Kryssreaktiv, naturlig IgG som gjenkjenner L. Major fremmer parasittinternalisering av dendrittiske celler og fremmer beskyttende immunitet

Abstrakt

Nøkkelmeldinger

• Ved å bruke forskjellige genmodifiserte mus fant vi ut at disse antistoffene kan være IgG, ikke bare IgM.

Nøkkelord

Leishmania major · Dendritisk celle · B-celle · Naturlig IgG

Introduksjon

Infeksjoner med Leishmania spp. representerer en stor belastning i endemiske land. Sykdomsmanifestasjoner spenner fra selvbegrenset kutan leishmaniasis til disseminert, tilbakevendende, mukokutan og visceral sykdom. Ubehandlet, visceral leishmaniasis er en alvorlig trussel mot vertens liv. En vaksine finnes ikke ennå. Helbredende og livslangimmunitetmot dette viktige intracellulære patogenet avhenger av utviklingen av IFN-produserende Th1/Tc1-celler, mens parasittpersistens og sykdomsprogresjon er assosiert med Th2-celledominans, regulatoriske T-celler og/eller Th17-responser. IFN-frigjøring fører til NO-produksjon som eliminerer parasittene.Beskyttende immunitetinduseres av infiserte dendrittiske celler (DC). Etter inokulering av Leishmania major i huden av sandfluen, blir promastigote parasitt livsformer inntatt av hud-residente makrofager (MΦ) og nøytrofiler. Innen MΦ forvandler parasitter seg til ikke-flagelerte amastigote livsformer og replikerer. Senere blir frigjorte amastigoter tatt opp av andre vertsceller, slik som DC. Infiserte DC behandler parasittantigener og migrerer til drenerende lymfeknuter og prime T-celler. Frigjøring av IL-12, så vel som andre cytokiner fra infisert DC, styrer Th1/Tc1-utdanning av parasittspesifikke T-celler.

Mens MΦ bruker komplementreseptor (CR)3 for parasittopptak, er Fc RI/III i DC ansvarlig forparasittinternalisering. Interessant nok, tidlig fører CR3-assosiert parasittopptak til demping av den infiserte MΦ, mens i etablerte infeksjoner induserer Fc Rmediert opptak av amastigoter av MΦ anti-inflammatorisk IL-10-produksjon som fremmer Th2/Treg-utvikling og parasittpersistens. Fc R-mediert parasittopptak i DC induserer derimot celleaktivering, CD4 T-cellepriming og også antigenkrysspresentasjon. Derfor er antistoffmediert parasittopptak av DC viktig for utviklingen av beskyttelse mot parasitten. Produksjon av anti-Leishmania IgG er dermed en forutsetning for effektiv (kryss)priming av Leishmania-spesifikke Th1/Tc1-celler. På linje, i fravær av B-celler, var sykdomsutviklingen mer alvorlig med større lesjonsvolumer, høyere parasittbelastninger, forsinket T-celle-priming og redusert IFNΓ-produksjon. Tidligere viste vi at Leishmania-spesifikk IgG var tilstede i sera på tidspunktet for DC-akkumulering i lesjoner.

Det er fortsatt et åpent spørsmål hvordan den innledende B-celleresponsen på selve parasitten utvikler seg i fravær av B-cellepriming av infisert DC. Såkalte naturlige antistoffer som gjenkjenner Leishmania spp. kan lette tidligparasitt internaliseringav DC. I tillegg, siden parasittmembraner inneholder fosfatidylserin som ligner på apoptotiske kropper,kryssreaktiveantistoffer kan spille en rolle. I denne studien vurderte vi om anti-fosfolipid-antistoffer generert, for eksempel under overdreven celledød eller naturlig IgG som gjenkjenner Leishmania tilstede i ikke-immune dyr, bidrar til parasitttaking DC for å fremme B-celle- og T-celle-priming. Vi fant at anti-fosfolipid-antistoffer fra murint eller humant serum så vel som "naturlig IgG" i normalt museserum (NMS) binder seg til Leishmania-parasitter, noe som er tilstrekkelig til å fremmeparasittinternaliseringav DC og fremmer bedre sykdomsutfall in vivo.

