Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosider induserer apoptose i Eca-109-celler via den mitokondrieavhengige banen
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
CHANGSHUANG FU, JINYU LI, ADILA AIPIRE, LIJIE XIA, YI YANG, QIUYAN CHEN, JIE LV, XINHUI WANG og JINYAO LI
Abstrakt
Cistanche tubulosahar ulike biologiske funksjoner. I denne studien ble antitumoreffekten av vannløselige fenyletanoidglykosider av C. tubulosa (CTPG-W) på spiserørskreft undersøkt. Eca-109-celler ble behandlet med CTPG-W og cellelevedyktigheten ble målt ved MTT-analyse. Apoptosen, cellesyklusen, mitokondriell membranpotensial (Δψm) og reaktive oksygenarter ble analysert ved hjelp av flowcytometri. Nivåene av proteiner i apoptotiske veier ble påvist ved western blot-analyse. Det ble fastslått at CTPG-W reduserte levedyktigheten til Eca-109-celler betydelig gjennom induksjon av apoptose og cellesyklusstans. Etter CTPG-W-behandling ble Δψm av Eca-109 betydelig redusert, noe som er assosiert med de oppregulerte nivåene av B-cellelymfom-2 (Bcl-2)-assosiert X og nedregulerte nivåer av Bcl-2. Følgelig ble nivåene av cytokrom c og c-Jun NH2-terminal kinase økt, noe som oppregulerte nivåene av spaltet-poly (ADP-ribose) polymerase og spaltet-kaspase-3, {{18} } og -9, men ikke caspase-8. Tilsvarende viste nivåene av reaktive oksygenarter i Eca-109-celler bemerkelsesverdige endringer. Disse resultatene indikerte at CTPG-W induserte apoptose av Eca-109-celler gjennom en mitokondrieavhengig vei.
Introduksjon
Spiserørskreft er en av de vanligste krefttypene med den 11. høyeste sykelighetsraten og 6. høyeste dødelighetsrate globalt og forårsaket ~439,000 dødelighet i 2015 (1). Forekomsten av kreft i spiserøret varierer spesielt mellom ulike regioner, med Øst-Asia og østlige og sørlige Afrika med de høyeste forekomstene og Vest-Afrika de laveste forekomstene i 2012 (1,2). I Kina var de estimerte krefttilfellene og dødeligheten i spiserøret henholdsvis 477,000 og 375,000 i 2015 (3). Selv om sykelighetsraten for spiserørskreft har gått ned i mellom- og høy-midt sosiodemografisk indeksland mellom 2005 og 2015, er dødeligheten fortsatt høy på grunn av dårlig prognose (1,4). Kombinasjonen av kirurgisk reseksjon med kjemoterapi eller strålebehandling har blitt brukt til å behandle spiserørskreft, men det har blitt rapportert at mellom 2003 og 2014 forble 5-årsoverlevelsesraten<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Tradisjonell kinesisk urtemedisin (CHM) har blitt brukt til å behandle ulike krefttyper, inkludert ikke-småcellet lungekreft (6), kolorektal kreft (7), hepatocellulært karsinom (8). Nylig rapporterte de kliniske studiene at kombinasjonen av CHM med kjemoterapi eller strålebehandling ikke bare viste en rekke fordeler på livskvaliteten og lindre bivirkninger indusert av kjemoterapi eller strålebehandling (9,10), men også forbedret overlevelsesraten for pasienter med ikke-småcellet lunge-, lever-, mage-, kolorektal-, nasofarynx- eller livmorhalskreft (9). Imidlertid er det motstridende bevis angående effekten av CHM-behandling på spiserørskreft (10,11). Tallrike studier viste at en rekke urtemedisiner eller komponenter kunne hemme veksten av esophageal cancerceller in vitro og in vivo, inkludert Andrographis paniculata (12,13), Daikenchuto (14), icariin (15), Rosa Roxburghii Tratt og Fagopyrum Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (en ny ent-kaurene diterpenoid) (19), Qigesan (20) og Tonglian avkok (21). Cistanche er en type CHM og utøver ulike biologiske funksjoner, inkludert antioksidasjon, anti-inflammasjon og nevrobeskyttelse (22,23). Vår forrige studie viste detCistanche tubulosa fenylethanoid glykosider(CTPG) kan undertrykke veksten av melanom B16-F10-celler in vitro og in vivo (24). Imidlertid begrenser den dårlige vannløseligheten til CTPG tidligere brukt medikamentutviklingen (24). Derfor ble vannløselig CTPG (CTPG-W) brukt og antitumoreffekten på spiserørskreftceller (Eca-109) ble undersøkt. Det ble bestemt at CTPG-W doseavhengig kunne hemme levedyktigheten til Eca-109-celler gjennom induksjon av apoptose via en mitokondrieavhengig vei.
