Sammenligning mellom QPCR og RNA-seq avslører utfordringer med å kvantifisere HLA-uttrykk del 2

Normalisering

Vi brukte ekspresjonsestimater i transkripsjoner per million (TPM), som er standardnormaliseringen produsert av Salmon og tilsvarer den relative mengden av et gitt transkripsjon i en prøve. For et gitt gen er estimatet ganske enkelt summen av TPM-er for dets transkripsjoner. I noen tilfeller når vi viser standard normal transformerte estimater, utførte vi en rangert normal transformasjon av RNAseq-dataene ved å bruke GenABEL R-pakken (Aulchenko et al. 2007), som vanligvis brukes, for eksempel i lineære modeller av eQTL-kartlegging (Delaneau) et al. 2017).

QTL-kartlegging er en metode for å studere den regulatoriske mekanismen for genuttrykk ved å sammenligne assosiasjonen mellom genuttrykk og genpolymorfisme i en populasjon. Den lineære modellen er en vanlig brukt eQTL-kartleggingsmetode, som kan bruke en lineær regresjonsmodell for å estimere sammenhengen mellom genuttrykk og genpolymorfisme.

Immunsystemet er et komplekst biologisk system som beskytter kroppen mot infeksjoner og sykdommer som kreft. Regulering av genuttrykk spiller en viktig rolle i immunsystemet og kan påvirke utviklingen, differensieringen og funksjonen til immunceller.

Derfor kan lineære modeller for eQTL-kartlegging brukes til å analysere forholdet mellom reguleringsmekanismer for genuttrykk og immunitet. For eksempel kan å studere sammenhengen mellom en viss genotype og uttrykket av et nøkkelimmungen i en populasjon avsløre påvirkningen av denne genotypen i regulering av immungenuttrykk. Slik forskning kan gi viktig opplysning for behandling og forebygging av immunsykdommer. Dette viser viktigheten av immunitet, så vi må forbedre immuniteten vår hver dag. Kjøttdeig har også antivirus-, anti-kreft- og andre effekter, som kan styrke immuniteten Systemets evne til å motstå og forbedre kroppens immunitet.

Klikk helsemessige fordeler av cistanche

Les justering til referansegenomet

For analysen av lesedekning ved HLA-gener rapportert i Fig. S7, justerte vi avlesninger til referansegenomet GRCh38 med STAR v2.7.3a (Dobin et al. 2013), ved å bruke Gencode v37-genmerknader. For å kontrollere for kartlegging av skjevheter ved HLA-gener, behandlet vi BAM-filene videre med hlamapper v4.3 (Castelli et al. 2018).

Simulering

Grunnsannhetsdata

For å generere simulerte data, kjørte vi først Salmon v1.3.0 (Patro et al. 2017) på den virkelige prøven #66K00003 for å lære uttrykksnivåene til Gencode v37-transkripsjoner. Deretter brukte vi Polyester-pakken (v1.26.0) for å generere 50 syntetiske prøver med identiske transkriptomomfattende ekspresjonsnivåer, bortsett fra HLA-A, -B og -C. Ekspresjonsnivåene for disse genene var basert på 50 tilfeldig utvalgte individer fra våre virkelige data (som vi har HLA-alleldata tilgjengelig for). For hvert HLA-gen valgte vi isoformene som sto for minst 90 prosent av det totale proteinkodende transkripsjonsuttrykket i en laksekjøring på det virkelige datasettet (som resulterte i bare 1 transkripsjon per gen) og tilpasset transkripsjonssekvensene i henhold til HLA-alleler bæres av hvert individ.

Denne prosedyren tillot oss å syntetisk generere 50 individer med identiske bakgrunnsuttrykksnivåer, men med variabelt HLA-uttrykk og med HLA-polymorfisme innebygd i de simulerte avlesningene.

For å speile våre virkelige data ble tretti millioner 126 bp parede avlesninger med en gjennomsnittlig fragmentstørrelse på 261 bp simulert for hvert individ, ved å bruke standardinnstillingene for andre polyesterparametere (f.eks. standardavviket for fragmentlengden=25 bp, feilrate=0.005, enhetlig fordeling av lesninger og ingen skjevhet). Polyester gir ut FASTA-filer, hvorfra vi produserte FASTQ-filer med konstant kvalitetspoengsum (tilsvarende symbol "F").

Beregninger for nøyaktighet

TPM-er ble beregnet på simulerte tellinger gitt transkripsjonslengder og gjennomsnittlig fragmentstørrelse på 261 bp. "Estimert TPM/True TPM"-forhold brukes til å vurdere ytelsen ved å gjenopprette simulerte uttrykksnivåer og lar oss observere ned- eller overestimering.