Materialer og metoder

Dyr

Seks til åtte uker gamle C57BL/6 mus ble kjøpt fra Janvier. B-celle-mangelfulle µMT-mus ble sjenerøst levert av Hansjörg Schild, Institute of Immunology, University Medical Center Mainz. IgGi og IgMi mus (begge på C57BL/6 bakgrunn) ble beskrevet tidligere. Alle dyrene ble holdt under spesifikke patogenfrie (SPF) forhold i Translational Animal Research Center (TARC) ved Johannes Gutenberg University, Mainz. Alle forsøk ble utført med en godkjent lisens fra dyrepleie- og brukskomiteen i regionen Rheinland-Pfalz.

I følge urtestudier har det vist seg at cistanche er en type sopp som har blitt brukt i tradisjonell kinesisk medisin i århundrer. Den er laget av tørkede stilker og stilker av soppen, som vokser i tropiske og subtropiske områder i Asia. Det er ofte vant tilforbedre immuniteten, lindre tretthet og behandle forkjølelse og andre infeksjoner.

Forskning har vist detcistanchekan øke produksjonen av antistoffer, som kan hjelpe kroppen med å bekjempe fremmede inntrengere som virus og bakterier. Det har vist seg å øke antallet og aktiviteten til T-celler, en type hvite blodceller som er ansvarlig for å hjelpe kroppen til å gjenkjenne og bekjempe skadelige inntrengere.

I tillegg har studier vist at cistanche kan redusere alvorlighetsgraden av forkjølelse, influensa og andre virusinfeksjoner. Det har vist seg å redusere tiden det tar for kroppen å komme seg etter virus- eller bakterieinfeksjoner. cistanche kan også redusere varigheten av feber forårsaket av visse virus, samt redusere risikoen for å utvikle sekundære infeksjoner.

Dessuten,cistancheer kjent for å ha anti-inflammatoriske egenskaper, som kan redusere betennelse forbundet med visse sykdommer. Studier har også vist at dendrobium kan bidra til å forbedre effektiviteten til visse antibiotika.

Klikk på Organic Cistanche Sold Near Me

For mer informasjon kontakt oss på:david.deng@wecistanche.com

Samlet sett tyder forskning på at cistanche kan være en nyttig behandling forforbedresimmunitetog bekjempe ulike infeksjoner. Det kan bidra til å forbedre kroppens naturlige forsvar, redusere alvorlighetsgraden og varigheten av sykdommer, og kan til og med redusere risikoen for å utvikle sekundære infeksjoner.

Parasitter og infeksjoner 

Amastigoter eller metacykliske promastigoter av L. major klon VI (MHOM/IL/Friedlin) ble fremstilt som tidligere beskrevet. Amastigoter ble isolert fra infiserte ører av BALB/c- eller B-celle-mangelfulle µMT-mus som beskrevet tidligere. Isolerte parasitter ble opsonisert med 5 prosent NMS, IMS eller anti-PL i 10 minutter ved 37 grader og vasket før in vitro eller in vivo infeksjoner.

Sera, IgG-anriking og parasittbindingsanalyse

Normalt museserum (NMS) ble generert fra naive C57BL/6-mus, mens immunserum (IS) ble tatt fra helbredede mus som var infisert med 2 × 10E5 metasykliske promastigoter av L. major for større enn eller lik til 6 uker. Antifosfolipidantistoff (PL) sera ble generert ved gjentatt immunisering med apoptotiske tymocytter. Før serum ble høstet, ble immuniseringssuksess verifisert ved å vurdere spesifikk IgG-binding til apoptotiske celler via flowcytometri eller i en -glykoproteinspesifikk ELISA. Grupper av C57BL/6-mus ble immunisert med rekombinant 2-glykoprotein (2G) i nærvær av Freuds adjuvans (FA); serum som inneholdt anti- 2G ble høstet etter 4 uker. Anti-Leishmania IgG Større enn eller lik 5–6-ukers L. major-infiserte BALB/c-mus, PL- eller b2G-spesifikke IgG, ble fremstilt fra sammenslåtte sera ved bruk av protein G-kolonner (Pierce Chemical Co.) følge produsentens protokoll. Sera ble lagret ved -20 grader før IgG-rensing. Renset IgG ble lagret ved 4 grader (0,8 mg/ml) i PBS før bruk.

Normalt humant serum (NHS) var fra friske kontrollpersoner og serum som inneholdt anti-Leishmania-antistoffer ble hentet fra kutan leishmaniasis (LM)-pasienter fra Marokko. Serum fra pasienter med antifosfolipidsyndrom (PL) ble også brukt.