Materialer og metoder Dyr.
C57BL/6 hunnmus (6-8 uker, ~25 g) ble kjøpt fra Beijing Laboratory Animal Research Center (Beijing, Kina) og holdt i temperaturkontrollert (25˚C), lyssykkel (12/ 12) Dyreanlegg ved Xinjiang University (Urumqi, Kina). Alle dyrene fikk patogenfritt vann og mat.
Cellelinje og kultur. Den humane esophageal carcinoma cellelinjen (Eca-109) ble bevart av Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Kina) og dyrket i RPMI{{1} } medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) supplert med 10 prosent varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kina), 1 prosent L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin ved 37˚C i en fuktet atmosfære som inneholder 5 prosent CO2.
Høyytelses væskekromatografi (HPLC). CTPG-W (kat.nr. SGJG20170410) ble kjøpt fra Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Hovedforbindelsene av CTPG ble kvalifisert og kvantifisert ved HPLC i henhold til vår tidligere studie (24). Kort fortalt ble HPLC utført på en ZORBAX SB-C18-søyle (250x4,6 mm; 5 µm) ved 30˚C og eluert med 0,2 prosent maursyreløsning og en gradient av metanol som startet ved 23 prosent, da 1 ml ble tilsatt hvert minutt i 45 minutter til du når 31 prosent. Totalt 10 ul prøve ble injisert og detektert ved 330 nm. Echinakosidstandarden ble kjøpt fra Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Kina), og acteosidstandarden ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Standardene ble brukt til å analysere komponentene i CTPG-W.
MTT-analyse. Celleproliferasjon ble målt med en MTT-analyse. Eca{0}}-celler ble inokulert i 96-brønnplater med en tetthet på 5x103 celler i 100 µl RPMI{{5 }} medium/brønn og dyrket ved 37˚C i 24 timer, deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) CTPG-W eller 0,4 prosent dimetylsulfoksid (DMSO) i 24, 48 og 72 timer. DMSO ble brukt som løsningsmiddelkontroll (800 ug/ml CTPG-W inneholdende 0,4 prosent DMSO). Cisplatin (20 µg/ml) ble brukt som positiv kontroll. Deretter ble supernatanten kastet etter sentrifugering ved 225 xg i 5 minutter ved romtemperatur, og 100 µl MTT-løsning (0,5 mg/ml i RPMI-1640-medium uten FBS) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37˚C i 3 timer. De dannede formazankrystallene ble oppløst i 200 ul DMSO. Verdiene for optisk tetthet (OD) ble målt ved en bølgelengde på 490 nm av en 96-brønnmikroplateleser (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Den relative cellelevedyktigheten ble beregnet i henhold til formelen: Cellelevedyktighet (prosent )=(ODbehandlet/ODubehandlet)x100 prosent. Morfologien til Eca‑109-celler ble observert med et invertert fluorescensmikroskop (forstørrelse, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokyo, Japan).