Grafikk

Vi forberedte alle plottene i denne artikkelen ved å bruke ggplot2-pakken v3.3.2 (Wickham 2016) i R.

Resultater

Nøyaktighet av RNA-seq HLA kvantifisering

Gitt fraværet av en metode som kan betraktes som den eksperimentelle gullstandarden for HLA-ekspresjonskvantifisering fra RNA-seq-data, vurderte vi først nøyaktigheten av RNA-seq-kvantifiseringsmetoder for HLA ved å bruke simulerte data der sanne ekspresjonsnivåer er kjent siden de genereres i en datamaskin for å etterligne ekte eksperimenter. Dette ble gjort for å velge den beste beregningsmetoden blant RNA-seq-baserte metoder, noe som muliggjorde en påfølgende kontrast med ikke-RNA-seq-tilnærminger.

Vi simulerte et RNA-seq-eksperiment for 50 individer ved å bruke Polyester-pakken (Frazee et al. 2015). Disse syntetiske individene har de samme ekspresjonsnivåene for alle gener i genomet, bortsett fra HLA-A, -B og -C, som vi varierte ekspresjonsnivåene for. Vi tilpasset også de kommenterte HLA-transkripsjonssekvensene fra Gencode v37 for å introdusere ekte genetisk variasjon observert i tilfeldig valgte individer fra et datasett på 96 individer (som ble HLA-genotypebestemt ved Sanger-sekvensering som beskrevet nedenfor). De resulterende personaliserte transkripsjonene hadde en median sekvensidentitet med en referanse større enn 95 prosent for alle HLA-loci.

Vi sammenlignet estimater av HLA-uttrykk oppnådd ved to bioinformatiske metoder: (1) "Ref-transkriptom," som bruker Salmon (Patro et al. 2017) for å justere avlesningene til standardreferansetranskriptomet, kvantifisere transkripsjonsoverflod og (2) "Personalisert," som også bruker laks, men kartleser til personlige HLA-transkripsjoner, som gjenspeiler individets HLA-genotype (fig. 1). «Personalisert»-tilnærmingen utvider vår tidligere strategi (Aguiar et al. 2019) ved å bruke et personlig transkripsjon, i stedet for en enkelt kanonisk kodesekvens for hver allel som bæres av individet.

"Ref-transkriptom"-metoden undervurderte ekspresjonsnivåer, spesielt for alleler med en større andel sekvensforskjeller angående referansegenomet (fig. 1). Dette er forventet siden en høyere misforhold mellom avlesninger og referansen påvirker justeringen negativt (Brandt et al. 2015). Denne tilnærmingen overvurderte også HLA-C-uttrykk for noen individer, en konsekvens av at lesninger fra HLA-B ble kartlagt til HLA-C-referansetranskriptene (fig. S1). "Personalisert"-tilnærmingen, derimot, kontrollerer kartleggingsbias og oppnår optimal nøyaktighet.

Selv om simuleringen vår gir oppmuntrende resultater angående kvantifisering av HLA-uttrykk ved bruk av RNAseq, må vi vurdere noen forbehold. Vi modifiserte sekvensen til de annoterte isoformene i henhold til individenes HLA-alleler ved å bruke et enkelt sett med isoformer for alle alleler ved et gitt HLA-gen. Disse sekvensene ble brukt både i simulering av avlesninger så vel som i kvantifisering av uttrykk; derfor forventer vi optimal nøyaktighet. I et reelt scenario kan forskjellige HLA-alleler være assosiert med forskjellige isoformer. Senere i denne artikkelen diskuterer vi et spesifikt eksempel som vi observerte for HLA-A, i samsvar med hypotesen om at visse isoformer er eksklusive for spesifikke alleler. Ikke desto mindre, gitt at vi hovedsakelig er interessert i ekspresjonsestimatene på gennivå og HLA allelnivå, forventer vi at personaliserte sekvenser representerer en forbedring i forhold til et enkelt referansetranskriptom ved å redusere kartleggingsskjevhet.

Estimering av HLA-uttrykk fra ekte RNA-seq-data

Vi utførte ekspresjonsestimering på hel-transkriptom RNA-seq data for 96 individer, for hvilke qPCR for HLAA, -B og -C, og HLA-C overflateekspresjonsnivåer tidligere ble estimert (Kulkarni et al. 2013; Ramsuran et al. 2015, 2017), og kan brukes til å sammenligne med RNAseq-resultatene (se Fig. S2 for QC-analyser på RNA-seq-data).

