gjærmutantstammene (pep4 og fs1) ​​som førte til en økt overlevelsesrate ved å nøytralisere det oksidative stresset. I den kronologiske levetidsanalysen viste WT-celler behandlet med galactanEPS 8 prosent økning i levedyktighet, mens sod2-mutant viste 10-15 prosent økning, noe som indikerer uttalte anti-aldringseffekter. Galactan fra W. confuse KR780676 har et enormt potensial for å bli brukt som en naturlig antioksidant for nutrasøytiske, farmasøytiske og matteknologiske applikasjoner. Som vi vet, er dette den første rapporten om en grundig vurdering av in vivo antioksidantegenskaper til abakteriell EPS i et gjærslettingsmodellsystem.

Klikk for å bli Cistanche rik på EPS

Oksidasjon er en essensiell prosess for å opprettholde biologiske prosesser og også for produksjon av energi i alle levende organismer. Reaktive oksygenarter (ROS) og reaktive nitrogenarter (RNS)-radikaler produseres fra normal katabolisme av henholdsvis oksygen- og nitrogenmolekyler. Alvorlig oksidativt stress fører til ulike degenerative tilstander som DNA-skade, cellulær degenerasjon og karsinogenese. Disse kan resultere i mange helsemessige svekkelser som f.eksaldring, hjerte- og karsykdommer, kreft, skrumplever, aterosklerose, diabetesog revmatoid artritt2-6, antioksidanter er molekylene som fjerner frie radikaler som genereres i mat eller levende system og fører til forebygging av oksidative skaderelaterte helsetilstander-9. Selv om mange syntetiske antioksidanter er tilgjengelige som sterke radikalfjernere, har noen av dem vært knyttet til noen uønskede bivirkninger. I lys av dette har det vært økt interesse og etterspørsel etter naturlige antioksidanter i bruksnæringen og farmaindustrien. De fleste av de plante- og soppbaserte polysakkaridene er rapportert som betydelige beskyttende midler mot ROS11–21. Ulike mikrobielle eksopolysakkarider (EPS) inkludert fra melkesyrebakterier (LAB) har også blitt rapportert for deres betydelige antioksidantegenskaper. Disse anses å være tryggere alternativer til syntetiske. De siste årene har mange EPS fra LAB blitt studert for deres antioksidantpotensial og forebygging av oksidativ skade22,23. Antioksidantpotensial og beskyttende rolle til Weissella EPS har også blitt rapportert fra en rekke EPS isolert fra Weissella mange stammer som Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 og W. cibaria SJ1424–29. In vivo antioksidantegenskaper kan studeres ved å bruke forskjellige modellsystemer som cellelinjer30, C. elegans31, gjær32 og mus33. Tidligere har forskjellige forbindelser blitt screenet for deres potensielle antioksidantegenskaper ved bruk av Saccharomyces cerevisiae gjærgen-sletting mutant modell system32,34–37.

Denne studien er fokusert påantioksidantpotensialet til galaktan EPSprodusert av den probiotiske stammen Cistanche KR780676 fra en indisk tradisjonell fermentert mat (Idli-røre)38,39. I denne artikkelen blir galaktan-EPS screenet for in vitro antioksidantpotensial ved å bruke DPPH, nitrogenoksid og hydroksylradikal-rensende analyser og in vivo antioksidant,anti-apoptotiskoganti-aldringsegenskaperved bruk av mutantmodellsystem for gjærgen-sletting.

Materialer og metoder

Alle kjemikaliene inkludert medietilskudd ble anskaffet fra Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., India, og DCF-DA (2,7 Dichlorodihydrofuorescein diacetate) fra Sigma.

Mikrobiell kultur.CistancheKR780676 isolert fra en indisk sur fermentert mat (Idli batter), rapportert å produsere galaktan EPS, ble brukt i denne nåværende studien 38.

Deteksjon av EPS-produksjon. EPS-produksjonen av W. confusa ble observert fra koloninivå. Kort fortalt ble stammen dyrket på MRS-agar (supplert med 2 prosent sukrose). Etter 48 timer ved 30 grader ble det observert slimete/slimhinnekolonier. Produksjon av galaktan-EPS ble ytterligere verifisert under skanningselektronmikroskopi (SEM)-analyse.