For proliferasjon av splenocytter ble C57BL/6-mus avlivet ved cervikal dislokasjon, og milter ble isolert. Enkeltcellesuspensjonen ble laget og splenocytter ble sådd inn i 96-brønnplater med en tetthet på 1x105 celler/brønn i 100 µl RPMI-1640-medium, og deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (0, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) CTPG-W i 24, 48 og 72 timer ved 37˚C med 5 prosent CO2. Proliferasjonen av splenocytter ble målt ved MTT-analyse, i henhold til den ovennevnte protokollen. Stimulerende indeks=ODbehandlet/ODubehandlet.
Måling av apoptose og cellesyklus. Eca{{0}}-celler ble dyrket i 60 mm skåler med en tetthet på 2,5x105 celler/skål i 24 timer og behandlet med forskjellige konsentrasjoner ({{31} }, 200, 400, 600 og 800 µg/ml) CTPG-W eller 0,4 prosent DMSO i 24 timer ved 37˚C med 5 prosent CO2. Celler ble samlet og farget med et Annexin V-fluorescein isothiocyanat (FITC)/Propidium iodide (PI) apoptosedeteksjonssett (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Kina), i henhold til produsentens protokoller. Prøver ble samlet ved flowcytometri (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og analysert med FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). For å analysere effekten av CTPG-W på cellesyklusen ble 2,5x105 Eca-109-celler sådd i 60 mm kulturskåler og behandlet med CTPG-W (0, 100, 200 og 400 µg/ml) eller 0,4 prosent DMSO i 24 timer ved 37˚C med 5 prosent CO2. Alle cellene ble høstet og vasket to ganger med iskald PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), deretter fiksert i 70 prosent iskald etanol ved 4˚C i 30 minutter. Etter vask to ganger med iskald PBS, ble cellene resuspendert i 300 µl PI/RNase-fargebuffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) i 10 minutter ved romtemperatur. Cellesyklusfordelingen ble analysert med ModFit LT 3.0-programvaren ved flowcytometri (BD FACSCalibur).
Analyse av mitokondriell membranpotensial (Δψm) og reaktive oksygenarter (ROS). For å analysere Δψm ble Eca{{0}}-celler behandlet med CTPG-W (0, 400, 600 og 800 µg/ml) eller 0,4 prosent DMSO for 24 time ved 37˚C med 5 prosent CO2, og farget med mitokondriemembranpotensialanalysesettet med JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina), i henhold til produsentens protokoll, i 20 minutter ved 37˚C . Etter vask to ganger med JC-1 vaskebuffer (Beyotime Institute of Biotechnology), ble prøvene resuspendert med 300 µl JC-1 vaskebuffer og analysert med flowcytometri (BD FACSCalibur). Fluorescensen til JC-1-fargestoff i Eca-109-celler ble også observert med et invertert fluorescensmikroskop (forstørrelse, x200; Nikon Eclipse Ti-E). For analyse av ROS ble Eca-109-celler behandlet med CTPG-W (0, 400, 600 og 800 µg/ml) i 2, 4, 6, 12 og 24 timer, og farget med reaktive oksygenarter Analysesett (Beyotime Institute of Biotechnology), i henhold til produsentens protokoll, i 20 minutter ved 37˚C. Etter vask tre ganger med iskald PBS, ble prøver samlet ved flowcytometri (BD FACSCalibur) og analysert med FlowJo 7.6-programvare.
2,2‑difenyl‑1‑picrylhydrazyl (DPPH) radikalfjernende aktivitet. Den frie radikalfjernende aktiviteten til CTPG-W ble bestemt med en DPPH-friradikalanalyse i henhold til den publiserte protokollen med en mindre modifikasjon, da metanol ble erstattet med etanol for å løse opp DPPH (25,26). For steady-state målinger ble 150 µl DPPH (100 mmol/l) i etanol blandet med forskjellige konsentrasjoner av CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 og 600 µg/ml) i 50 µl PBS, og inkubert i mørke i 30 minutter ved romtemperatur. Absorbansen ved 517 nm ble påvist i nærvær og fravær av CTPG-W. Totalt 50 ul vitamin C ble brukt som positiv kontroll. DPPH-radikalfjerningsaktiviteten ble beregnet ved å bruke formelen: Skylling (prosent )=[1-(A prøve-Ablank)/A0] x100, der Ablank er absorbansen til kontrollen (uten DPPH), En prøve er absorbansen til prøven og A0 er absorbansen til PBS med DPPH.