Gitt den høyere nøyaktigheten til den personlige tilnærmingen i simuleringen, kontrasterer vi denne metoden for RNA-seq-baserte ekspresjonsestimater til den for andre ikke-RNA-seq-tilnærminger, men gir resultatene for de referansetranskriptombaserte tilnærmingene i "Tilleggsinformasjon. " Vi personaliserte transkripsjonssekvensene gitt de individuelle HLA-genotypene oppnådd ved Sanger-sekvensering. Vi kjørte HLApers (Aguiar et al. 2019) og Kourami (Lee og Kingsford 2018) for å utlede alleler direkte fra RNA-seq-dataene og bekrefte Sanger-anropene (se "Materialer og metoder").

Gen-nivå ekspresjonsestimatene viser at HLA-B har det høyeste uttrykket blant HLA loci i vårt datasett, etterfulgt av HLA-C og HLA-A (fig. 2A). Denne rekkefølgen samsvarer med GTEx-helblodsdatasettet (GTEx Consortium 2020) og med en tidligere HLA-fangst RNAseq-metode brukt på PBMC-er (Yamamoto et al. 2020). Imidlertid skiller dette mønsteret seg fra det som ble sett av Boegel et al (2018), som observerte lignende nivåer på tvers av gener ved å bruke en annen strategi for å håndtere lesingskartlegging til flere loci, noe som kan bidra til mangelen på distinksjon på tvers av loci når det gjelder uttrykksnivå ). Fremtidige studier vil måtte erte fra hverandre bidraget fra forskjeller i metodikk eller celletypesammensetning til disse forskjellene.

Sammenligning av RNA-seq og qPCR på ekte data

Vi sammenlignet deretter RNA-seq ekspresjonsestimater med de oppnådd med qPCR (fig. 2B). Selv om korrelasjonen mellom RNA-seq og qPCR-ekspresjon var statistisk signifikant for alle gener (p=0.024, 0.002, 0.000000016, for HLA-A, -B og -C, henholdsvis Spearmans test for positiv assosiasjon), var størrelsen på korrelasjonene beskjedne for HLA-A og -B, og høyere for -C. Bruken av en personlig referanse for RNA-seq økte korrelasjonen med qPCR moderat sammenlignet med en standardreferanse (fig. S3). Dette stemmer overens med vår tidligere observasjon om at ekspresjonsestimater på gennivå ikke er vesentlig forskjellig mellom referansegenombaserte eller personaliserte tilnærminger for HLA klasse I-gener (Aguiar et al. 2019), med den største fordelen med personlige tilnærminger er estimatene ved HLA allelnivå, som vi utforsker nedenfor. Bruken av skjevhetskorreksjon hos laks (GC-skjevhet, sekvensspesifikk skjevhet og posisjonsspesifikk skjevhet) forbedrer korrelasjonen med qPCR, med størst effekt for HLA-B (sammenlign fig. 2B og S4, for korrigerte og ukorrigerte data, henholdsvis).

Sammenligning av mRNA-nivåer med overflateuttrykk

Fordi RNA-uttrykk er informativt om de første trinnene i cellesignalering og respons på stimuli, kan analyse av forholdet til nedstrøms molekylære fenotyper (som proteinuttrykk på celleoverflaten) hjelpe oss å forstå rollen til post-transkripsjonell og post-translasjonell regulering på HLA uttrykk. Det forventes forskjeller mellom RNA- og proteinmengder siden de er gjenstand for distinkte reguleringsmåter. Tekniske effekter kan også introdusere forskjeller siden RNA- og proteinteknikker er forskjellige og påvirkes av ukorrelerte typer feil (Li og Biggin 2015; Kaur et al. 2017; Carey et al. 2019). Videre, i tilfellet med vår studie, ble genuttrykk målt på totale PBMC-er, mens proteinuttrykk ble målt på sorterte CD3 pluss-celler. Med denne forskjellen i tankene målte vi i hvilken grad HLA-protein på celleoverflaten kan forutsies ved mRNA-ekspresjon. Denne analysen ble utført utelukkende for HLA-C siden det er det eneste lokuset som et antistoff som kan binde alle alleler med like affiniteter er tilgjengelig for. Interessant nok var det en høy korrelasjon mellom mRNA og proteinekspresjon for HLAC, med en litt høyere korrelasjon for RNA-seq (fig. 2C).

