Kombinasjon av adoptiv NK-celleinfusjon med et dopaminfrigjørende peptid reduserer aldrende celler i gamle mus
Jun 17, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
INTRODUKSJON
Aldring er en av de viktigste risikofaktorene for mange sykdommer [1], og utvikling av metoder for å intervenere i aldring vil redusere risikoen for en rekke aldersrelaterte sykdommer som hjerte- og karsykdommer [2, 3], kreft betraktelig. [4], og Alzheimers sykdom [5]. Senescent celler (SNCs) akkumuleres gradvis i vev under aldringsprosessen og regnes som hovedårsaken til aldersrelaterte sykdommer [6-8]. Fjerning av SNC-er i musemodeller har vist seg å forhindre eller forsinke vevsdysfunksjon og forlenge sunn levetid [9, 10]. I motsetning til dette forårsaker transplantasjon av små mengder SNC-er fysiologisk dysfunksjon hos unge mus [1]. Disse studiene har åpnet dører for utvikling av metoder som retter seg mot fjerning av SNCs for å lindre aldersrelaterte kroniske sykdommer.
Målretting av klarering av SNC, kalt "senolytika" var den første kjemoterapien som ble testet med suksess i en preklinisk in vivo-modell, og flere senolytiske midler eksisterer for tiden [12]. Mange av disse stoffene retter seg mot oppregulerte anti-apoptotiske veier i SNCs for selektivt å fjerne visse typer SNCs og har vist potensialet til å forlenge levetiden og forbedre kroppsfunksjoner [13, 14].Cistanche Extract Anti RadiationTil tross for den vellykkede reverseringen av aldersrelatert patologi i dyremodeller, kan det være noen hindringer for å bruke senolytiske legemidler hos mennesker på grunn av heterogeniteten til SNC og den høye risikoen for toksisitet [15]. Derfor bør en alternativ metode som trygt kan eliminere et bredt spekter av SNCs hos mennesker utforskes.
SNP-er kan gjenkjennes og fjernes av immunsystemet [16]. Tidligere studier har vist at SNC-er aktiverer naturlige dreperceller (NK) ved å oppregulere den store histokompatibilitetsklasse I-kjederelaterte protein A- og B-aktiverende liganden [17]. Men med økende alder reduseres effektiviteten til immunsystemet, noe som kan føre til immunflukt fra SNCs [18]. Metoder for å overvinne immunflukt forårsaket av nedsatt immunfunksjon har blitt utforsket i kreftterapi [19]. Nylige fremskritt har blitt gjort i adoptiv overføring av NK-celler for å eliminere svulster, noe som har vist en viss effekt [20]; dermed var det rimelig å anta at adoptiv infusjon av NK-celler kan produsere cytotoksisitet i SNCs.
Nervesystemet og immunsystemet er de to viktigste adaptive systemene i kroppen. Flere studier har vist at dopamin (DA) som immunregulator er en nøkkel til nevroimmun kommunikasjon [21]. DA utfører sine biologiske funksjoner ved interaksjon med og aktivering av dopaminreseptorer (DR), som er delt inn i 2 undergrupper, D1-lignende (D1 og D5), og D2-lignende (D2, D3, og D4). Når det gjelder deres forskjellige funksjoner, stimulerer engasjementet til D1-som DR cAMP-produksjon, mens engasjementet til D2-som DR hemmer cAMP-produksjonen [22]. Tidligere studier har vist at D1-lignende DR-stimulering øker cytotoksisiteten til NK-celler både in vitro [23] og in vivo [24]. Imidlertid synker DA-nivåer når menneskets alder øker [25]. Dermed antok vi at dopaminerge medikamenter kunne forbedre cytotoksisiteten til den adoptive infusjonen av NK-celler.
Cistanche kan anti-aldring
Her foreslår vi bruk av nonapeptidet Acein, som interagerte med et angiotensin-konverterende enzym (ACE I) for å indusere DA-sekresjon [26], i kombinasjon med systemisk NK-celleterapi for å eliminere SNCs. In vitro-resultater viste at NK-celler fjernet SNC-er, uavhengig av senescens-induktorer og celletyper.cistanche herbaI en aldrende musemodell reduserte NK-celleterapi i kombinasjon med Acein signifikant antall senescensassosierte -galaktosidase (SA- -gal)-positive celler i flere vev, reduserte ekspresjonen av senescensassosierte gener i hovedorganer og lindret senescensassosierte sekretoriske fenotyper (SSPs). Resultatene av denne studien gir innsikt i mulig gjenoppretting av immunovervåkingen av kroniske SNCs ved bruk av NK-celleterapi i kombinasjon med Ace.