Utvinning av EPS. EPS-ekstraksjonsprosessen ble utført i henhold til metoden beskrevet i Kavitake et al.38. Frisk inokulum (10 prosent) av W. confusa ble tilsatt til 2 prosent sukroseforsterket MRS-medium ved 30 grader i 48 timer under statiske forhold. Suspensjonen ble på denne måten sentrifugert (12,000xg i 15 minutter) for å isolere biomassen og behandlet videre med triklorsyre for å eliminere proteindelene. Galaktan-EPS ble utfelt ved bruk av iskald etanol (tredoblet volumet), sentrifugert (19 200 xg i 15 minutter) og den resulterende EPS ble oppløst i Milli-Q vann. Den rå EPS ble dialysert ved 12–14 kDa (48 timer, 4 grader) og frysetørket ved lyofilisering i 48 timer.

In vitro antioksidantegenskaper til galaktan EPS. DPPH-analyse for galaktan ble utført i henhold til den tidligere rapporten av Ye et al.9 og prosent renseaktivitet (prosent) ble beregnet ved følgende ligning.

hvor Ao og As er absorbansen til kontrollen (blindprøve, uten EPS) og prøven. Nitrogenoksid (NO) radikalfjerningsanalyse for galaktan ble utført i henhold til Sreejayan et al.40 og beregnet som følgende ligning,

hvor Ao er absorbansen til kontrollen (blank, uten EPS) og As er absorbansen i nærvær av EPS. Reduserende kraftaktivitet ble målt for galaktan EPS som rapportert av Ye et al.9. Absorbansen ble avlest ved 700 nm og det reduktive potensialet indikeres av en høy absorbanskapasitet til reaksjonsblandingen. Askorbinsyre (Vc) ble brukt som en positiv kontroll. Hydroksylradikalfjernende aktiviteten til galaktan EPS ble evaluert som beskrevet av Yang et al.41. Absorbansen ble lest ved 536 nm og renseprosenten ble beregnet som:

der en prøve er absorbansen til prøven, en blindprøve er en absorbans i fravær av en prøve og H2O2-løsning, og en kontroll er en absorbans i fravær av prøven

In vivo antioksidantegenskaper til galaktan EPS i gjærmutantstammer.

Gjær, S. cerevisiae, BY4741 villtype (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆), og gendelesjonsmutantstammer ble anskaffet fra Thermo Fisher Scientific, USA. Gjærstammer ble dyrket i gjærpepton dekstrose (YPD) medium supplert med eller uten 200 µg/ml Geneticin (G418 sulfat) for seleksjon av mutanter. YPD fast medium ble fremstilt ved tilsetning av 2 prosent Bacto agar til YPD flytende medium42.

Effekt av EPS på gjærvekst. Eksponentielt voksende gjær villtype (WT) kultur (ca. 1× 104 celler) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0–400 ug/ml) av EPS i en mikrobrønnplate og det endelige volumet ble gjort opp til 200 μL med YPD-buljong. Kulturen ble inkubert i 18 timer ved 30 grader etterfulgt av seriefortynning og spredning på YPD-agarplater. Platene ble inkubert ved 30 grader i 2 dager og kolonidannende enheter (CFUer) ble talt og levedyktigheten ble uttrykt som prosent CFU43.

Måling av biomarkører for oksidativt stress. Eksponentielt voksende gjær WT-celler ble forhåndsbehandlet med eller uten 300 ug/ml EPS i 2 timer. Ti cellene ble eksponert for 1 mM H2O2 i 1 time ved 30 grader i en shaker-inkubator og behandlet for måling av SOD-aktivitet og lipidperoksidasjonsnivåer i henhold til metoden beskrevet i tidligere rapporter44–46

Antioksidantegenskapen til EPS i S. cerevisiae-gendelesjonsmutanter.