HLA allel-nivå uttrykk

HLA-gener inneholder regulatoriske elementer assosiert med konstitutiv transkripsjon og dynamisk aktivert transkripsjon (René et al. 2016). Som et resultat varierer HLA-uttrykk på tvers av vev og kan moduleres av regulatoriske nettverk utløst av ulike stimuli (Anderson 2018; Carey et al. 2019). Det er økende interesse for å forstå om distinkte HLA-alleler er assosiert med ulike basale ekspresjonsnivåer og regulatoriske programmer (Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020), og om denne variasjonen bidrar til sykdomsfenotyper eller transplantasjonsutfall (Petersdorf et al. al. 2014, 2015; René et al. 2016; Bettens et al. 2022; Johansson et al. 2022). Derfor ble HLA allel-nivå ekspresjonsestimater for qPCR og RNA-seq sammenlignet. Fordi individuelle alleler ofte er ganske sjeldne i datasettet, grupperte vi dem etter alleliske linjer (dvs. grupper av alleler som er fylogenetisk definert av forholdet mellom eksoner) (Elsner et al. 2002).

Vi rangerte avstamninger i henhold til deres ekspresjonsnivåer basert på både RNA-seq og qPCR-data og vurderte samsvaret mellom rangeringer på tvers av metoder (fig. 3). Vår personlige RNA-seq-tilnærming gir direkte estimater på allelnivå, siden HLA-allelsekvenser brukes til å indeksere justeringene, så vi bestilte alleliske avstamninger i henhold til deres medianekspresjonsnivåer. Fordi våre qPCR-ekspresjonsestimater er på gennivå og ikke direkte gir allelnivåestimater, bestilte vi allel-avstamninger i henhold til deres effekter i en lineær modell av ekspresjonsnivåer forklart av HLA-genotypen (se Ramsuran et al. 2015). I fig. 3 er ekspresjonsverdiene plottet to ganger for hvert nivå for hver allel til individet, og for qPCR er det ganske enkelt gennivåuttrykket plottet to ganger, noe som gjenspeiler tilstedeværelsen av to alleler.

Rekkefølgen av ekspresjonsestimater er mer lik mellom RNA-seq og qPCR for HLA-C enn den er for -A og -B (gjennomsnittlig absolutt ordensforskjell, der rekkefølgeforskjell refererer til den observerte forskjellen i posisjoner innenfor en rangert rekkefølge av ekspresjonsverdier , mellom RNA-seq og qPCR kvantifisering, på 2,3 for HLA-C, 3,1 for -A og 3,9 for -B), etter et lignende mønster av en samsvar med det for ekspresjon på gennivå, som vi fant den høyeste korrelasjonen for mellom RNA-seq og qPCR for HLA-C.

Blant avstamningene med størst forskjell mellom RNA-seq og qPCR er A*11. Vi målte overflateekspresjon på en undergruppe av heterozygoter for A * 03 eller A * 11 ved å bruke et antistoff som har lik affinitet for begge linjer og observerte at qPCR korrelerer mer robust med celleoverflateekspresjon av disse to allotypene enn RNA-seq (fig. S5). Deretter presenterer vi en mer omfattende evaluering av allelbestillinger gjennom sammenligninger med tidligere studier av HLA mRNA-uttrykk.

Mens det er interesse for å sammenligne uttrykksforskjeller mellom HLA-alleler, viser ulike studier at variasjonen i uttrykk innenfor en allel eller allellinje ofte er ganske høy, og forskjeller mellom alleler av forskjellige rangerer er ofte små og ikke-signifikante. Som en konsekvens kan det være urealistisk å forvente opprettholdelse av rangeringer på tvers av flere alleler, og det kan være å foretrekke å sammenligne ekspresjonsestimater for alleler ved ytterpunktene av uttrykket.

For våre RNA-seq-data sammenligner vi våre estimater med de fra to tidligere HLA-tilpassede RNA-seq-tilnærminger på PBMC-er. Det er generelt god samsvar med Yamamoto et al. (2020), hvor A*24, A*02, C*04 og C*06 er høyt uttrykt, og A*03, C*03 og B*15 er uttrykt på lave nivåer, selv om vi også ser forskjeller som f.eks. som for B*35, som ville stemme mer med våre qPCR-data. Når vi sammenligner RNA-seq-dataene våre med Johansson et al. (2021) ser vi imidlertid mange flere forskjeller, selv om de har svært små utvalg for mange avstamninger.