Western blot-analyse. Eca{{0}}-celler ble behandlet med CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) eller 0,4 prosent DMSO i 24 timer ved 37˚C med 5 prosent CO2. Følgende vask to ganger med PBS, cellene ble lysert i radioimmunutfellingsanalyse-lysisbuffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Beijing, Kina) i 20 minutter på is. Etter sentrifugering ved 10,000 xg i 10 minutter ved 4˚C, ble supernatantene samlet, og proteinkonsentrasjoner ble påvist med et bicinchoninsyresett (Thermo Fisher Scientific, Inc.) i henhold til produsentens protokoller. Western blot-analyse ble utført i henhold til vår tidligere beskrivelse (24). Antistoffene mot caspase-7 (kat.nr. D120077), caspase-8 (kat.nr. D155240), caspase-9 (kat.nr. D220078), B-celle lymfom{ {24}} (Bcl-2)-assosiert X (Bax) (kat.nr. D220073) og Bcl-2 (kat.nr. D260117), og anti-muse-IgG-pepperrotperoksidase (HRP) ) (kat.nr. D111050) og anti-kanin IgG-HRP (kat.nr. D110058) ble kjøpt fra BBI Life Sciences (Shanghai, Kina). Antistoffene mot caspase-3 (kat.nr. E-AB-10050) og aktiv caspase-3 (kat.nr. E-AB-22115) ble kjøpt fra Elabscience ( Wuhan, Kina). Andre antistoffer mot caspase-7 (kat. nr. 9492), poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (kat. nr. 9542), cytokrom c (kat. nr. AC909), c-Jun NH{ {48}}terminal kinase (JNK) (kat. nr. 9252S) og -aktin (kat. nr. 58169) ble oppnådd fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Alle primære og sekundære antistoffer ble fortynnet 1:1,000. De primære antistoffene ble inkubert ved 4˚C over natten og de sekundære antistoffene ble inkubert ved 37˚C i 1 time.
Målproteinene ble påvist ved bruk av et forbedret kjemiluminescensanalysesett (Beyotime Institute of Biotechnology), i henhold til produsentens protokoll.
Statistisk analyse. Statistisk signifikans ble beregnet ved enveis variansanalyse med Tukeys post hoc-test, og resultatene ble analysert med GraphPad Prism 5.0-programvare (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) blant behandlings- og kontrollgruppene. Alle data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche tubulosa fenylethanoid glykosider(CTPG)
Resultater
CTPG-W undertrykker veksten av Eca-109-celler. Komponentene til CTPG-W ble kvalifisert og kvantifisert ved HPLC (fig. 1), som ble sammenlignet med standardene for echinacoside og acteosid. I henhold til toppretensjonstidene og topparealene inneholdt CTPG-W 39,16 prosent echinacosid og 2,44 prosent acteosid. For det første ble effekten av CTPG-W på levedyktigheten til Eca-109-celler bestemt med en MTT-analyse. CTPG-W ble oppløst i DMSO ved 200 mg/ml og fortynnet med RPMI-1640-medium inneholdende 10 prosent varmeinaktivert FBS til angitte konsentrasjoner. Eca-109-celler ble behandlet med CTPG-W og cellelevedyktighet ble analysert med en MTT-analyse på de angitte tidspunktene. CTPG-W-behandling reduserte levedyktigheten til Eca-109-celler betydelig på en dose- og tidsavhengig måte (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG-W induserer apoptose i Eca-109-celler. For å undersøke om CTPG-W undertrykte veksten av Eca-109-celler gjennom induksjon av apoptose eller nekrose, ble celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CTPG-W. Etter 24 timer ble apoptosen og nekrosen av Eca-109-celler påvist med Annexin