Sammenligning mellom QPCR og RNA-seq avslører utfordringer med å kvantifisere HLA-uttrykk del 1

Abstrakt

Humant leukocyttantigen (HLA) klasse I og II loci er essensielle elementer i medfødt og ervervet immunitet. Deres funksjoner inkluderer antigenpresentasjon til T-celler som fører til cellulære og humorale immunresponser, og modulering av NK-celler. Deres eksepsjonelle innflytelse på sykdomsutfall har nå blitt tydeliggjort av genomomfattende assosiasjonsstudier. Eksonene som koder for det peptidbindende sporet har vært hovedfokuset for å bestemme HLA-effekter på sykdomsfølsomhet/patogenese. Imidlertid har HLA-ekspresjonsnivåer også blitt implisert i sykdomsutfall, og legger til en annen dimensjon til det ekstreme mangfoldet av HLA som påvirker variasjonen i immunresponser på tvers av individer.

Det er et nært forhold mellom leukocyttantigener og immunitet. Leukocyttantigen refererer til molekylet på overflaten av menneskelige hvite blodceller, som kan identifisere og skille forskjellige celletyper og patogener. Det er en viktig del av det menneskelige immunsystemet og en viktig regulator av immunrespons.

Forskjeller i leukocyttantigener kan resultere i forskjellige immunresponser og sykdomsfølsomhet. For eksempel er visse leukocyttantigener assosiert med autoimmune sykdommer, infeksjonssykdommer og svulster. Ekspresjonen av visse leukocyttantigener er også relatert til funksjonen og mengden av immunceller.

Derfor er forståelsen av de molekylære egenskapene til et individs leukocyttoverflate av stor betydning for å vurdere individets immunstatus og risikoen og prognosen for sykdommen. Samtidig bidrar det også til utforming av personlig behandling og forebyggende tiltak. Fra dette synspunktet må vi forbedre immuniteten. Cistanche har en betydelig effekt på å forbedre immuniteten. Cistanche er rik på ulike antioksidantstoffer, som vitamin C og karotenoider. Disse ingrediensene kan rense frie radikaler, redusere oksidativt stress og forbedre immunsystemets motstand.

Klikk cistanche tubulosa ekstrakt pulver

For å estimere HLA-uttrykk er immunogenetiske studier tradisjonelt avhengige av kvantitativ PCR (qPCR). Adopsjonen av alternative høykapasitetsteknologier som RNA-seq har blitt hemmet av tekniske problemer på grunn av den ekstreme polymorfismen ved HLA-gener. Nylig har imidlertid flere bioinformatiske metoder blitt utviklet for å nøyaktig estimere HLA-ekspresjon fra RNA-seq-data. Dette åpner en spennende mulighet til å kvantifisere HLA-uttrykk i store datasett, men bringer også spørsmål om hvorvidt RNA-seq-resultater er sammenlignbare med qPCR. I denne studien analyserer vi tre klasser med ekspresjonsdata for HLA klasse I-gener for et matchet sett med individer: (a) RNA-seq, (b) qPCR og (c) celleoverflate-HLA-C-ekspresjon. Vi observerte en moderat korrelasjon mellom ekspresjonsestimater fra qPCR og RNA-seq for HLA-A, -B og -C ({{10}}.2 Mindre enn eller lik rho Mindre enn eller lik 0,53 ). Vi diskuterer tekniske og biologiske faktorer som må tas i betraktning når man sammenligner kvantifiseringer for forskjellige molekylære fenotyper eller bruker forskjellige teknikker.

Nøkkelord

HLA · Ekspresjon · PCR · RNA-sekv.