Vi kontrasterer også resultatene våre med resultatene fra to tidligere qPCR-studier som brukte allelspesifikke primere. Bettens et al. (2014) brukte allelspesifikke primere for noen HLAC-linjer og så C*04 og C*06 som sterkt uttrykt, mens C*07 og C*03 ble uttrykt ved lave nivåer, i samsvar med det vi har for både RNA-seq. og qPCR. René et al. (2015) brukte allelspesifikke primere for HLA-A, og observerte A*02 (høy) og A*29 (lav) ved ekstreme uttrykk, noe som stemmer mer overens med våre RNAseq-resultater enn vår qPCR; imidlertid ser vi mange forskjeller ved andre alleliske linjer

I noen tilfeller kan vi også vurdere avtale med funksjonsstudier. For eksempel viser tidligere analyser av transkripsjonsfaktorbindingsseter (TFBS) og promoteraktivitet (gjennomgått i Anderson 2018), og studier på miRNA-regulering (Kulkarni et al. 2011), at C*03 og C*07 er svakt uttrykte alleler, som stemmer overens med våre observasjoner for både RNA-seq og qPCR.

Potensielle kilder til forskjeller

Vi undersøkte deretter om prosessering av prøvene brukt for RNA-seq kunne ha bidratt til forskjellene mellom ekspresjonsestimater oppnådd med qPCR og RNA-seq.

En spesifikk bekymring var hvor lenge prøvene ble lagret i en -80 graders fryser (omtrent 4 år mellom qPCR- og RNA-seq-analysene), samt andre trinn som er spesifikke for RNA-seq-eksperimentet, inkludert tining av prøver. For å løse dette, utførte vi et andre RNAseq-eksperiment på ferskt blod som ble trukket på nytt fra 11 individer, som er en undergruppe av de 96 som ble analysert i denne studien, og vi sammenlignet ekspresjonsestimatene mellom to-tidspunktene. Selv om denne andre analysen bærer både tekniske og biologiske forskjeller angående det første RNA-seq-eksperimentet (Fig. S6A og B), er den transkripsjonsomfattende korrelasjonen i uttrykksestimater mellom tidspunkter høy (Fig. S6C).

Selv om det kan være støyende å vurdere korrelasjon med 11 individer, er korrelasjoner ved HLA-gener blant de største genmessige korrelasjonene mellom de to prøvene (fig. S6D og F). Vi beregnet også innen-individuelle allelforhold, som er forholdet mellom uttrykk mellom de to HLA-allelene til et heterozygot individ, og sammenlignet dem mellom tidspunkter. Korrelasjonen var større enn 0.94 for HLA-A, -B og -C (Fig. S6E). Derfor så vi ingen bevis for et stort bidrag fra RNA-nedbrytning for å forklare den lave korrelasjonen mellom RNA-seq og qPCR i vår opprinnelige prøve.

Et annet mulig bidrag til forskjeller mellom RNA-seq og qPCR er at spesifikk HLA-allel kan være mer partisk i den ene eller den andre metoden, i så fall vil individer som bærer slike alleler bidra til store forskjeller. For eksempel, for individer som bærer A*03, eller for homozygoter for C*07, er det et negativt forhold mellom qPCR og RNA-seq (fig. 4A).

En ytterligere kilde til forskjeller mellom metodene kan oppstå fra det faktum at vi i vår RNA-seq-tilnærming tilpasser alle Gencode-annoterte transkripsjoner for hver HLA-allel; Imidlertid er ekte transkripsjonsmangfold og dens assosiasjon med spesifikke HLA-alleler ikke godt forstått. For eksempel, Kulkarni et al. (2017) viste at A*01 og A*11 produserer kortere 3′-UTR. For å undersøke om vi kan replikere denne finansieringen i RNA-seq-dataene våre, kartla vi avlesningene til referansegenomet og korrigerte for kartlegging av skjevheter ved HLA-gener med en hla-mapper (Castelli et al. 2018). Faktisk, for individer som bærer A*01 eller A*11, viser lesedekningen ved 3′-UTR av HLA-A et kraftig fall ved ~120 bp før den kommenterte genenden (fig. S7).

Fordi transkripsjon per million (TPM)-verdier beregnes under hensyntagen til referanselengden, fører bruk av en referanse som er lengre enn den sanne transkripsjonen til en undervurdering av uttrykket. Vi forsøkte å kontrollere muligheten for slike kortere transkripsjoner ved å inkludere en versjon av hvert HLA-A-utskrift med en forkortet 3′-UTR i indeksen vår for lesejustering. Imidlertid fant vi ingen bevis for uttrykk for den kortere isoformen (Fig. S8), muligens fordi disse kortere isoformene er inneholdt i de normallengde isoformene, og Salmons implementering tildeler alle avlesninger til den større isoformen. Interessant nok avslører uttrykk på isoformnivå en isoform med en lengre 5′-UTR eksklusiv for A*11, som bidrar med en stor andel av det totale uttrykket for denne allelen (fig. S8).