RESULTATER
Adoptiv infusjon av NK-celler reduserer senescent CD3 pluss T-celler i perifert blod
26 frivillige som fikk NK-celleinfusjon ble rekruttert til studien. Karakteristikkene og NK-celleegenskapene til de frivillige er presentert i tabell 1. Tidsintervallet for blodgjenvinning etter NK-celletransfusjon var omtrent 37(25-57) dager. Andelen (Fig.1A) og absolutt antall (Fig.1B) av NK-celler i det perifere blodet var omvendt relatert til alderen til de frivillige. Overraskende nok var renheten til NK-celleproduktet reinfundert i hvert individ også omvendt korrelert med alderen til de frivillige (fig.1C).cistanche penisvekstDette kan skyldes gradvis redusert antall NK-celler med økende alder. For å reflektere antialdringseffekten av NK-celleadministrasjon, ble flere senescentmarkører i CD3 pluss T-celler i perifert blod, som i stor grad gjenspeiler den aldersrelaterte fenotypen til kroppen [27], oppdaget før og etter NK-celleinfusjon. Sammenlignet med senescensmarkørene og SASP-faktoren til CD3 pluss T-celler i perifert blod før og etter autolog NK-celleinfusjon, ble andelen SA- -gal-positive T-celler signifikant redusert etter infusjon (fig.1D). mRNA-nivåene av P16, P21 og plasminogenaktivatorhemmer 1(Pai1) ble betydelig redusert, mens endringene i mRNA-nivåer av monocyttkjemoattraktant protein-1 (MCP-1) og IL-6 var ikke signifikante (fig. 1E). Det var ingen signifikant forskjell i de biokjemiske indeksene (tilleggstabell 1) i det perifere blodet.
Humane NK-celler reduserer fettvevs alderdomsmarkører og sekresjon av proinflammatoriske cytokiner
Fettvev ble samlet inn fra tre overvektige individer, da fedme har en tendens til å forårsake en opphopning av SNCs [28]. I tillegg ble fettvevet dyrket i et kondisjonert medium fra SNCs for ytterligere å indusere fettvevsenescens. Fettvev dyrket i et kondisjonert medium fra ikke-SNC-er ble ansett som kontrollen. Perforin (Fig.2A) og CD69 (Fig.2B)ekspresjon i NK-celler var signifikant oppregulert etter ko-inkubasjon med senescent fettvev sammenlignet med ko-inkubasjon med kontroll fettvev. Uttrykket av senescent markører p16 og p21 in
senescent fettvev ble signifikant redusert etter NK-cellebehandling (Fig.2C, Supplerende Fig.1A, B). Vi fant også at nøkkelkomponenten til SASP i det kondisjonerte mediet etter co-inkubasjon med NK-celler i den senescent gruppen ble betydelig redusert (fig. 2D). Disse resultatene antydet at NK-celler kunne eliminere SNC-er fra fettvev og redusere SASP-fenotypen.