V/PI-farging. Som vist i fig. 3A ble Annexin V-/PI pluss-celler lukket som nekrotiske celler, og Annexin V pluss/PI pluss og Annexin V pluss/PI-celler ble lukket som apoptotiske celler. CTPG-W induserte først og fremst apoptose av Eca-109-celler på en doseavhengig måte, selv om de nekrotiske Eca-109-cellene også økte betydelig under behandling med 600 og 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG-W induserer cellesyklusstans i S-fasen i Eca-109-celler. Forstyrrelse av kreftcellesyklusen vil undertrykke cellevekst og fremme apoptose (27). Fordelingen av cellesyklusen i Eca-109-celler ble påvist med PI-farging etter CTPG-W-behandling i 24 timer. Det ble observert at celler i S-fasen økte og celler i G0/G1-fasene indikerte en generell signifikant reduksjon ved CTPG-W-behandling (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG-W reduserer Δψm og induserer frigjøring av cytokrom c. Apoptose kan induseres av en mitokondrieavhengig vei (28,29). De pro- og anti-apoptotiske medlemmene av BCL-2-proteinfamilien har viktige roller i reguleringen av mitokondriell membranintegritet (30,31). Etter CTPG-W-behandling i 24 timer, ble Δψm vurdert ved bruk av JC-1-farging. JC‑1-aggregat (rød fluorescens oppdaget i FL‑2) vil desintegreres til monomer (grønn fluorescens oppdaget i FL-1) når Δψm reduseres (32). Som vist i fig. 5A, økte frekvensene til FL-1 pluss FL-2-/pluss-celler betydelig på en doseavhengig måte, noe som indikerer at Δψm til Eca-109-celler ble redusert. Fluorescensendringene i Eca-109-celler ble også observert med et invertert fluorescensmikroskop (fig. 5B). Med de økende konsentrasjonene av CTPG-W avtok den røde fluorescensen og den grønne fluorescensen økte, noe som stemmer overens med dataene fra flowcytometri. Det ble også observert at nivået av cytokrom c i cytosolen ble betydelig økt (fig. 5C), som er et resultat av en reduksjon av Δψm. Dette forsterker konklusjonen fra det økte antallet FL-1 pluss FL-2-/pluss celler om at Δψm ble redusert som et resultat av CTPG-W-behandling. Det er rapportert at JNK kan regulere aktiveringen av BCL-2-proteinfamilien som forårsaker frigjøring av cytokrom c (33-35). Det ble også bestemt at nivået av JNK var spesielt oppregulert etter CTPG-W-behandling (fig. 5C). Resultatene indikerte at CTPG-W kan indusere apoptose av Eca-109-celler gjennom en mitokondrieavhengig vei.
Effekten av CTPG-W på intracellulær ROS-generering. ROS kunne redusere Δψm for å indusere apoptose (36). For å undersøke om CTPG-W kan øke ROS-produksjonen, ble Eca-109-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av CTPG-W. Celler ble samlet på de angitte tidspunktene og farget med DCFH-DA. Produksjonen av intracellulær ROS i Eca-109-celler ble bestemt ved flowcytometri. Som vist i fig. 6A, økte 800 µg/ml CTPG-W signifikant ROS-produksjonen fra 2-6t og reduserte fra 12-24t. I tillegg økte 400 µg/ml CTPG-W ROS-produksjonen betydelig fra 12-24 timer. Videre endret ikke 200 µg/ml CTPG-W ROS-produksjonen nevneverdig. De dynamiske endringene i ROS-produksjon kan være assosiert med Eca-109-celleapoptose. Det ble også bestemt at CTPG-W hadde frie radikaler-fjernende aktivitet (fig. 6B), som kan være assosiert med den reduserte ROS-produksjonen i Eca-109-celler behandlet med 800 µg/ml CTPG-W etter 12 timer.