Vi testet også en normalisering av uttrykksestimatene våre, der vi justerte leselengdene gitt lesedekningen som støttet en proksimal eller distal 3′-UTR-terminus (vektet gjennomsnitt av transkripsjonslengder ved å bruke lesedekning som vekter). Selv om vi observerer en gevinst på opptil 20 prosent i uttrykksnivåene for individer som bærer A*01 og/eller A*11, ser vi bare en liten forbedring i korrelasjonen med qPCR etter denne justeringen (fra rho=0. 20 i fig. 2 til rho=0.24 i fig. 4B).

A*01 og A*11 er blant allelene med de største rangeringsforskjellene mellom RNA-seq og qPCR (fig. 3), og en ufullkommen representasjon av deres tilknyttede transkripsjoner i merknaden kan introdusere skjevheter i våre RNA-seq estimater.

Til slutt kan normaliseringsmetoder som brukes for å oppnå endelige ekspresjonsestimater fra de rå qPCR-dataene også være en kilde til forskjeller mellom qPCR og RNA-se estimater. Kvantitative PCR-analyser for HLA klasse I-gener forsterker vanligvis regioner innenfor ekson 1 til 4, og standardisering ved ekspresjon av et husholdningsgen slik som B2M (2-mikroglobulin) utføres vanligvis (som tilfellet var i denne studien) ). Begrunnelsen for denne prosedyren er at hvis uttrykksnivåer er standardisert med en stabil uttrykt referanse, settes estimatene for forskjellige individer på samme skala, og dermed tillater sammenligninger på tvers av individer.

B2M koder for den lette kjeden i HLA klasse I-molekylet, og det er sannsynlig at B2M- og HLA-klasse I-gener har en viss koordinering av uttrykk, siden de deler lignende promotorarkitekturer (Kobayashi og van den Elsen 2{{1{{12} }}}12; Vijayan et al. 2019), og kan reguleres av delte transkripsjonsfaktorer (for eksempel induserer NLRC5/CITA ekspresjonen av både HLA klasse I og B2M i Jurkat-cellelinjer (Meissner et al. al. 2{{20}}10). Normaliseringen av HLA-genuttrykk ved hjelp av korrelerte verdier kan introdusere skjevheter i qPCR-estimatene våre, spesielt for HLA-B, som vi ser en høy korrelasjon med B2M-uttrykk (fig. 4C). Skalering av en variabel med en annen, men korrelert variabel kan introdusere forstyrrelse ved å bringe ekstreme verdier til midten av distribusjonen og redusere variansen; i samsvar med denne hypotesen er variasjonskoeffisientene for qPCR-dataene. 0,61 og 0,50 for henholdsvis HLA-A og -C, men faller til 0,17 for HLA-B (til sammenligning er CV-er for RNA-seq-data 0,20, 0,14 og 0,29 for HLA-A, -B og -C henholdsvis). Men ved å bruke samme qPCR-design, Ramsuran et al. (2017) normaliserte HLA-B-ekspresjon av enten B2M, GAPDH, 18 s og b-Actin-genet, og observerte svært konsistente resultater, som ikke støtter en innvirkning av B2M-normalisering til qPCR-estimatene.

Diskusjon

Pålitelige estimater av HLA-transkripsjonsuttrykk kan bidra til ulike forskningsspørsmål, og selv om sykdomsutfall ofte utforskes i sammenheng med HLA-kodingsvariasjon, vil uttrykksnivåer sannsynligvis også forklare variasjon i kliniske utfall (gjennomgått i Dendrou et al. 2018; og i Johansson et al. 2022). Ekspresjonsnivåer har også potensial til å informere beslutninger når man planlegger hematopoetisk stamcelletransplantasjon; for eksempel, hvis en perfekt match ikke er tilgjengelig i seleksjon for allogene donorer, ser det ut til at det er fordelaktig å velge de som er feilmatchet ved lavekspresjonsalleler (Petersdorf et al. 2014, 2015). Pålitelige estimater av transkripsjonsuttrykk kan også hjelpe til med identifiseringen av eQTL-er som ligger til grunn for kontrollen av HLA-uttrykk, som kan integreres i GWAS-funn, ved å spørre om kjente treff i MHC-regionen sammenfaller med eQTL-er for HLA-gener (se f.eks. tabell S6 i Aguiar et al. 2019). Mer generelt vil forbedrede estimater av HLA-transkripsjonsuttrykk hjelpe oss å forstå den genetiske arkitekturen til HLA-regulering, identifisere det relative bidraget til cis-virkende varianter (dvs. de i nærheten av HLA-genet de regulerer) og transaksjonsvarianter (de i fjerntliggende genomiske steder, inkludert på andre kromosomer). Dette vil gi informasjon om i hvilken grad variasjon i HLA-ekspresjon er en allelspesifikk egenskap kontra en interindividuell karakteristikk uavhengig av allelisk identitet (se Bettens et al. 2022).