Mus-NK-celler kan aktiveres mot SNC-er og utøve cytotoksisitet
Vi induserte først senescens av musefettprogenitorceller ved bestråling eller Adriamycin som tidligere beskrevet [29]. For å bestemme om NK-celler ble spesifikt aktivert av SNC-er, ble ikke-bestrålte kontrollceller eller bestrålte SNC-er co-inkubert med NK-celler i 24 timer. Flowcytometri viste at ekspresjonsnivåene av CD69 (Fig.3A) og IFN-y(Fig.3B) i NK-celler var signifikant oppregulert i SNC-målceller sammenlignet med kontrollmålceller. I mellomtiden, etter saminkubasjon med NK-celler, var det apoptotiske nivået av SNC-er betydelig høyere enn for kontrollceller (fig.3C). Deretter oppdaget vi uttrykket av NK-celleaktiverende og hemmende ligander i SNC-ene. qPCR-resultatene viste at ekspresjonsnivået til aktiverende ligander i NK-celler var betydelig oppregulert sammenlignet med kontrollceller, og ekspresjonsnivået til noen hemmende ligander, slik som beta 2 mikroglobulin (2m), ble nedregulert sammenlignet med kontrollceller (fig. .3D). Vi har også undersøkt evnen til NK-celler til å eliminere SNC-er in vivo.cistanche salsa fordelerDiR-merkede kontrollceller og DiR-merkede SNC-er ble transplantert inn i bukhulen til mus, og NK-celler ble administrert gjennom halevenen. In vivo-avbildningsresultater viste at fluorescensintensiteten i mus transplantert med SNC-er etter NK-cellebehandling var betydelig svakere enn hos mus transplantert med kontrollceller (fig. 3E). Dette indikerte at evnen til NK-celler til å drepe SNC-er var betydelig høyere enn SNC-er in vivo. Deretter bestemte vi om cytotoksisiteten til NK-celler mot SNC-er var doseavhengig og cellespesifikk. Samtidig brukte vi også doxorubicin-indusert senescens for å bestemme om cytotoksisiteten til NK-celler mot SNC-er var begrenset til strålingsinduksjon. Resultatene viste at NK-celler hadde betydelig cytotoksisk aktivitet mot SNC på en doseavhengig måte, men liten cytotoksisitet mot kontrollceller. Ulike senescensstimuleringsmetoder hadde ingen effekt på evnen til NK-celler til å drepe SNC (fig.3F). Disse resultatene antydet at NK-celler kunne aktiveres spesifikt av SNC-er og produsere betydelig cytotoksisitet mot SNC-er in vitro og in vivo.
DA øker cytotoksisiteten til muse-NK-celler mot SNC-er gjennom D1-lignende reseptorer
I lys av den viktige nevroimmune kommunikasjonsfunksjonen til DA [30], vurderte vi om DA kunne forbedre cytotoksisiteten til muse-NK-celler mot SNC-er. NK-celler ble co-inkubert med strålingsinduserte SNC-er, og forskjellige konsentrasjoner av DA ble tilsatt til mediet. Resultatene viste at DA kunne øke cytotoksisiteten til NK-celler mot SNC-er (fig. 4A, B). For å karakterisere signalveien som DA forbedret den drepende effekten av NK-celler på SNC-er, ble endringene i DR-ekspresjon, cAMP-innhold og cAMP-responselementbindende protein (CREB) fosforylering i NK-celler evaluert. I NK-celler co-inkubert med SNCs sammen med DA, var innholdet av cAMP (Fig. 4C) og fosforyleringsnivået til CREB (Fig.4D, Supplerende Fig. 2A) betydelig økt sammenlignet med NK-celler og SNC-koinkubasjon uten DA. For å avklare hvorfor DA forbedrer drapsaktiviteten til NK-celler mot SNC-er, sammenlignet vi endringene av DR på NK-celler etter at NK-celler ble co-inkubert med SNC-er eller kontrollceller. Resultatene viste at D1- og D5-DR-ekspresjonsnivået ble betydelig oppregulert etter at NK-celler ble co-inkubert med SNC-er sammenlignet med kontrollceller (Fig.4E). Deretter liker DA og D1-reseptorantagonister eller D2-liker
reseptorantagonister ble lagt sammen i ko-inkubasjonssystemet til NK-celler og SNC-er. Sammenlignet med tilsetning av DA alene, ble apoptosenivået til SNC redusert ved tilsetning av DA pluss SCH-23300(D1-lignende reseptorantagonist)(fig.4F, G). I mellomtiden ble cAMP-innholdet (fig.4H) og fosforyleringsnivået til CREB (fig.4l, tilleggsfig. 2B) i NK-celler nedregulert. Tilsetningen av DA pluss haloperidol (D2-reseptorantagonist) endret derimot ikke apoptosenivået til SNCs, cAMP-innholdet og CREB-fosforyleringen i NK-celler, sammenlignet med tilsetningen av DA alene. Disse resultatene viste at DA forsterket den drepende aktiviteten til muse-NK-celler mot SNC-er gjennom D1-som Drs.