Eksponensielt voksende kulturer av gjær WT og antioksidant-mangelfulle mutantstammer (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ og yhb1∆) ble behandlet med 300 ug/mL EPS etterfulgt av expos 2 t. 1 mM H2O2 i 1 time. Seriefortynnede celler ble spredt på YPD-agarplater, inkubert i 2 dager ved 30 grader, og levedyktigheten ble beregnet. For punktanalyse ble kulturer seriefortynnet i 10-folder, hvorav 4 μL ble flekket på YPD-agarplater og inkubert ved 30 grader i 2 dager og fotografert43,47. Deteksjon og måling av ROS. Eksponentielt voksende WT og antioksidant-mangelfulle mutantstammer (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ og ctt1∆) ble forbehandlet med eller uten EPS i 2 timer og eksponert for 1 mM H2O2 i 1 time ved 30 grader. Cellepelleter etter sentrifugering ved 5000 rpm i 5 minutter ble vasket to ganger med PBS-buffer, resuspendert i 200 μL PBS og inkubert med 20 μM DCF-DA i mørke i 15–20 minutter ved romtemperatur. Umiddelbart etter inkubasjonen ble cellene vasket to ganger med PBS, montert på objektglassene og observert under et Olympus Ix71 fluorescensmikroskop under 40 x objektiv ved bruk av et blått filter. For kvantifisering av ROS ble DCF DA-fargede celler resuspendert i 200 μL PBS etter vask og intensiteten av DCF-fluorescens ble målt ved bruk av et spektrofluorometer ved eksitasjonsmaksimum og emisjonsbølgelengder på 495/529 nm. Fluorescensenheter ble plottet mot hver behandlet og ubehandlet kultur og sammenlignet48,49.

Anti-apoptotisk aktivitet av galaktan.

Spot- og CFU-analyser. Eksponentielt dyrkede WT- og anti-apop totic-defekte mutantceller (pep4∆ og fs1∆) ble forhåndsbehandlet med EPS og inkubert sammen med respektive ubehandlede kontroller i 2 timer. For CFU-tellinger ble kulturer behandlet eller ubehandlet med EPS i 2 timer og inkubert med 0.5 mM H2O2 i 1 time. Hver seriefortynnede kultur ble spredt på YPD-agarplater og inkubert ved 30 grader i 2 dager og cellelevedyktighet ble representert som prosent CFU. For punktanalyse ble kulturer tillatt for seriefortynning etterfulgt av spotting på YPD-agarplater med eller uten 1 mM H2O2. Platene ble inkubert ved 30 grader i 2 dager og fotografert47.

Påvisning av en anti-apoptotisk markør for EPS

ved bruk av gjærmutantstammer. For ytterligere å bekrefte redningshandlingen til EPS på gjærceller fra den apoptotiske celledøden indusert av hydrogenperoksid i gjær, ble WT og anti-apoptotisk mangelfulle mutantstammer (pep4∆ og fs1∆) undersøkt for apoptosemarkører. Eksponentielt voksende WT-, pep4∆- og fs1∆-celler ble behandlet eller ubehandlet med 300 µg/mL EPS i 2 timer og ble deretter eksponert for 1 mM H2O2 i 1 time. Både behandlede og ubehandlede celler ble farget med akridinoransje og etidiumbromid (AO/EB) og observert under et fluorescerende mikroskop for kromatinkondensasjon50,51. For DAPI-farging ble de behandlede og ubehandlede cellene fiksert med 4 prosent paraformaldehyd og inkubert med 1 ug/mL DAPI i 5–10 minutter i mørke ved romtemperatur. Celler ble montert på objektglassene etter vask med PBS og observert under Olympus IX71 fluorescensmikroskop (UV-filter, 40× objektiv) for kjernefysisk fragmentering52,53.

Antialdringseffekt av EPS ved kronologisk levetidsanalyse.

Gjær villtype og antioksidantmangel mutant (sod2∆, tsa1∆ og ctt1∆) kulturer ble dyrket for å nå den stasjonære fasen og inkubert med eller uten EPS for kronologisk levetid (CLS) analyse. Overlevelsesevnen til hver stamme ble beregnet ved forskjellige tidsintervaller fra 0 til 30 dager. Cellelevedyktighet ble uttrykt som prosent CFU for både behandlede og ubehandlede kulturer54,55. Statistisk analyse. Alle eksperimentene ble utført i triplikater (±SD) og statistisk analysert ved bruk av IBM SPSS 20-programvare i en enveis ANOVA-modell. Tukeys HSD-sammenligningstest (s<0.05) was used to measure the significance level. 