Parasitter (promastigoter eller amastigoter) ble farget for overflateassosiert Ig ved bruk av isotypespesifikke sekundære antistoffer som er reaktive med muse-Ig: anti-IgM (Serotec), anti-IgG1 (A85-1) og anti-IgG2a/b ( R2-40, alle fra BD Biosciences). Etter farging ble parasitter vasket med PBS/2 prosent BSA, fiksert og analysert ved flowcytometri.

In vitro stimulering

Benmargsavledet DC ble generert i RPMI/5 prosent FCS-medier supplert med IL-4 (10 µg/mL) og GM-CSF (10 µg/mL) i 6 dager som tidligere beskrevet. Celler ble høstet på dag 6 som umoden DC. 2 × 105 DC ble dyrket sammen med opsoniserte amastigoter fra infiserte BALB/c eller µMT mus eller dyrket med opsoniserte metacykliske promastigoter (MOI 1:5) i 18 timer. Etterpå ble celler høstet og cytospin ble generert som tidligere beskrevet. DifQuick-fargede celler ble analysert for tilstedeværelse av intracellulære og ekstracellulære parasitter. Minst 200 celler ble talt per prøve.

In vivo infeksjoner

Lesjonsvolumer ble målt ukentlig i tre dimensjoner og rapporteres som ellipsoider [(a/2×b/2×c/2)×4/3×π]. Parasitter tilstede i lesjonsvev ble talt opp ved å bruke en begrensende fortynningsanalyse som tidligere beskrevet.

For måling av antigenspesifikk cytokinproduksjon ble drenerende LN-celler fra infiserte C57BL/6-mus gjenvunnet og enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt. Én million LN-celler/200 μL komplett RPMI 1640 (Biochrome) ble tilsatt 96-brønnplater i nærvær av 25 ug/mL SLA. Supernatanter ble høstet 48 timer etter stimulering og analysert ved bruk av ELISA-er spesifikke for IFNΓ (FoU-systemer), samt IL-4 og IL-10 (BD).

Myeloid human DC infisert med opsoniserte parasitter

Myeloid human CD1c pluss DC (hDC) ble isolert fra perifert blod i henhold til produsentens instruksjoner ved bruk av et magnetisk celleisolasjonssystem og BDCA-1 human DC isolasjonssett (Miltenyi, Tyskland). 1,5 × 107 celler ble belagt i 2,5 ml RPMI 1640/2 prosent autologt plasma. For å berike renheten ble cellene vasket med varm PBS og til slutt dyrket med X-VIVO 15/plasma (1 prosent) supplert med rekombinant human IL-4 (150 U/mL) og GM-CSF (400 U/mL) . Umoden hDC ble høstet på dag 6. 2 × 105 hDC ble dyrket sammen med opsoniserte amastigoter fra infiserte µMT-mus eller dyrket med opsoniserte metacykliske promastigoter (MOI 1:5) i 18 timer. Etterpå ble celler høstet og cytospin ble generert som tidligere beskrevet. DifQuick-fargede celler ble analysert for tilstedeværelse av intracellulære og ekstracellulære parasitter. Minst 200 celler ble talt per prøve.

Statistisk analyse

Statistisk analyse ble utført ved bruk av StatView-programvare og uparet Students t-test.

Resultater

Serum som inneholder antifosfolipidantistoff binder seg til L. major

Siden parasitter kan komme inn i vertsceller via en prosess som kalles "apoptotisk mimikk" og fordi L. store livsformer uttrykker fosfolipider på overflaten deres, genererte vi serum som inneholder antifosfolipidantistoffer (PL) ved bruk av etablerte protokoller. For dette formål ble grupper av C57BL/6-mus infisert med L. major, immunisert med apoptotiske tymocytter i nærvær av Freuds adjuvans (FA). Siden 2-glykoprotein (2G) er det primære antigenet i antifosfolipidsyndrom (APS), immuniserte vi også mus med 2G i nærvær av FA for å oppnå serum som inneholder anti- 2G-antistoffer. Som kontroller ble normalt museserum (NMS) fra uinfiserte C57BL/6-mus og immunserum (IS) fra L. major-infiserte mus brukt.