Ess kombinert med muse-NK-celler forbedrer klaringen av SNC-er betydelig in vivo
En tidligere studie har vist at dopamin avtar med alderen hos mennesker [22]. Vi målte først det perifere dopaminnivået hos unge og gamle mus. Resultatene indikerte at plasmadopaminnivåene til de gamle musene var lavere enn hos de unge musene (fig. 5A). Deretter ble perifer dopaminfrigjøring etter intraperitoneal injeksjon av Acein utforsket i gamle mus. Vi fant at plasmadopaminnivået økte betydelig etter en 10 mg/kg Acein-injeksjon (Fig.5B, Supplerende Fig.3). I lys av dette utførte vi muse-NK-celler kombinert med Acein for å behandle gamle mus. Vi oppdaget statusen til NK-celler i det perifere blodet til mus etter behandling og fant at antallet NK-celler i det perifere blodet for infusjon av NK-celler alene eller NK-celler kombinert med Acein var betydelig høyere enn for den Ace-behandlede gruppen og PBS-gruppen, mens antallet NK-celler ikke var signifikant forskjellig mellom den NK-cellebehandlede gruppen og NK-cellene kombinert med den Acein-behandlede gruppen (fig. 5C, D).cistanche tubulosa dosering redditYtterligere påvisning av aktiveringsnivået til NK-celler viste at ekspresjonsnivået av CD69 i NK-celler i perifert blod i den kombinerte behandlede gruppen var signifikant oppregulert sammenlignet med gruppen behandlet med NK-celler (Fig.5E). Deretter evaluerte vi SNC-ene i vevet. Vi fant at infusjon av NK-celler alene reduserte ekspresjonen av noen senescentmarkører sammenlignet med PBS-gruppen og Acein-behandlet gruppe, mens infusjon av NK-celler kombinert med Acein reduserte de SA- -gal-positive cellene signifikant (fig. 5F ) så vel som ekspresjonsnivåene av P16 og P21 (Fig. 5G, Supplerende Fig. 4A, B) i fettvevet, sammenlignet med behandlingen av NK-celler alene. Antall Ki67BrdUceller i fettvevet ble også betydelig økt (fig. 5H), noe som ytterligere beviser at innholdet av SNC i fettvevet var lavere i den kombinerte behandlede gruppen. SA- -galfarging av lever-, lunge-, nyre- og fettseksjoner viste også det laveste nivået av SNC i den kombinerte behandlede gruppen (Supplerende Fig. 5A-D). Disse resultatene viste at NK-celler kombinert med Acein-terapi økte aktiveringsnivået til NK-celler i mus, og forårsaket betydelig eliminering av SNC-er in vivo.
Ess kombinert med NK-celler reduserer aldersrelaterte fenotyper hos gamle mus
For ytterligere å bekrefte aldersrelaterte fenotyper i mus, ble lever-, lunge-, nyre-, fett- og øyevev samlet inn for å oppdage en rekke senescerende markører inkludert P16, P21 og SASP-faktorer. Disse prøvene ble valgt fordi disse vevene er mer sannsynlig å gjennomgå senescens med alderen [31]. I hvert vev, etter NK-celleinfusjon alene, var mRNA-nivåene av P16-, P21- og SASP-faktorer signifikant lavere enn de i kontrollgruppen, mens nivåene av alderdomsmarkører i lever-, fett- og evevevet i de kombinerte behandlede gruppen ble ytterligere redusert sammenlignet med gruppen behandlet med NK-celleinfusjon alene (fig. 6A). Tilsvarende har vi også påvist hoved-SASP-faktoren i serumet til mus, og resultatene stemte overens med resultatene i vev (fig.6B). I tillegg har vi også undersøkt NAD-nivåer i lever og fettvev, som er knyttet til aldring [32]. Vi fant at infusjon av NK-celler alene eller i kombinasjonsterapi økte innholdet av NAD i lever og fettvev signifikant, og forbedringsnivået var betydelig høyere i den kombinerte terapigruppen (Fig. 6C). Noen biokjemiske serumindekser inkludert ALT, AST, CREA, UA, CHOL og BUN er assosiert med aldringsnivåer [33]. Vi har funnet at bare UA ble signifikant redusert i serumet til mus i den kombinasjonsbehandlede gruppen, mens de andre biokjemiske nøkkelindeksene ikke gjorde det.