Introduksjon

Genuttrykk gir en molekylær fenotype som ligger i en mellomposisjon mellom genetisk variasjon og komplekse fenotyper, som sykdomsstatus. Å forstå det genetiske grunnlaget for genuttrykk kan være strategisk for å knytte koblinger mellom genetisk variasjon og komplekse fenotyper (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), inkludert mottakelighet for autoimmune og infeksjonssykdommer. Selv om studiet av genetisk variasjon ved det humane leukocyttantigenet (HLA) loci, og innenfor major histocompatibility complex (MHC) regionen generelt, har blitt brukt til å dissekere det genetiske grunnlaget for flere komplekse sykdommer (Trowsdale og Knight 2013; Dendrou et al. . 2018), er inkluderingen av molekylære fenotyper, spesielt de som er assosiert med genuttrykk, relativt nyere (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

Den humane MHC-regionen på kromosom 6p21 viser en høy gentetthet, med unike mønstre av koblingsulikevekt (LD) og ekstrem polymorfisme (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). MHC-regionen inneholder HLA klasse I og II loci som koder for molekyler som er involvert i å utløse og modulere immunresponsen. HLA klasse I molekyler uttrykkes av de fleste kjerneholdige celler og presenterer generelt intracellulære peptider til CD8 pluss T-celler. I motsetning til dette uttrykkes HLA klasse II-molekyler primært av profesjonelle antigenpresenterende celler, og presenterer eksogene antigener til CD4 pluss T-celler som ble internalisert av endocytose. Klasse I-molekyler gjenkjennes også av reseptorer på naturlige drepeceller (NK), de drepercelle-immunoglobulinlignende reseptorene (KIR), som påvirker både utdanning og aktivering av NK-celler (Colonna og Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). Sammenkoblingen av forskjellige HLA klasse I allotyper og spesifikke KIR-molekyler påvirker NK-celle (og en undergruppe av CD8 pluss T-celle) aktivitet, noe som resulterer i differensiell risiko for kreft, infeksjonssykdom og autoimmunitet (gjennomgått i Kulkarni et al. 2008).

HLA-sykdomsassosiasjoner har først og fremst blitt tilskrevet allelspesifikke forskjeller i antigenpresentasjon, på grunn av de omfattende polymorfismene i det peptidbindende sporet. Imidlertid bidrar HLA-ekspresjonsnivåer til noen av assosiasjonene som er observert mellom HLA-polymorfismer og sykdomsutfall. HLA-ekspresjonsnivået er en viktig modifikator av autoimmunitet og styrken til den HLA-medierte immunresponsen mot kreft og infeksjoner (gjennomgått i René et al. 2016).

Det er flere eksempler på assosiasjoner mellom HLA-ekspresjonsnivåer og virusinfeksjonsutfall. Det er for eksempel godt dokumentert at høyere HLA-C-ekspresjonsnivåer, både på mRNA-nivå og protein på celleoverflaten, er assosiert med bedre kontroll av HIV-1 (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. al. 2011; Apps et al. 2013; Parolini et al. 2018; Bachtel et al. 2018), mens forhøyet HLA-A-uttrykk assosieres med svekket HIV-kontroll (Ramsuran et al. 2018). SARS-CoV-2-infeksjon nedregulerer HLA-C-genekspresjon (Loi et al. 2022) og HLA klasse I-ekspresjon på celleoverflaten (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023), så vel som HLA-klasse II genuttrykk, inkludert HLA-DPA1, -DPB1, -DRA og -DRB1 (Wilk et al. 2020).

I tillegg er det assosiasjoner mellom HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) og HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) ekspresjonsnivåer med HBV-clearance; HLA-DRA-ekspresjon med mottakelighet for infeksjon av flaggermus Influensa A-virus i humane cellelinjer (Karakus et al. 2019); og omfattende assosiasjoner mellom regulatoriske varianter og ekspresjonsnivåer ved HLA klasse II gener, inkludert HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 og -DRB5 med antistoffrespons mot flere utbredte virus (Kachuri et al. 2020).

Ekspresjonsnivåene til HLA loci er også assosiert med autoimmunitet (se Johansson et al. 2022 for en gjennomgang). HLA-C-ekspresjonsnivåer på celleoverflaten (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), samt HLA-G-nivåer på celleoverflaten og i plasma (da Costa Ferreira et al. 2021), har blitt assosiert med risiko for inflammatorisk tarmsykdom. Økt HLA-B27-ekspresjon på celleoverflaten ble observert blant pasienter med ankyloserende spondylitt (Cauli et al. 2002), og det samme var det generelle HLA-klasse I-uttrykket blant pasienter med Graves sykdom (Weider et al. 2021). HLA klasse II-ekspresjonsnivåer påvirker også risikoen for autoimmune tilstander.