For å teste om disse forskjellige musesera fra naive eller immuniserte mus inneholder antistoffer som binder seg til L. major, vurderte vi først antistoffbinding til parasittantigen ved ELISA, ved å bruke L. major promastigote fryse-tine lysat (løselig Leishmania antigen, SLA) som substrat. (Fig. 1A, svarte søyler). Som standard brukte vi IgG isolert fra sera fra L. major-infiserte mus. Interessant nok inneholdt IS så vel som PL-serum sammenlignbare nivåer av antistoffbinding til Leishmania-lysat, som var 3–4 ganger høyere sammenlignet med binding observert med NMS eller sera fra mus immunisert med adjuvans alene. I tillegg er serum som inneholder 2G-antistoffer også bundet til SLA. Ved å bruke en ELISA spesifikk for 2G (hvite kolonner), identifiserte vi høye nivåer av 2G-IgG i serumet, mens 2G IgG-nivåer i alle andre sera var under deteksjonsgrensen.

Fig. 1 Detection of L. major cross-reactive antibodies in serum of mice containing antiphospholipid antibodies. Serum was obtained from groups of C57BL/6 mice that were left untreated (normal mouse serum, NMS) or which were infected for>6 uker med 2× 105 L. major (immunserum, IS). En annen gruppe ble gjentatte ganger immunisert med apoptotiske tymocytter (anti-fosfolipid Ab, a-PL) eller rekombinant 2-glykoprotein (a- 2G) i nærvær av ufullstendig Freuds (FA) adjuvans, FA ble brukt som kontroll. Et serum ble testet for reaktivitet i en ELISA ved bruk av L. major-lysat som et substrat eller 2-glykoprotein. ELISA ble utviklet ved bruk av anti-murin IgG. Data er uttrykt som gjennomsnitt (±SEM, n større enn eller lik 1). B Metacykliske promastigoter av L. major ble oppnådd fra kulturer i stasjonær fase (n{{10}}). C Amastigoter ble fremstilt fra lesjoner av B-celle-mangelfulle µMT-mus (n=3). B- og C-parasittpreparater ble opsonisert med forskjellige sera (5 prosent, 10 min, 37 grader). Antistoffbinding ble vurdert av FACS med sekundære anti-mus-antistoffer. Bindingen av Ig ble beregnet ut fra grunnlinjenivåer av uopsoniserte parasitter (*p mindre enn eller lik 0,05, **p mindre enn eller lik 0,005 og ***p mindre enn eller lik 0,002)

Deretter inkuberte vi infeksiøst stadium metasykliske promastigoter av L. major med forskjellige konsentrasjoner av IgG anriket fra IS, PL eller 2G sera. Vi observerte en doseavhengig binding av IS- og 2G-avledet IgG med et maksimum på 100 ng/ml (fig. 1B). Binding av PL-avledet IgG til promastigotes av L. major ble ikke påvist.

I tillegg inkuberte vi L. major amastigotes isolert fra lesjoner av B-celle-mangelfulle µMT-mus med de forskjellige sera i 10 min. Parasitter ble deretter grundig vasket, og etterpå ble det overflatebundne antistoffet påvist ved flowcytometri etter merking med PE-konjugert anti-IgG1, antiIgG2a/b eller anti-IgM (fig. 1C). Som forventet inneholdt IS Leishmania-spesifikk IgM, IgG1 og IgG2a/b. Vi bekrefter også tidligere arbeid, da vi oppdaget Leishmania-spesifikk IgM i bassenget av såkalt "naturlig Ab". Interessant nok fant vi også IgG og IgM i PL-serum så sterktkryssreagertemed overflaten til L. major amastigotes. Anti- 2IgG-antistoffer som inneholder antistoffer bandt seg ikke til Leishmania, men 2G-serumet inneholdt IgMkryssreagerermed amastigote overflater.

Kryssreaktive antistoffer medierer parasittinternalisering av DC

Vi hadde deretter til hensikt å vurdere om de forskjellige IgG-antistoffene som er i stand til å binde seg til overflaten av L. major amastigotes er funksjonelt aktive. Derfor genererte vi DC ved å bruke kulturer av benmargsceller (BM) supplert med GMCSF og IL-4. BM-DC ble høstet som umodne celler på dag 6 og sådd ut med 2 x 105 celler/ml. Parasitt-amastigoter avledet fra infiserte fotputer av villtype BALB/c- eller B-celle-mangelfulle µMT-mus ble opsonisert med forskjellige sera (5 vol prosent), grundig vasket og deretter tilsatt DC i et parasitt/celle-forhold på 5:1. Etter 18 timer ble cellene høstet, vasket og cytospin.