MATERIALE OG METODER Infusjon av humane NK-celler
Autolog NK-celleinfusjon ble utført av Shanghai Mengchao Cancer Hospital (Shanghai, Kina), og alle protokoller ble godkjent av deres etiske komité (nr. 05,2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital). Alle frivillige ga signert informert samtykke til å skaffe perifert blod. Kort fortalt ble 50 ml perifert blod ekstrahert fra hvert individ, hvoretter mononukleære celler fra perifert blod (PBMCs) ble isolert og overført til en T75-kolbe med ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA) som inneholdt 1×Cloudz CD2/NKp46 , Rekombinant Human IL-2(27ng/mL), rekombinant Human L-12 (10 ng/ml), rekombinant Human IL-18 (10 ng/ml, og rekombinant Human L{{ 13}}(10 ng/mL)(R&D Systems, USA) i 48 timer, og deretter erstattet med aktivert medium (270 ng/mL rekombinant humant IL-2, 20 ng/ml rekombinant humant IL-12 , 20 ng/ml rekombinant humant IL-18 og 20 ng/ml rekombinant humant IL-21) for videre kultur. Celletettheten ble opprettholdt på 1×10 grader celler/ml. På dag 28 av kulturen , ble et lite antall autologe NK-celler samlet for kvalitetskontroll og intravenøst reinjisert sammen med autologe NK-celler med en tetthet på 4,15×10 grader (3.76-5.87×10) celler, med en infusjonstid på 30 minutter Den eksperimentelle prosessen ble utført i samsvar nce med god klinisk praksis. Tidsintervallet for den andre blodprøvetakingen var omtrent 37 (25-57) dager.
Isolering av humane perifere blod-T-celler og NK-celler. Ferskt blod ble hentet fra friske frivillige etter at informert samtykke ble gitt, og protokollen ble godkjent av den institusjonelle vurderingskomiteen ved China Pharmaceutical University (tillatelsesnummer: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Canada) ble brukt til å isolere humane PBMCer. Humane CD3 pluss T-celler ble oppnådd fra PBMCer ved bruk av humane CD3 T-celle sorterende magnetiske kuler (Miltenyi Biotec, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. NK-celler ble isolert fra perifert blod ved å bruke RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) i henhold til produsentens protokoll
Separasjon og utvidelse av muse-NK-celler in vitro
NK-celler fra musemilt ble isolert ved å bruke NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble musemilt oppnådd, miltceller ble filtrert ved hjelp av et 70μm cellefilter, og miltlymfocytter ble oppnådd ved tetthetsgradientsentrifugering ved bruk av et musemilt-lymfocyttseparasjonssett (Solarbio, Kina). Miltlymfocyttene ble samlet for å oppnå NK-celler med høy renhet ved bruk av magnetiske perler for å skille muse-NK-celler. De isolerte milt-NK-cellene ble dyrket i et vedlikeholds-RPMI-1640-medium supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS), 1 prosent L-glutamin, 1 prosent penicillin/streptomycin, 1 prosent minimal essential medium (MEM) non- essensiell aminosyre, 1 prosent natriumpyruvatsyre og 50 uM merkaptoetanol (alt fra Life Technologies, USA). I tillegg ble 200 IE/mL rekombinant interleukin 2 (RL-2)(PeproTech, USA) og 10 ng/mL mus I-15(ml-15)(PeproTech) lagt til medium. Deretter ble 10 graders NK-celler og 10 grader bestrålte miltlymfocytter samlet inn, og 5 ml amplifikasjonsmedium (vedlikeholdsmedium supplert med 1000 IE/mL rlL-2, 10ng/ml ml-15 og 30ng/mL anti -NKp46-antistoff (PA5-46986,Invitrogen,USA))var
Fig. 3 SNC-er aktiverer NK-celler og ble drept av NK-celler. Flowcytometri for å påvise ekspresjonen av (A) CD69 og (B) IFN-y ble utført etter en 24 timers saminkubasjon med muse-NK-celler og preadipocytter eller bestråling-induserte preadipocytter. n =3. Data presenteres som middel±SD. Forskjeller ble vurdert ved den tosidede uparrede ikke-parametriske t-testen. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">
Ekstraksjon av preadipocytter og muskelsatellittceller
Preadipocyttene ble ekstrahert som tidligere beskrevet [11]. Kort fortalt ble menneske- eller musefett fjernet under sterile forhold og kuttet i 1-2 mm stykker, vasket to ganger med PBS og fordøyd med kollagenase ll (Solarbio) ved 37 grader i 1 time. Deretter ble cellene filtrert med et 100 μm cellefilter, sentrifugert ved 300 g i 5 minutter og samlet. De adherente cellene ble dyrket i a-MEM supplert med 20 prosent FBS i 12 timer og fordøyd med trypsin for å samle adherente celler. Muskelsatellittcellene ble isolert som tidligere beskrevet [34]. Quadriceps-muskelen ble kuttet i 1-2 mm stykker, og 5 ml kollagenase ll ble tilsatt for fordøyelse ved 37 grader C i 12 minutter. Blandingen ble blandet med en pipette, og et 5 ml komplett medium ble tilsatt etter ytterligere fordøyelse i 12 minutter. Cellene ble filtrert ved hjelp av et 70 μm cellefilter og sentrifugert ved 300 g i 5 minutter. Da ble celler
dyrket med 5 mL medium tilsatt daglig i 4 dager. De adherente cellene ble blåst bort med en pipette og sentrifugert ved 2000 xg i 5 minutter. Etter trypsinfordøyelse ved 37 grader i 5 minutter, ble cellene sentrifugert ved 2000 xg i 5 minutter og samlet. Deretter ble 5 mL F-10 skinkemedium supplert med 20 prosent FBS og 4 ng/mL basisk fibroblastvekstfaktor (PeproTech) tilsatt.