Resultater og diskusjon Melkesyrebakterier (LAB) isolert fra fermentert mat har fått enorm oppmerksomhet hos matteknologer de siste årene på grunn av deres beviste probiotiske egenskaper. Blant bakteriene isolert fra indisk fermentert mat er Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. og de mindre utforskede Weisella spp. I likhet med de andre fordelaktige LAB-ene, har Cistanche-stammen KR780676 som ble isolert fra fermentert idli-deig i laboratoriet vårt blitt rapportert å fungere som en potensiell probiotisk kandidat39. Tidligere rapporter har denne galaktanen blitt karakterisert som et lineært homopolysakkarid og også screenet for dets fysisk-kjemiske, funksjonelle og emulgerende egenskaper38,56–58. Vi har også rapportert at cellene og cellesupernatantene til W. confusa KR780676 viste sterk antioksidantaktivitet39. EPS-produksjon fra W. confusa KR780676 ble observert på MRS-agarplate beriket med 2 prosent sukrose, inkubert i 48 timer (fig. 1A-i), som avslørte Weissella slimete kolonier og det ble ytterligere bekreftet i SEM-bilde (av Weissella-kolonien) som viser tilstedeværelsen av galaktan EPS sammen med celler (fig. 1A-ii). Trinn-for-trinn EPS-produksjon er en oversikt med den billedlige representasjonen i fig. 1B.

In vitro antioksidantegenskaper til galaktan EPS. Som vist i fig. 2A, er DPPH-fjerningsaktiviteten observert å være konsentrasjonsavhengig, fjerningsaktiviteten økte med galaktankonsentrasjonen. Den halvmaksimale effektive konsentrasjonen (IC50) av askorbinsyre var 8,8 µg/ml, mens galaktan EPS var 450 µg/ml. 1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) er en stabil fri radikal som delokaliserer de uparrede elektronene mot molekylet som helhet, og forhindrer dermed molekylene i å dimerisere og resultere i dyp fiolett farge59. Når DPPH-løsning tilsettes til forskjellige konsentrasjoner (50 til 500 µg/mL) galaktan, gir det opphav til en reduksjon av fiolett farge når konsentrasjonen øker. Antioksidanter når de reagerer med et elektron av DPPH, blir den dypfiolette fargen til DPPH til lys fiolett farge; og intensiteten til fargen avhenger av antioksidantaktiviteten til underlaget60. Galactan viste 60 prosent DPPH-rensende potensial som er høyere enn EPS fra den endofytiske bakterien Paenibacillus polymyxa EJS-3 (<45.40%)33.

Nitrogenoksid produseres når natriumnitroprussid spaltes i en vandig løsning ved en pH på 7,2. Nitrat og nitritt produseres under aerobe forhold når nitrogenoksid binder seg til oksygen61. Som vist i fig. 2B har galaktan potensial til å redusere nitrogenoksidgenerering fra natriumnitroprussid ettersom den halvmaksimale effektkonsentrasjonen (IC50) er 138 µg/ml, mens standard askorbinsyre var 11 µg/ml. Som vist i fig. 2C er den reduserende kraftaktiviteten til EPS positivt korrelert med dens konsentrasjon i økende rekkefølge. Standard (askorbinsyre) viste høyere reduserende kapasitet enn galaktan EPS som var i samsvar med Ye et al.9. Den reduserende kraftaktiviteten til galaktan indikerer potensiell antioksidantaktivitet. Når kaliumferricyanid [K3Fe (CN)6] tilsettes i galaktan EPS, reduseres antioksidantene i det til kaliumferricyanid [K4Fe(CN)6]

Figur 2. In vitro antioksidantegenskaper til galaktan. (A) DPPH-radikalfangende aktivitet, (B) Nitrogenoksidanalyse, (C) Reduserende kraftanalyse og (D) Hydroksylradikalfjernende aktivitet av galaktan EPS.

Hydroksylradikalfangende aktiviteten til galaktan er vist i fig. 2D. Galactan viste 41,93 prosent som høyeste aktivitet, mens 58,10 prosent av standarden ved samme konsentrasjon (1 mg/ml). Resultattrenden er i samsvar med tidligere rapporter for EPS fra Lactobacillus plantarum C88 (85,21 prosent for 4 mg/ml konsentrasjon av EPS)62 og Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 prosent for 1 mg/ml konsentrasjon av EPS)63. Sammenlignet med standarder viste galaktan 72,16 prosent effektivitet, mens EPS fra Lactobacillus plantarum C8862 og Paenibacillus polymyxa EJS-363 viste henholdsvis 95,19 og 68,55 prosent effektivitet.