Kvantitative PCR-teknikker har gjort oss i stand til å avdekke assosiasjoner mellom HLA-uttrykk og sykdomsfenotyper. Nylig har RNA-seq blitt den foretrukne metoden for å vurdere genuttrykk i store hel-transkriptom-datasett av forskjellige populasjoner. Å kunne trekke ut nøyaktig informasjon for HLA-uttrykk fra slike data er en viktig utfordring, og mange metoder har blitt foreslått for å nå dette målet. Imidlertid er det foreløpig ukjent i hvilken grad resultatene som kommer fra RNA-seq-analyser samsvarer med de som er akkumulert ved bruk av qPCR. Selv om disse metodene retter seg mot den samme molekylære fenotypen (RNA-overflod), skiller de seg markant i de eksperimentelle teknikkene som brukes, formene for å analysere og normalisere dataene, de bioinformatiske prosedyrene og skjevhetene de er gjenstand for.

Så vidt vi vet, inkluderte tidligere studier som sammenlignet HLA-tilpassede RNA-seq-tilnærminger med qPCR små prøver. For eksempel, Johansson et al. (2021) validerte deres HLA-målrettede RNA-seq med qPCR på bare 5 prøver ved HLA-C, og finansierte en Pearson-korrelasjonskoeffisient på 0,9, som ikke var signifikant (p=0.08) .

I denne studien sammenlignet vi kvantitative PCR- og RNA-sekv-ekspresjonsestimater for det klassiske HLA klasse I-genet HLA-A, -B og -C i et matchet sett med 96 individer. Vi fant beskjedne, men signifikante korrelasjoner i uttrykk over et utvalg på 96 individer. Gitt mangelen på en gullstandard for å sammenligne disse estimatene, kan estimeringsfeil og skjevheter knyttet til begge metodene bidra til det samlede resultatet.

Vi undersøkte effekten av ulike faktorer som kan forklare den lave korrelasjonen mellom RNA-seq og qPCR estimater, for eksempel dårlig estimering av uttrykk for spesifikke HLA alleler og normalisering av et enkelt husholdningsgen i qPCR. Resultatene våre kan ikke generaliseres til alle qPCR-design eller RNA-seq-rørledninger, som det finnes en rekke forskjellige tilnærminger for. Men så vidt vi vet, er dette den første direkte sammenligningen mellom qPCR og RNA-seq for estimering av HLA-uttrykk.

Vår studie antyder områder som krever forbedring i bestemmelsen av HLA-transkripsjonsuttrykk. Sammenligninger mellom RNA-seq og qPCR, for eksempel, bør bruke enhetlig behandling av prøver på tvers av metoder (f.eks. samme RNA-isolasjonsprotokoll, lagrings-/tinetid, RNA-integritet) for å begrense artefaktuelle forskjeller knyttet til disse metodene. Kartlegging av korte lesninger til enkeltreferansegenomer eller transkriptomer genererer skjevheter, og strategier som kartlegger lesninger som står for HLA-polymorfisme er nødvendige. Gitt at det er flere strategier for å oppnå dette (Boegel et al. 2012; Lee et al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020), vil det være nøkkelen å sammenligne relativ nøyaktighet av disse tilnærmingene.

Det er også et behov for å utvikle metoder som tar tilstrekkelig hensyn til isoformvariasjoner, ikke bare for å gi et nytt lag med informasjon, men også mer nøyaktige uttrykksestimater, siden normalisering av lesetellinger med feil transkripsjonslengde er en potensiell feilkilde. I denne sammenhengen kan langlest data, som direkte genererer full transkripsjonsinformasjon, være et kraftig verktøy (Cornaby et al. 2022). Til slutt bør kopinummervariasjon, en kjent funksjon for visse HLA-loci (f.eks. DRB), også vurderes ved kvantifisering av uttrykksnivåer.

Anerkjennelser

Vi takker Tatiana Torres (University of São Paulo), Yang Luo (Harvard Medical School), og medlemmene av Joint Biology Consortium i Boston, for deres nyttige diskusjoner.