Parasittinternaliseringble bestemt på DifQuickstained lysbilder ved 100× (fig. 2). Som beskrevet ble opptak av parasitter isolert fra µMT-mus betydelig svekket. Pre-inkubasjon med NMS økte parasittopptaket noe, mens inkubasjon med IS førte til "normalisering" av DC-infeksjonsrater til nivåer observert med BALB/c-avledede amastigoter. Merk at parasittopsonisering med PL også betydelig og klart forbedret DC-infeksjonsratene med ~100 prosent. I tråd med de lavere nivåene av IgG-opsonisering av amastigoter med b2G-holdig serum (sammenlign Fig. 1C), økte dette også infeksjonsraten av DC, men i mindre grad.

Fig. 2Opsonisering av L. major med kryssreaktive antistoffer fører til økt parasittopptak av DC. Umoden C57BL/6 BMDC(2× 105) ble dyrket sammen med amastigoter fra BALB/c- eller B-celle-mangelfulle µMT-mus (1:3). Før saminkubering ble amastigoter opsonisert med normalt museserum (NMS), immunserum (IS), serum som inneholder anti-fosfolipidantistoffer oppnådd ved gjentatt immunisering med apoptotiske tymocytter (aPL), eller serum som inneholder anti- 2 glykoprotein antistoffer (2G). Etter 18 timer ble infeksjonsrater bestemt på cytospin ved lysmikroskopi (n=3, *p Mindre enn eller lik 0.05,**p Mindre enn eller lik 0,005, og ***p Mindre enn eller lik 0,002 sammenlignet med uopsoniserte kontroller)

Kryssreaktive anti-fosfolipidantistoffer forbedrer sykdomsutfall ved kutan leishmaniasis

I påfølgende eksperimenter ønsket vi å vurdere om parasittopsonisering medkryssreaktiveantistoffer endrer sykdomsutfall in vivo. For dette formål ble metasykliske promastigoter isolert og beriket fra parasittkulturer opsonisert med forskjellige sera som beskrevet ovenfor. Parasitt opsonisert med NMS fungerte som en negativ kontroll. Etter omfattende parasittvasking ble grupper på fem C57BL/6-mus infisert intradermalt med 103 L. major. Lesjonsutvikling ble overvåket i ~4 måneder. I tråd med tidligere funn, induserte parasitter opsonisert med IS mindre ørelesjoner i tråd med en økt frekvens av infisert hud DC på tidlige tidspunkter (fig. 3). Overraskende nok fremmet parasitter opsonisert med PL eller 2G tilsvarende forbedrede sykdomsutfall som bestemt av 50 prosent reduserte lesjonsvolumer mellom uke 5 og 8 etter infeksjon.

Kryssreaktive anti-fosfolipidantistoffer forbedrer sykdomsutfall ved kutan leishmaniasis

I påfølgende eksperimenter ønsket vi å vurdere om parasittopsonisering medkryssreaktiveantistoffer endrer sykdomsutfall in vivo. For dette formål ble metasykliske promastigoter isolert og beriket fra parasittkulturer opsonisert med forskjellige sera som beskrevet ovenfor. Parasitt opsonisert med NMS fungerte som en negativ kontroll. Etter omfattende parasittvasking ble grupper på fem C57BL/6-mus infisert intradermalt med 103 L. major. Lesjonsutvikling ble overvåket i ~4 måneder. I tråd med tidligere funn, induserte parasitter opsonisert med IS mindre ørelesjoner i tråd med en økt frekvens av infisert hud DC på tidlige tidspunkter (fig. 3). Overraskende nok fremmet parasitter opsonisert med PL eller 2G tilsvarende forbedrede sykdomsutfall som bestemt av 50 prosent reduserte lesjonsvolumer mellom uke 5 og 8 etter infeksjon.

Deretter brukte vi µMT amastigoter inkubert med 100 µg IgG anriket fra NMS, IS eller PL (fig. 4). Igjen, vi observerte at både IgG fra IS eller PL resulterte i mildere sykdom med mindre lesjoner, sammenlignet med uopsoniserte parasitter (fig. 4A). På linje avslørte parasittbelastninger av lesjonsvev som bestemt i uke 6 etter infeksjon (signifikant) mindre parasittbelastninger i infeksjoner initiert i nærvær av parasittbindende antistoffer (fig. 4B). Antigenspesifikk restimulering av drenerende lymfeknuteceller med SLA avslørte uendrede nivåer av IFN, mens lavere nivåer av IL-4 og IL-10 ble funnet i de musene infisert med IgG-opsoniserte parasitter (fig. 4C) . Dette er i tråd med reduserte lesjonsstørrelser siden tidligere arbeid viste at eliminering av parasitt hos mus er avhengig av aktivering av infisert MΦ av lesjons-IFN, som motvirkes av IL-4 og – veldig viktig – IL-10 . Som sådan førte IL-10-effekter på infisert MΦ til parasittpersistens. Dermed ser forholdet mellom IFN på den ene siden og Th2/Treg-assosierte cytokiner som IL-4 og IL-10 ut til å være mest relevant for sykdomsutfallet.