HLA-DQA1 og -DRB1 genuttrykk og ekspresjon av DQ og DR molekyler på celleoverflaten økes i perifere blodmonocytter hos vitiligopasienter (Cavalli et al. 2016); regulatoriske varianter assosiert med høyere HLA-DQA1-, -DQB1- og -DRB1-genekspresjon og DQ- og DR-ekspresjon på celleoverflaten er assosiert med risiko for systemisk lupus erythematosus (Raj et al. 2016); HLA-DRB5 genuttrykk er høyere hos sklerodermipasienter med interstitiell lungesykdom (Odani et al. 2012); spesifikke HLA-DRB1 alleler er sterkt uttrykt hos pasienter med revmatoid artritt (Houtman et al. 2021); og høyere ekspresjon av DRB1*15:01 assosierer med risiko for multippel sklerose (Alcina et al. 2012). Derfor vil det å forstå variasjonen av HLA-ekspresjon blant individer og mekanismene som regulerer HLA-ekspresjonsnivåer være nøkkelen til å avdekke det genetiske grunnlaget for sykdomsfenotyper.

Tradisjonelt har HLA-ekspresjon blitt estimert ved antistoffbaserte teknikker for ekspresjonsnivåer på celleoverflaten (Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) eller ved kvantitativ PCR (qPCR eller RT-PCR) for mRNA-transkripsjonsnivåer (Bettens et al. al. 2014; Ramsuran et al. 2015, 2017). Det er utfordrende å sammenligne resultater på tvers av studier eller til og med sammenligne distinkte HLA-loci innenfor samme studie siden forskjellige eksperimentelle prosedyrer brukes for hver analyse og for hvert HLA-locus, noe som kan resultere i forskjellige amplifikasjonseffektiviteter i qPCR eller antistoffaffiniteter i flowcytometri.

Høygjennomstrømningsteknologier som RNA-seq gir ekspresjonsestimater for alle genene i genomet, inkludert HLA-gener, og tillater dermed evaluering av HLA-ekspresjon i en genomomfattende kontekst. Imidlertid gir disse teknologiene mange utfordringer når de brukes til å estimere ekspresjonsnivåer av HLA-genene. I tillegg til veldokumenterte skjevheter assosiert med RNA-seq-analyser (f.eks. batch-effekter, biblioteksopparbeidelse, GC-innhold ('t Hoen et al. 2013), skyldes vanskelighetene med å estimere ekspresjonsnivåer for HLA-gener det faktum at kvantifiseringen involverer justering av korte avlesninger til et referansegenom, som ikke gir en fullstendig representasjon av HLA-allelisk mangfold.

Derfor kan noen avlesninger mislykkes på grunn av et stort antall forskjeller angående referansegenomet (Brandt et al. 2015). I tillegg er HLA-genene en del av en genfamilie dannet etter påfølgende runder med duplikasjoner og inneholder ofte segmenter som er svært like mellom paraloger, noe som resulterer i kryssjusteringer mellom gener og partisk kvantifisering av ekspresjonsnivåer. Disse vanskelighetene motiverte utviklingen av beregningsbaserte rørledninger (se Johansson et al. 2022 for en gjennomgang) som står for kjent HLA-mangfold i justeringstrinnet og har vist seg å gi nøyaktige ekspresjonsnivåer for HLA-gener (Boegel et al. 2012; Lee et al. al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020).

Mens både RNA-seq og qPCR-tilnærminger estimerer HLA-uttrykk ved å kvantifisere mengden av transkripsjoner, involverer metodene forskjellige eksperimentelle og bioinformatiske prosesseringsprosedyrer. Så vidt vi vet, er det ikke utført en kvantitativ sammenligning av resultater fra RNA-seq med de som er avledet fra qPCR for HLA-gener. I denne studien søkte vi å sammenligne forskjellige teknikker og molekylære fenotyper for kvantifisering av HLA klasse I-uttrykk, med tanke på at ingen teknikk kan betraktes som en gullstandard. For å redusere effekten av teknisk og biologisk variasjon i sammenligningen av forskjellige studier, utførte vi en RNA-seq-analyse på et sett med 96 individer for hvilke qPCR-ekspresjonsestimater var tilgjengelige (for HLA-A, -B, -C), og for en undergruppe hvorav HLA-C-antistoffbasert celleoverflateekspresjon også var tilgjengelig. RNA-seq kvantifisering ble utført med en HLA-tilpasset rørledning som muliggjør nøyaktig ekspresjonsestimering, og minimerer skjevheten til standardtilnærminger basert på et enkelt referansegenom.