In vivo antioksidantegenskaper til galaktan EPS i en gjærmodell. Tidligere rapporter har vist ulike helsefremmende biologiske egenskaper som anti-proliferativ, anti-ulcus, kolesterolsenkende, antioksidant, anti-inflammatorisk og immunmodulerende aktivitet av EPS avledet fra LAB64. I dette synet blir det viktig å evaluere den detaljerte antioksidanteffekten av EPS som kan støtte deres prebiotiske og/eller probiotiske potensial, hovedsakelig for å opprettholde tarmhomeostase ved å lindre oksidativt stress. Det cellulære antioksidantmaskineriet spiller en kritisk rolle i å lindre den uunngåelige ROS generert gjennom viktige cellulære metabolske veier. Ubalansen mellom cellens medfødte antioksidantforsvar og den genererte ROS kan være svært skadelig for cellene. Alvorlig oksidativt stress forårsaker potensiell skade på cellulære vitale komponenter, proteiner, nukleinsyrer og lipidmolekyler som igjen påvirker mange viktige signalveier og induserer apoptose. Kostinntaket av antioksidanter har vist seg å senke frekvensen av cellulære skademarkører som ROS-nivåer, ROS-mediert DNA-skade, apoptose og cellulær transformasjon som ytterligere resulterer i redusert forekomst av aldersassosierte lidelser65 Mikrobiell EPS som xantan og levans har vist antioksidantaktivitet i henholdsvis in vitro-analyser (DPPH og hydroksylradikalanalyser)5 og mot humane magekreftceller BGC-82366. Tidligere, I denne studien evaluerte vi antioksidant-, antiapoptotiske og antialdringseffekter som utøves av galaktan EPS isolert fra W. confusa KR780676 ved å bruke gjær Saccharomyces cerevisiae BY4741 som en modellorganisme.

Effekt av EPS på gjærvekst. Villtype gjærceller behandlet med forskjellige konsentrasjoner av EPS viste ingen vekstdefekter som bekrefter at galaktanet ikke induserte noen cytotoksisitet eller vekstdefekter ved noen av konsentrasjonene fra 0 til 400 ug/mL (fig. 3A) ). Celler behandlet med 300 ug/ml eller høyere konsentrasjon av galaktan viste signifikant høyere vekst, noe som indikerer at galaktan hadde gjærvekststimulerende aktivitet.

En galaktankonsentrasjon på 300 ug/ml brukes for påfølgende eksperimenter med gjærstammer. Galactan reduserer SOD-enzymaktivitet. Etter den sterke in vitro antioksidantaktiviteten som vises av galaktan EPS, videre utsatt for å sjekke dens effekt på SOD-aktivitet i gjær WT-cellene. Resultatene våre (fig. 3B) viser at det oksidative stresset indusert av H2O2-behandling forårsaket en kraftig økning i SOD-aktiviteten til H2O2-behandlede WT-celler sammenlignet med ubehandlede celler. I motsetning til dette resulterte galaktanforbehandling av WT-celler etterfulgt av eksponering for H2O2 i en dobbel reduksjon i SOD-aktiviteten sammenlignet med den til cellene behandlet med H2O2 alene, noe som indikerer at galaktan hjelper gjærcellene med å håndtere det superoksidradikal-induserte oksidativet. stress47,67.

Oksidativt stressindusert av peroksidbehandling aktiverer superoksidenzymet og en endring i nivået av SOD-aktivitet er et direkte mål på nivået av cellulært oksidativt stress. I denne studien ble NBT-reduksjonsmetoden brukt, hvor NBT er en indikator på superoksidradikalproduksjon. Hemming av NBT-reduksjon er et direkte mål på SOD. Siden SOD konkurrerer med NBT om superoksidradikaler generert ved å eksponere riboflavin for synlig lys i nærvær av oksygen og metionin, som er en elektrondonor. Superoksid reduserer NBT til et blåfarget produkt, formazan som kan måles kolorimetrisk ved 560 nm.

Tidligere rapporter indikerer at LAB EPS har utøvd en antioksidanteffekt på en konsentrasjonsavhengig måte i in vitro-analyser, og i tykktarmskreftcellelinjer og in vivo-modeller. EPS' evne til å rense ROS kan tilskrives deres forskjellige kjemiske grupper68. Andre av EPS (500 µg/ml) fra Bacillus amyl liquefacient har vist seg å påvirke SOD-aktivitet i stor grad og beskytte HepG2-cellene mot oksidativt stress indusert av H2O2 68. Tilsvarende viste EPS fra L. plantarum en konsentrasjonsavhengig effekt på SOD-aktivitet i Caco2-celler mot H2O2-indusert oksidativt stress69. Resultatene våre, i samsvar med disse rapportene, viser at galaktan EPS-forbehandling fjerner superoksidradikaler indusert av H2O2-behandling i WT-gjærceller.