Interessant nok ble det imidlertid også observert mindre lesjonsvolumer i denne settingen når IgG fra NMS ble brukt til opsonisering som indikerte tilstedeværelse avkryssreaktivenaturlige antistoffer i serumet til naive mus også.

Både Leishmania-spesifikke og kryssreaktive antistoffer kan erstatte den genetiske mangelen på IgG

For bedre å analysere det spesifikke bidraget til immunglobulin-subtyper i responsen på Leishmania, brukte vi IgMi- og IgG1i-mus vi tidligere har generert. IgMi-mus er mus der alle B-celler uttrykker IgM, men ikke kan klassebytte eller skille ut antistoffer. I IgG1i-musene utvikler alle B-celler ved å bruke IgG1 som deres B-cellereseptor, men disse cellene kan heller ikke klassebytte, men er i stand til å skille ut IgG1-antistoffer. Vi infiserte IgMi og IgG1i mus på C57BL/6 genetisk bakgrunn med 103 L. major. Vi fant at tilstedeværelsen av IgG1 i seraet var tilstrekkelig for at musene kunne få full respons på parasitten, lik villtypedyrene (fig. 5A). I motsetning til dette var fraværet av utskilte antistoffer som sett i IgMi-musene tilstrekkelig til å forsinke gjenopprettingen av musene (fig. 5A).

Deretter rekonstituerte vi IgMi-musene eller villtypekontrollene med enten NMS eller IS og infiserte dem deretter med L. major promastigotes. Som forventet, i begge musestammer, induserte IS-rekonstitusjon betydelig mindre lesjoner in vivo, noe som bekrefter at IgG-mediert akselerert parasittopptak av DC fremmer forbedret anti-Leishmaniaimmunitet(Fig. 5B). Til slutt vurderte vi sykdomsutfall etter bruk av opsoniserte parasitter. Før infeksjon av IgMi-mus ble parasitter opsonisert med IgG anriket fra NMS-, IS- eller PL-serum (fig. 5C). I tråd med eksperimentet vist i fig. 5B, forenklet IS-opsoniserte parasitter forbedret parasittforsvar. Igjen var antifosfolipidantistoffer i stand til å erstatte Leishmania-spesifikk IgG fra IS ved at begge IgG-antistoffene bundet til L. major promastigotes før infeksjon fremmet bedre sykdomsutfall hos IgMi-mus. IS- og PL-opsoniserte parasitter induserte betydelig mindre lesjonsvolumer og tidligere helbredelse sammenlignet med uopsoniserte parasitter.

Det er viktig at administrering av NMS til IgMi-mus "normaliserte" deres fenotype til sykdomsutfall observert i C57BL/6-mus (fig. 5B). Disse funnene er i tråd med våre data vist ovenfor, noe som tyder på at NMS også inneholder enkryssreaktiveantistoff IgG isotype som er i stand til å binde seg til parasitter med påfølgende funksjonelle konsekvenser in vitro og in vivo. Ytterligere bekreftelse kommer fra IgMi-mus infisert med NMS-belagte parasitter, som også var i stand til å bedre kontrollere infeksjon (fig. 5C).

Fig. 4Antistoff-opsoniserte parasitter induserer effektiv immunitet i B-celle-mangelfulle µMT. Parasitter ble opsonisert med normalt museserum (NMS), immunserum (IS), serum som inneholdt antifosfolipidantistoffer (a-PL), eller - kun C57BL/6 mus - serum som inneholdt anti- 2 glykoproteinantistoffer (2G) i tilstedeværelse av Freuds adjuvans (FA). Grupper av større enn eller lik 5 µMT mus ble infisert med 103 opsoniserte metacykliske promastigoter av L. major. Lesjonsutvikling ble vurdert ukentlig. B I uke 6 ble skadelige parasittmengder av infiserte µMT-mus bestemt ved begrensende fortynningsanalyse. Individuelle parasittnummer vises; barer uttrykke betyr. C Cytokinprofiler for drenerende µMT LN-celler ble bestemt ved restimulering med løselig Leishmania-antigen (SLA). IFNΓ, IL{{10}} og IL-10 frigjøring i 48-h supernatanter ble vurdert ved ELISA (gjennomsnitt±SEM, n=15 mus/gruppe fra uavhengige 3 eksperimenter, *p Mindre enn eller lik 0.05, **p Mindre enn eller lik 0.005 og ***p Mindre enn eller lik 0.002 sammenlignet med mus infisert med uopsoniserte parasitter)