Materialer og metoder

Prøver

Blodprøver ble hentet fra 96 ​​friske blodgivere registrert i det frivillige donorprogrammet ved Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersoner, og prøver ble anonymisert ved IRB-godkjente prosedyrer fra National Cancer Institute. RNA ble ekstrahert fra nylig isolerte mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ved bruk av RNeasy Universal-settet (Qiagen). RNA ble behandlet med RNAse-fri DNAse for fjerning av genomisk DNA. Totalt RNA ekstrahert fra PBMC-er ble kvantifisert ved å bruke HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). Alle prøver som viste en RNA-kvalitetsscore større enn 8 ble brukt i genekspresjonsanalysene.

HLA-skriving

HLA-alleler ble bestemt ved Sanger-sekvensering. I tillegg kjørte vi HLApers (Aguiar et al. 2019) og Kourami (Lee og Kingsford 2018) for å utlede HLA-alleler direkte fra RNAseq og sjekket for samsvar med Sanger-sekvenseringsbaserte samtaler. Hvis vi vurderer konsistente anrop mellom HLApers og Kourami, observerte vi bare 10 uoverensstemmelser med Sanger-anropene av 288 sammenligninger (3 loci × 96 individer). De fleste av dem (n=5) viste støtte fra RNA-seq for en allel svært nær den som ble bestemt av Sanger-sekvensering, og derfor valgte vi å beholde de RNA-seq-baserte kallene. For 3 genotyper observerer vi homozygote anrop fra RNA-seq sannsynligvis fordi ett allel ikke ble uttrykt, og vi beholdt anropene fra Sanger-sekvensering. Dette påvirker ikke ekspresjonsestimat, siden ingen avlesninger justeres til allelet som ikke er oppdaget via RNA-seq. For en genotype observerte vi god støtte for et heterozygot kall, mens Sanger-sekvenseringen ble kalt en homozygot. I så fall beholdt vi det RNA-seq-baserte kallet siden det bedre forklarte de observerte avlesningene. For ett allelkall vurderte vi en feil i de RNA-seq-baserte samtalene på grunn av utilstrekkelig lesedekning.

Kvantitativ PCR (qPCR)

HLA mRNA-transkripsjonsnivåer for HLA-A, -B og -C ble målt ved qPCR i en analyse som sikrer upartisk amplifisering av de vanlige allelene på hvert locus, samtidig som man unngår amplifikasjon av alle andre loci. Primerne som ble brukt var: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Revers transkripsjon ble utført ved bruk av High-Capacity RNA-til-cDNA-settet (Applied Biosystems). Amplifisering av HLA og husholdningsgenet 2 mikroglobulin (B2M) cDNA ble utført ved bruk av Power SYBR green master mix (Applied Biosystems), på en ABI 7900HT maskin. Primersekvenser for B2M er beskrevet i tabell S4 til Kulkarni et al. (2013). Det gjennomsnittlige ekspresjonsnivået til hvert HLA-gen ble normalisert til B2M og beregnet ved å bruke 2-∆∆Ct-metoden (der Ct er terskelsyklusen).

Gjennomsnittlige allelspesifikke ekspresjonsnivåer av vanlige HLA-alleler ble estimert av en lineær modell som beskrevet i Ramsuran et al. (2015). Spesifikt modellerte vi uttrykk som en lineær funksjon av de to allelene som bæres av hvert individ og ekstraherte effekten av hver allel på genuttrykk. Vi utførte dette trinnet i R (se avsnittet Kodetilgjengelighet).