Forfatterbidrag

Diogo Meyer, Mary Carrington, Richard M. Single og Vitor RC Aguiar bidro til studiens oppfatning og design. Materialforberedelse, datainnsamling og eksperimenter ble utført av Maureen P. Martin, Veron Ramsuran, Smita Kulkarni, Arman Bashirova, Danillo G. Augusto og Mary Carrington. Dataanalyse ble utført av Vitor RC Aguiar, Erick Castelli, Richard M. Single, Maria Gutierrez-Arcelus og Diogo Meyer. Manuskriptet ble skrevet av Vitor RC Aguiar og Diogo Meyer. Alle forfattere leste, ga bidrag og godkjente det endelige manuskriptet.

Finansiering

São Paulo Funding Agency (FAPESP, http://www.fapesp. br/en/) ga midler til DM (2012/18010-0 og 2013/22007-7) og til VRCA (2014/{{ 5}} og 2016/24734-1). National Institutes of Health, USA ga midler til DM (NIH R01 GM075091), som støttet deler av VRCA postdoc. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) og helsedepartementet, Brasil ga midler til RNA-seq-eksperimentene og forskningsreisebesøkene, som en del av et felles forslag mellom USA og Brasil tildelt MC og DM (470043/{{13} }). NIH/NIAID R01AI157850 støtter SK. VR ble finansiert av South African Medical Research Council (SAMRC) med midler fra Institutt for vitenskap og teknologi (DST); og også delvis støttet gjennom Sub-Saharan African Network for TB/HIV Research Excellence (SANTHE), et DELTAS Africa Initiative (Grant # DEL-15-006) av AAS.

Dette prosjektet har blitt finansiert helt eller delvis med føderale midler fra Frederick National Laboratory for Cancer Research, under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Innholdet i denne publikasjonen gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene eller retningslinjene til Department of Health and Human Services, og heller ikke omtale av handelsnavn, kommersielle produkter eller organisasjoner innebærer godkjenning fra amerikanske myndigheter. Denne forskningen ble delvis støttet av det intramurale forskningsprogrammet til NIH, Frederick National Lab, Center for Cancer Research.

Datatilgjengelighet

RNA-seq-dataene presentert i den nåværende publikasjonen er deponert i og er tilgjengelige fra dbGaP-databasen under dbGaP-tiltredelse phs003177.v1.p1.

Referanser

1. Aguiar VRC, César J, Delaneau O, et al (2019) Ekspresjonsestimering og eQTL-kartlegging for HLA-gener med en personlig pipeline. PLoS Genet 15:e1008091.

2. Alcina A, Abad-Grau MDM, Fedetz M et al (2012) Multippel skleroserisikovariant HLA-DRB1*1501 assosieres med høy ekspresjon av DRB1-genet i forskjellige menneskelige populasjoner. PLoS One 7:e29819.

3. Anderson SK (2018) Molekylær utvikling av elementer som kontrollerer HLA-C-ekspresjon: Tilpasning til en rolle som en killer-celle-immunoglobulinlignende reseptorligand som regulerer naturlig drepercellefunksjon. HLA 92:271–278.

4. Apps R, Meng Z, Del Prete GQ et al (2015) Relative ekspresjonsnivåer av HLA klasse-I proteiner i normale og HIV-infiserte celler. J Immunol 194:3594-3600.

5. Apps R, Qi Y, Carlson JM, et al (2013) Påvirkning av HLA-C-ekspresjonsnivå på HIV-kontroll. Science 340:87–91.

6. Arshad N, Laurent-Rolle M, Ahmed WS et al (2023) SARS-CoV-2 tilbehørsproteiner ORF7a og ORF3a bruker distinkte mekanismer for å nedregulere MHC-I overflateuttrykk. Proc Natl Acad Sci USA 120:e2208525120.

7. Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM (2007) GenABEL: et R-bibliotek for genomomfattende assosiasjonsanalyse. Bioinformatikk 23:1294–1296.

8. Bachtel ND, Umviligihozo G, Pickering S, et al (2018) HLA-C-nedregulering av HIV-1 tilpasser seg vertens HLA-genotype. PLoS Pathog 14:e1007257.

9. Bettens F, Brunet L, Tiercy JM (2014) Høy-allelisk variasjon i HLA-C mRNA-ekspresjon: assosiasjon med HLA-utvidede haplotyper. Genes Immun 15:176–181.

10. Bettens F, Ongen H, Rey G et al (2022) Regulering av HLA klasse I uttrykk ved ikke-kodende genvariasjoner. PLoS Genet 18:e1010212

11.Boegel S, Bukur T, Castle JC, Sahin U (2018) In Silico Typing of Classical and Non-classical HLA Alleles from Standard RNA-Seq Reads. Metoder Mol Biol 1802:177–191.

For more information:1950477648nn@gmail.com