Humant serum inneholder de funksjonelt aktive, parasittkryssreaktive antistoffene

For å teste relevansen av funnene våre for mennesker, ble promastigoter eller amastigoter isolert fra B-celle-mangelfulle µMT-mus opsonisert med normalt humant serum (NHS), serum fra L. major-infiserte pasienter (LM) eller serum fra APS-pasienter (APS). ). Overflatebundet IgG på parasitter ble bestemt ved bruk av flowcytometri. Interessant nok bandt LM-serum seg svakt til overflaten av promastigoter, men sterkt til amastigoter. Interessant nok inneholdt APS-serum lignende nivåer av IgGkryssreaktivemed parasittoverflater (fig. 6A).

IgG ble deretter anriket fra LM-sera ved bruk av protein A-kolonner (fig. 6B). Denne og forskjellige konsentrasjoner av intravenøse immunglobuliner (IVIG) brukt til behandling av ulike (immune) lidelser hos pasienter ble deretter brukt til parasittopsonisering før flowcytometri. Leishmania IgG er signifikant bundet til promastigoter og amastigoter av L. major. Interessant nok inneholdt kommersielt tilgjengelig IVIG IgG somkryssreagertebåde med promastigote så vel som amastigote parasittpreparater.

Til slutt ble CD1c pluss primær myeloid human DC fra buffy coats inkubert med µMT amastigoter av L. major inkubert med LM-serum eller serum fra APS-pasienter eller IVIG (MOI 3; Fig. 7). Ved å bekrefte våre murine data ved å bruke humane celler observerte vi at tilstedeværelsen av IgG (kryssreaktiveeller Leishmania-spesifikk) på Leishmania-overflater er tilstrekkelig til å fremme forbedretparasittinternaliseringav DC. APS-serum økte prosentandelen av infisert DC med nesten 100 prosent, mens LM-serum og IVIG økte parasittopptaket med 30 prosent sammenlignet med uopsoniserte parasitter. Interessant nok inneholdt NMS-serum også parasittreaktivt IgG-fremmendeparasittinternalisering.

Fig. 5 C57BL/6-, IgMi- og IgGi-mus rekonstituert med forskjellige sera eller infisert med forskjellige rensede IgG-opsoniserte L. major viser forbedrede sykdomsutfall. En gruppe på mer enn eller lik 5 C57BL/6-, C57BL/6 IgMi- eller IgGi-mus ble infisert med fysiologisk lavdose-inokula av L. major (103 metacykliske promastigoter). B En uke før infeksjon ble C57BL/6 og B6 IgMi-mus rekonstituert ip to ganger med 100 µL enten normalt museserum (NMS) eller immunserum (IS). C Før infeksjon av IgMi-mus ble parasitter opsonisert med IgG anriket fra sera ved binding til protein A-kolonner [normalt museserum (NMS), immunserum (IS) eller serum som inneholder antifosfolipidantistoffer (a-PL)]. A–C-lesjonsutvikling ble vurdert ukentlig (gjennomsnitt±SEM, n=10 mus/gruppe fra uavhengige 2 eksperimenter, *p Mindre enn eller lik 0,05, **p Mindre enn eller lik 0,005, og *** p Mindre enn eller lik 0,002 sammenlignet med C57BL/6 [A], C57BL/6 eller IgMi [B], eller ingen [C])