Overflateuttrykk

HLA-C celleoverflateekspresjon ble målt på CD3 pluss-celler fra nyisolerte PBMC-er ved flowcytometri ved bruk av det HLA-C-spesifikke monoklonale antistoffet DT9 (Apps et al. 2013). For HLA-A-analysen i en undergruppe av individer som bærer A*03 og A*11, farget vi celler med antistoffet 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA-sekv

RNA forberedelse

RNA-seq ble utført på RNA lagret ved -80 grader. Totalt RNA ble kvantifisert ved å bruke Qubit RNA HS-analysen (Thermo Fisher). RNA-kvaliteten ble vurdert ved bruk av et 2100 Bioanalyzer-instrument og et Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies). For hver prøve ble 500 ng totalt RNA brukt som input for fremstilling av hele transkriptom-rRNA-utarmede biblioteker. Et adapter-ligert bibliotek ble utarbeidet med KAPA HyperPrep Kit (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) ved bruk av Bioo Scientific NEXTfex™ DNA strekkodede adaptere (BioScientifc, Austin, TX, USA) i henhold til KAPA-levert protokoll.

rRNA-utarming ved bruk av RiboErase

Ribosomalt RNA ble utarmet ved å inkubere totalt RNA med prober komplementære til rRNA-sekvenser. Etter hybridisering ble RNase H brukt til å enzymatisk nedbryte rRNA. Opprydding og DNase-fordøyelse ble utført ved bruk av Kapa Pure Beads og DNase i henhold til Kapa-protokollen.

Fragmentering, cDNA-syntese og bibliotekkonstruksjon

rRNA-utarmede prøver ble fragmentert ved 85 grader i 4,5 minutter i nærvær av magnesium før 1. og 2. trådsyntese og A-Tailing-reaksjoner. NEXTfex DNA strekkodede adaptere (1,5 uM) ble ligert til A-hale cDNA med en unik strekkode for hver prøve. Produktene ble renset med Kapa Pure Beads og 8 sykluser med bibliotekamplifikasjon ble utført. Etter amplifikasjon ble det utført en siste bibliotekopprydding, og bibliotekkvantifisering og QC ble vurdert ved bruk av Qubit DNA HS-analyse (Thermo Fisher) og Agilent DNA HS-sett på 2100 Bioanalyzer-instrumentet.

Sekvensering

De resulterende multipleksede sekvenseringsbibliotekene ble brukt i klyngedannelse på en Illumina cBOT (Illumina, San Diego, CA, USA) og sekvensering ble utført ved bruk av en Illumina HiSeq 2500 etter Illumina-leverte protokoller for 2×126 bp paret endesekvensering. Hvert transkriptom ble sekvensert til en måldybde på 40–50 millioner avlesninger.

RNA-seq på ferske prøver fra 11 individer

For å undersøke muligheten for prøvenedbrytning av materiale lagret ved -80 grader før RNA-sekvensering, en potensiell kilde til uenighet med qPCR-estimater, tegnet vi om blod fra 11 givere og utførte RNA-seq på de nye prøvene. Eksperimentet ble utført med samme bibliotekspreparat og -metoder som før, men sekvensert ved bruk av en Illumina NextSeq med 2×150 pb-lesninger.

Kvantifisering av uttrykk for RNA-seq

Referansetranskriptom

Vi brukte Salmon (Patro et al. 2017) for å estimere ekspresjonsnivåer for alle transkripsjoner annotert i Gencode v37-databasen. Vi brukte alle alternativer for skjevhetskorreksjon på laks (GC-skjevhet, posisjonsskjevhet og sekvensspesifikk skjevhet).

Personlig tilpasset

Samme som "Ref-transkriptomet", men med personlige HLA-transkripsjoner i henhold til HLA-A-, -B- og -C-genotypene som bæres av hvert individ. Personaliseringen ble utført ved å justere sekvensen for referansegenomets HLA-allel til genomet for å få koordinatene. Deretter, ved å bruke multi-sekvensjusteringen av allelen som er tilstede på referansegenomet med alle de andre allelene (tilgjengelig fra IPD-IMGT/HLA utgivelse 3.43.0 (Robinson et al. 2020)), tilskrev vi genomisk posisjoner til alle HLA-alleler. Til slutt konstruerte vi et personlig transkripsjon basert på kombinasjonen av informasjon om transkripsjonskoordinater og HLA-allelens sekvens. Denne prosedyren ble utført i R (R Core Team 2020), ved bruk av Biostrings-pakken (Pagès et al. 2020) og tidyverse-metapakken (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com