Cytotoksisitet av NK-celler fra musemilt til SNC ble påvist ved laktatdehydrogenaseanalysen
SNC-ene ble indusert av 0.2 μM Adriamycin (MedChemExpress, USA) i 24 timer eller ved fortsatt dyrking i 20 dager etter 10 Gy røntgenstråling. Deretter ble 5000 SNC-er plassert i en plate, og milt-NK-celler (cellelevedyktighet: 93.5-97.1 prosent ) ble tilsatt ved effektor-til-mål-forhold på 50:1,25:1,12,5:1, 6,25: 1,3.125:1 og 1.563:1. Supernatantene ble samlet etter samdyrking ved 37 grader C i 24 timer, og et laktatdehydrogenase (LDH) Cytotoksisitetsdeteksjonssett (Cayman Chemical, USA) ble brukt for påvisning. Cytotoksisitet ble beregnet ved hjelp av følgende formel: cytotoksisitet (prosent)=(blandingscelleeksperiment-målcelle spontan-effektorcelle spontan)/(målcelle maksimum-målcelle spontan)× 100.
Live bildebehandling
Tolv 10-uker gamle C57BL/6-mus ble kjøpt fra Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Kina). Deretter 1×10 grader 1,1'-oktadecyl-3,3,3',3'-tetrametylindokarbocyaninjodid (DiR) (Invitrogen)-merket kontroll
preadipocytter eller strålingsinduserte senescent preadipocytter ble resuspendert i 200 ul fosfatbufret saltvann (PBS) og injisert inn i bukhulen til mus med en 22 gauge nål. Etter tre dager ble 5×10 graders allogene NK-celler (cellelevedyktighet: 93.6-96.2 prosent) i 100uL PBS injisert gjennom halevenen. På den 10. dagen ble musene bedøvet med isofluran. Fluorescens ble påvist ved bruk av MS 100 Series In Vivo Imaging System (PerkinElmer, MA, USA).
Flowcytometri
For å oppdage apoptosen til SNC-er co-inkubert med DiR-merkede milt-NK-celler (cellelevedyktighet: 91. 8-93.2 prosent ), ble 1 × 10 grader SNC fordøyd med nøyaktighet ved 37 grader i 10 minutter og deretter farget med et Annexin V og Propidium iodide (PI) Apoptosis Staining Kit (Multisciences Biotech Co, Ltd., Kina) i henhold til produsentens protokoll. SNC-er ble lukket i den DiR-negative posisjonen. For å teste aktiveringen av NK-celler ble muse-NK-celler samlet og farget med mNK1.1-allofycocyanin (APC)(S17016D) og med museklynge av differensiering 69-R-phycoerythrin-cyanine7 (mCD{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) ved 4 grader i 30 min. Deretter ble cellene behandlet med CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, USA) og farget med mus interferon gamma-brilliant violet 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) ved 4 grader i 30 minutter. Perforin-APC(S16009A)-farging av humane NK-celler ble utført ved bruk av samme protokoll som den som ble brukt for ekstracellulær farging (CD56-fluorescein-isotiocyanat [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) og intracellulær farging (perforin-APC) (Biolegend).
For å påvise NK-celler fra perifert blod ble det samlet inn 100 uL antikoagulasjonsblod. For perifert blod fra mus ble CD3-FITC, NK1.1-APC og CD69-PE-Cy7 lagt til. For humant perifert blod ble CD3-BV421 (OKT3) og CD56-FITC tilsatt og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur.