EPS reduserer cellulær lipidperoksidasjon. Malondialdehyd (MDA) er den mest studerte cellulære lipidperoksidasjonsbiomarkøren som indikerer nivået av oksidativt stress. MDA er et kjemisk stabilt, svært reaktivt dialdehyd og kan lett bindes til proteiner, nukleinsyrer og lipoproteiner. Det er svært mutagent og kan i stor grad påvirke de biokjemiske egenskapene til disse biomolekylene, noe som er skadelig for ulike signalveier70. En økning i MDA-nivåer er en indikator på ROS-indusert vevsskade, og økte nivåer påvises i flere humane patologier46. I denne studien, for å undersøke hvordan EPS-forbehandling påvirker lipidperoksidasjonen indusert av H2O2 i gjær WT-celler, ble MDA-nivåer estimert. Resultatene viste en ca. 1,5- ganger reduksjon i MDA-nivået i EPS-forbehandlede celler, sammenlignet med de som ble eksponert for H2O2 alene som vist i fig. 3C.

Tidligere har EPS fra L. plantarum C88 vist seg å redusere MDA-nivåer indusert av H2O2-behandling, på en doseavhengig måte (50–200 ug/ml) i Caco2-celler, noe som indikerer at peroksid-indusert membranskade i tarmcellene kan lindres ved tilskudd av EPS69 (zhang 2013). Videre reduserte 500 ug/mL EPS fra B. amyloliquefaciens signifikant H2O2-indusert MDA i HepG2-celler71. Resultatene våre på H2O2-indusert MDA-nivåer i gjærceller og dens betydelige reduksjon etter forbehandling av cellene med galaktan-EPS indikerer at behandlingen med galaktan-EPS reduserer cellulær ROS-indusert lipidperoksidasjon og i sin tur kan beskytte celler fra vevsskade forårsaket av peroksidradikaler og hjelper til med å opprettholde cellulær integritet

eksperimenter. *representerer P<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Galactan beskytter gjærantioksidantgenmutanter under oksidativt stress. For å evaluere antioksidantevnen til galaktan, ble forskjellige antioksidant-genmangelfulle gjærmutanter (som mangler ulike gener for oksidativ stressrespons) behandlet med galaktan og deretter utsatt for en sub-letal dose av H2O2 42. SOD (sod1∆ og sod2∆), katalase (cta1∆ og ctt1∆), tioredoksinperoksidase (tsa1∆), glutationreduktase (glr1∆), og nitrogenoksidoksidoreduktase (yhb1∆) mutanter når de behandles med H2O2. viste lav overlevelse (sod1∆ 10,8 prosent , sod2∆ 13,17 prosent , tsa1∆ 13,55 prosent , cta1∆ 15,34 prosent , ctt1∆ 17,06 prosent , glr1∆ 27,37 prosent og ∆y 38 prosent og . I kontrast, med galaktan-forbehandlingen, økte toleransen mot oksidativt stress i alle antioksidant-genmangelfulle mutanter og deres levedyktighet økte betydelig (sod1∆ 78,43 prosent , sod2∆ 59,96 prosent , cta1∆ 87 prosent , ctt1∆ 87 prosent . ∆ 72,73 prosent , glr1∆ 75,26 prosent og yhb1∆ 82,41 prosent ) som vist i fig. 4A. Disse resultatene tyder på at galaktan effektivt kan fjerne frie radikaler indusert av H2O2 i mutanter som mangler spesifikke oksidativt stressresponsgener og beskytter cellene mot oksidativt stress. Tilsvarende beskyttelse ble observert i punktanalysen, der galaktan reddet mutantene fra oksidativt stress og økte levedyktigheten som vist i fig. 4B.