CTPG-W oppregulerer aktiviteten til caspase-3, caspase-7, caspase-9 og PARP. Frigjøring av cytokrom c på grunn av Δψm-reduksjon kan aktivere kaspaseproteasene for å indusere apoptose (29,30,37). Etter CTPG-W-behandling i 24 timer ble aktiveringen av caspase-3, 7, 8, 9 og PARP påvist ved western blot-analyse. Sammenlignet med kontrollen, nivåene av spaltet-kaspase-9, spaltet-kaspase-7, spaltet-kaspase-3 og spaltet-PARP, men ikke nivåene av spaltet-kaspase{{ 20}}, ble oppregulert ved CTPG-behandling på en doseavhengig måte (fig. 7). Disse resultatene indikerte at CTPG-W reduserte Δψm og fremmet cytokrom c-frigjøring for å aktivere caspaser som induserer apoptose av Eca-109-celler.
Cistanche tubulosa ekstrakt
Diskusjon
Tradisjonell CHM kan indusere apoptose av esophageal cancerceller gjennom forskjellige veier, inkludert den ekstrinsiske dødsreseptoren, indre mitokondrielle og endoplasmatiske retikulumstressbaner (29). Vår forrige studie viste at CTPG, som hovedkomponenten i C. tubulosa, hemmet veksten av melanom B16-F10-celler gjennom induksjon av apoptose via en mitokondrieavhengig vei (24). I denne studien ble antitumoreffekten av CTPG-W på Eca-109-celler undersøkt, og det ble bestemt at CTPG-W undertrykte veksten av Eca-109-celler, induserte apoptose og cellesyklusstans, redusert Δψm, økt frigjøring av cytokrom c og aktiverte kaspaser. CTPG og CTPG-W kan indusere apoptose og cellesyklusstans i kreftceller. Imidlertid er de nøyaktige mekanismene forskjellige på grunn av de forskjellige komponentene i CTPG (26,64 prosent echinacosid, 10,19 prosent acteosid og 1,71 prosent isoacteosid) og CTPG-W (39,16 prosent echinacosid og 2,44 prosent acteosid). CTPG arresterte B16-F10-celler i G0/G1-fasene, men CTPG-W arresterte Eca-109-celler i S-fasen (24). ROS-produksjonen ble doseavhengig økt av CTPG, men det indikerte en endring på en tidsavhengig måte ved en høy dose CTPG-W, som økte betydelig i begynnelsen av CTPG-W-behandlingen (2-6 timer) og redusert betydelig etter 12 timer, sammenlignet med kontrollen. En mulig årsak er at hovedkomponenten i CTPG-W er echinacoside. En rekke studier rapporterte at echinakosid kunne hemme ROS-produksjon og ROS-indusert apoptose for å utøve sin nevrobeskyttende og antialdringseffekt (38-40). Tilsvarende ble den frie radikalrensende aktiviteten observert i denne studien. Derfor ble det spekulert i at noen komponenter, inkludert verbascoside, iso-verbascoside og salidroside i en høy dose CTPG-W umiddelbart kan indusere ROS-generering til å forårsake apoptose av Eca-109-celler (41,42), og deretter ROS ble fanget av echinacoside. En annen mulig årsak til forskjellene i ROS-produksjon ved CTPG og CTPG-W er at forskjellige cellelinjer ble brukt i denne studien og en tidligere studie (24). Dong et al (43) rapporterte at echinacoside kunne indusere apoptose av humane SW480 kolorektale kreftceller gjennom generering av oksidative DNA-skader uten økte ROS-nivåer.