Deretter ble 400 μL 1× erytrocyttlysat (BD Biosciences) tilsatt og inkubert i 3 minutter, etterfulgt av tre vaskinger med PBS. For å oppdage celleproliferasjon i fettvev ble musene injisert intraperitonealt med 200 μL 10 mg/ml bromodeoksyuridin (BrdU) 24 og 72 timer før eutanasi. Etter eutanasi ble lyskefettdepotene fjernet og kuttet i fragmenter, fordøyd ved 37 C i 30 minutter med kollagenase II og DNase, og filtrert ved bruk av et 100 um cellefilter. Celler ble behandlet med Cytofix/Cytoperm Plus-settet og farget med BrdU-FITC (3D4) og Ki67-PE (16A8). Flowcytometri ble utført på et CytoFLEX flowcytometer. LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) ble brukt for å ekskludere døde celler i alle eksperimenter. Data ble analysert ved bruk av FlowJo-programvare (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).
Revers transkripsjon-kvantitativ PCR
RNA ble ekstrahert ved bruk av Trizol-reagens og reversert og transkribert til cDNA ved bruk av Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Yepsen Biotechnology, Kina). Kvantitativ PCR (qPCR) ble utført ved bruk av reaksjonsblandingen av SYBR Green (Yepsen Biotechnology) på ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA), med GAPDH som en intern kontroll. Data ble analysert ved hjelp av 2-△ACt-metoden. Listen over primersekvenser er rapportert i tilleggsmateriale (tabell 2-3).
Aldringsassosiert -galaktosidasefarging
For cellefarging ble cellene vasket én gang med PBS, fiksert i senescensassosiert -galaktosidase(SA- -gal)-løsning (Cell Signaling Technology, USA) ved romtemperatur i 15 minutter, vasket tre ganger med PBS og inkubert over natten i SA- -gal-fargeløsning ved 37 grader C. Platen ble forseglet med parafilm for å forhindre fordampning av fargemediet. Celler
ble vasket med PBS og observert med et mikroskop. For frosset seksjonsfarging ble seksjonene tørket ved 37 grader i 30min og fiksert ved romtemperatur i SA- -gal fikseringsløsning i 15 minutter. Seksjonene ble vasket tre ganger med PBS og inkubert over natten i SA- -gal fargeløsning ved 37 grader C. Deretter ble de farget med eosin i 1 min og skylt med vann i 2 minutter. SA- -gal-fargedata ble analysert ved bruk av Image-Pro Plus 6.0-programvare.
Eksplantater av menneskelig fettvev
Fettvev fra tre individer ble oppnådd ved fettsuging. En av forsøkspersonene var en mann, og to var kvinner. Gjennomsnittsalderen til forsøkspersonene var 57.0±7,6 år (gjennomsnitt±SD: rekkevidde, 50-65). Gjennomsnittlig BMI var 40,5±5,1 kg/m² (gjennomsnittlig ± SD; område, 36.7-46.2）. Den etiske komiteen ved Shanghai Mengchao Cancer Hospital (nr. 05, 2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital) godkjente forsøksordningen. Informert samtykke ble innhentet for alle frivillige. Fettvev ble kuttet i små biter med en diameter på ca. 2 mm. Fem vevsstykker ble plassert i hver brønn i en 96-brønnplate, og 200 ul av enten preadipocytter eller kondisjonert medium fra strålingsinduserte senescent preadipocytter, supplert med 10 prosent humant AB-serum, 1 prosent L-glutamin, 1 prosent penicillin/streptomycin, 1 prosent MEM ikke-essensielle aminosyrer og 1 prosent natriumpyruvatsyre, ble tilsatt til samkulturen i 24 timer. Deretter ble mediet erstattet med et friskt medium som inneholdt 5×10 grader autologe NK-celler (cellelevedyktighet: 92.3-95.7 prosent 6) og dyrket i ytterligere 48 timer, hvoretter NK-celler ble samlet for flowcytometri. Fettvevet ble vasket fem ganger med PBS, og det samme mediet ble tilsatt for en ytterligere kultur i 48 timer; supernatanten (100 ul) ble brukt for multifaktordeteksjon. Preadipocytter eller strålingsinduserte senescent preadipocytter ble avledet fra fettvevet til samme individ.
Denne artikkelen er hentet fra Cell Death and Disease (2022) 13:305