Celler er utviklet med enzymatiske antioksidantforsvarssystemer for å motstå det endogene oksidative stresset forårsaket av ROS generert gjennom ulike fysiologiske reaksjoner, som ellers ville ha skadelige effekter på cellens velvære. Tidligere rapporter og våre resultater i denne studien tyder på at EPS er i stand til å rense ROS og forbedre cellelevedyktighet. Resultatene våre med mutantstammer med gjæroksidativ stressrespons tyder på at galaktan EPS-behandling fjerner både cytosoliske og mitokondrielle superoksidradikaler indusert av H2O2-behandling, som bevist av den økte levedyktigheten til henholdsvis gjær sod1∆ og sod2∆ mutantstammer. SODs er primære enzymatiske antioksidantforsvar i cellene mot endogent og eksogent oksidativt stress, og mutasjoner i disse genene har vært implisert i kreft og degenerative lidelser. På samme måte indikerer antioksidantredningen av cta1∆ og ctt1∆ (katalasemutanter) ved EPS-behandling at behandling med galaktan EPS gir beskyttelse mot peroksisomalt og cytosolisk oksidativt stress indusert av H2O2. Catalase er ansvarlig for cellulær avgiftning av hydrogenperoksid og mangelen er assosiert med utbruddet av aldersrelaterte lidelser. TSA1, tioredoksinperoksidase er både ribosomalt assosiert og fritt cytoplasmatisk protein som lindrer cellene fra hydrogenperoksidstress. Rapporter tyder på at TSA1 også har en rolle i reparasjon av oksidativ DNA-skade. Resultatene våre tyder på at EPS-behandling redder gjær-tsa1∆-celler fra peroksidindusert stress. Pattedyrperoksiredoksiner har en positiv effekt på cellevekst, metabolisme og immunfunksjoner. Deres mangel resulterer i forhøyet cellulært oksidativt stress som påvirker viktige signalveier og er implisert i nevrodegenerative lidelser, maligniteter og inflammatoriske sykdommer 72. Glutation-antioksidantmekanisme er et annet førstelinje-enzymatisk antioksidantforsvarssystem som er tilstede i cellene for å overvinne oksidativt stress. GLR1 er gjærhomologen til pattedyrs glutationreduktase, lokalisert til både cytosol og mitokondrier73. Glr reduserer oksidert glutation (GSSH) til redusert glutation (GSH) og spiller en rolle i å opprettholde GSH-nivåer i cellene som igjen avgifter superoksid- og hydroksidradikaler, og beskytter dermed cellene mot oksidativt stress74. Resultatene våre viser en høy følsomhet av gjær glr1∆ overfor H2O2 som ble lindret ved forbehandling med galaktan EPS, noe som tyder på at galaktan EPS kan beskytte cellene som mangler GLR1 mot oksidativt stress. Interessant nok har glutationreduktase-mangel vært involvert i aldring og aldersrelaterte metabolske, degenerative og kardiovaskulære lidelser75,76. Som vist i fig. 4A ble yhb1∆ også beskyttet av galaktan EPS mot H2O2-stress, noe som antyder at galaktan-EPS beskytter cellene som mangler YHB1 mot oksidativt stress. Gjær YHB1 er et favoritthemoglobin som har blitt rapportert å beskytte cellene mot nitrogenoksidstress77 og oksidativt stress78. Bevis tyder på at den humane homologen til YHB1 ser ut til å redde celler fra alfa-synuklein toksisitet som er en biomarkør for Parkinsons sykdom79. Disse tidligere funnene og resultatene våre antyder at EPS kan fremme celleoverlevelse mot utvikling av degenerative lidelser.

For å vurdere nivået av ROS i gjærmutantene med tilstedeværelse og fravær av galaktan under H2O2-stress, ble gjærceller observert under et fluorescensmikroskop og det intracellulære oksidasjonsnivået ble beregnet med et spektrofuorometer47,48. Gjærmutanter behandlet med H2O2 alene viste flere grønne fluorescerende celler sammenlignet med de som var forhåndsbehandlet med galaktan. (Fig. 4C). DCF-fluorescensintensiteten økte med omtrent 60 prosent, mens med galaktanforbehandling reduserte den til omtrent 30 prosent i H2O2-behandlede gjærmutanter sammenlignet med WT og respektive kontroll (fig. 4D). Både mikroskopiske og spektrofotometriske resultater indikerer et økt nivå av ROS i cellene som mangler spesifikke antioksidantgener sammenlignet med respektive kontroller. Kulturer forhåndsbehandlet med galaktan og deretter eksponert for H2O2 viste en redusert fluorescens sammenlignet med de uten galaktanforbehandling, noe som antyder at galaktan reduserte ROS-induksjonen H2O2-eksponering i gjærmutantceller og fremmer celleoverlevelse. I alle de ovennevnte eksperimentene, da cellene ble vasket før tilsetningen av H2O2, viste ingen signifikant redning (tilleggsdata) som indikerer at ROS-oppfangingen av galaktan skyldes direkte fjerning i mediet snarere enn i den intracellulære handlingen.