CTPG-W-behandling reduserte Δψm og forårsaket frigjøring av cytokrom c, som fremmer spaltningen av caspase-9 (28). Konsekvent ble nivåene av spaltet-kaspase-9 oppregulert ved CTPG-W-behandling. Deretter kan den aktive kaspasen-9 aktivere kaspasen-3 for å indusere apoptose (44). Nivåene av spaltet-kaspase-3 ble også oppregulert ved CTPG-W-behandling. Caspase-8 ble imidlertid ikke aktivert av CTPG-W, noe som indikerer at den ekstrinsiske dødsreseptorveien ikke var involvert i apoptosen indusert av CTPG-W. Disse observasjonene indikerer at CTPG-W induserer apoptose av Eca-109-celler gjennom aktivering av en mitokondrieavhengig vei.
PARP har viktige roller i genomisk stabilitet og kan spaltes av de aktive kaspasene, spesielt kaspasene-3 og -7 (45). Det ble bestemt at CTPG-W-behandling aktiverte caspase-3 og -7, som kan spalte PARP for å hemme DNA-reparasjon og forårsake apoptose.
CTPG-W undertrykker også dose- og tidsavhengig veksten av humane hepatocellulære karsinom BEL-7404-celler (upubliserte data). Selv om CTPG-W hemmer veksten av Eca-109- og BEL-7404-celler, fremmer det splenocytter, noe som kan skyldes innholdet av polysakkarider (~50 prosent) i CTPG-W (46) ). På samme måte har en rekke studier rapportert at polysakkarider kan fremme splenocytter (46-49). I musemodellen ble det bestemt at CTPG-W økte miltindeksen signifikant sammenlignet med kontrollgruppen, men ikke påvirket kroppsvekten og de andre organindeksene inkludert hjerte, lever, nyre og lunge (upubliserte data). som indikerer at CTPG-W ikke har noen cytotoksisk effekt på normale celler.
Samlet indikerte dataene at CTPG-W hemmer veksten av Eca-109-celler ved induksjon av apoptose via en mitokondrieavhengig vei.
cistanche fordeler: anti-apoptose
Anerkjennelser
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Jianhua Yang (Baylor College of Medicine) for polering av manuskriptet.
Finansiering
Denne studien ble støttet av den 13. femårsplanen for Key Discipline Biology Bidding Project (stipend nr. 17SDKD0202), Xinjiang Normal University og Key Laboratory of Special Environment Biodiversity Application and Regulation i Xinjiang (stipend nr. XJTSWZ-2017-04) til JL og Chinese National Natural Science Foundation Grant (tilskudd nr. 31760260) til XW.
Tilgjengelighet av data og materialer
Data og materialer brukt og analysert under denne studien er tilgjengelig fra den tilsvarende forfatteren på rimelig forespørsel.
Forfatteres bidrag
CF, AA, YY og QC utførte eksperimentene. LX, JLv og XW analyserte dataene og de utarbeidede figurene. JinyuL og JinyaoL designet prosjektet og skrev manuskriptet.
Etikkgodkjenning og samtykke til å delta
Alle dyreforsøk ble godkjent av komiteen for etikk av dyreforsøk ved Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (godkjenning, nr. BRGE-AE001; Xinjiang University).
Pasientens samtykke til publisering
Ikke aktuelt.
Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Referanser
Wu CR, Lin HC og Su MH: Reversering av vandigekstrakter av Cistanche tubulosafra atferdsmessige mangler i Alzheimers sykdomslignende rottemodell: Relevans for amyloidavsetning og sentral nevrotransmitterfunksjon. BMC-komplement Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J og Zhang F:Fenyletanoidglykosider fra Cistanche tubulosahemmer veksten av B16-F10-celler både in vitro og in vivo ved induksjon av apoptose via mitokondrieavhengig bane. J Cancer 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME og Berset C: Bruk av en fri radikalmetode for å evaluere antioksidantaktivitet. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.