Fig. 6Antifosfolipidantistoffer i humane sera kryssreagerer med L. major-overflatemolekyler. Metacykliske promastigoter fra kulturer i stasjonær fase eller lesionale amastigoter av L. major isolert fra µMT-mus ble opsonisert med forskjellige typer humane sera (5 prosent) eller renset IgG. Normale humane sera (NHS) ble oppnådd fra friske kontrollpersoner. Sera fra pasienter med påvist kutan leishmaniasis (LM, ervervet i Marokko, n=4) og fra pasienter med antifosfolipidsyndrom (PL, n=3) ble også brukt. B IgG ble anriket fra LM-sera ved bruk av protein A-kolonner (n=3). Ulike konsentrasjoner av intravenøse immunglobuliner (IVIG, n=2) ble brukt (µg/ml). A- og B-parasitter ble analysert for overflatebinding av totalt humant Ig ved bruk av flowcytometri. Bindingen av Ig ble beregnet i forhold til grunnlinjenivåer av uopsoniserte parasitter (gjennomsnitt ±SEM, *p Mindre enn eller lik 0.05, **p Mindre enn eller lik {{10 }}.005, og ***p Mindre enn eller lik 0,002)

Diskusjon

Helbredelse fra kutan leishmaniasis krever effektiv T-celle-priming og IFN-frigjøring, som begge er avhengige av infisert DC for å presentere antigener til naive T-celler. I motsetning til CR3-avhengig fagocytose av MΦ, har vi vist detparasittinternaliseringav DC skjer via Fc RI og Fc RIII, som kan erstatte hverandre. Som sådan utviklet Fc-, FcRI/Fc RIII-mangelfulle mus og B-celle-mangelfulle µMT-mus (alle på C57BL/6-bakgrunn) større lesjoner og forsinket tilheling, sammenlignet med villtypemus, på grunn av svekket DC- avhengig T-celle-priming. Vår nåværende studie bekrefter denne tidligere observasjonen, men i tillegg antyder dataene våre ved bruk av IgMi- og IgGi-mus at faktisk utskilte antistoffer, og ikke bare tilstedeværelsen av B-celler, er avgjørende for å få en effektiv respons på parasitten. Som sådan, i likhet med B-celle-mangelfulle mus, viste IgMi-mus med B-celler som ikke var i stand til å produsere IgG større lesjonsstørrelser sammenlignet med IgGi-musene eller villtypemusene.

Fordi både NMS og IS-opsoniserte amastigoter ble tatt opp i lignende grad og NMS-opsoniserte promastigoter ikke ble fagocytert av DCs (med effektiv binding av IgM til overflaten), konkluderte vi tidligere med at IgM ikke er nødvendig for parasittopptak. I denne studien var vi i stand til å bekrefte disse funnene ved å bruke normale musesera hos mus som enten mangler B-celler helt eller bare utskiller antistoffer. Videre var vi i stand til å vise at IgG1-inneholdende sera var i stand til å forbedre inntreden av amastigoter til både menneskelig og muse-DC.

Det forble uløst hvordan den første B-celleresponsen utvikler seg i fravær av infisert DC. En mulighet var at i bassenget av "naturlig" IgG,kryssreaktiveantistoffer kan være i stand til å gjenkjenne parasitter og tjene som erstatninger for Leishmania-spesifikke antistoffer som utvikles senere (stiger mellom uke 4 og uke 6 etter infeksjon). I tillegg til antigenspesifikke antistoffer produseres såkalte naturlige antistoffer av B-1-celler i både mus og mennesker etter fødselen. Noen har evnen til å gjenkjenne selvantigener; i lang tid ble det antatt at de mangler spesifisitet for fremmede antigener. Senere ga data bevis for naturlig IgM som gjenkjenner forskjellige mikrobielle antigener og bidrar til eliminering av patogener. Nylig har imidlertid flere studier avslørt at naturlig IgG spiller en rolle imedfødt immunitetogså. Det ble vist å samhandle med patogenassosierte lektiner (f.eks. MBL), og danne immunkomplekser for å fjerne patogenene. Patogenbundet naturlig IgG forventes også å samhandle med andre PRR-er, slik som C1q, for å aktivere den klassiske komplementveien. Det ble vist at naturlig IgG spesifikt samarbeider med patogenassosierte lektiner for å fremkalle en effektiv antimikrobiell virkning mot opportunistisk Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus-infeksjon.

Under apoptotisk celledød observeres fosfatidylserin (PS) eksponering på apoptotiske legemer. Vertsgjenkjenning av PS på overflaten av døende eller døde celler via antistoffer er et viktig skritt i deres klaring. I en prosess som kalles "apoptotisk mimikk", er Leishmania-parasitter kjent for å også eksponere PS på sin egen overflate som fungerer som et "spis-meg"-signal for fagocytiske celler, lik det som ses av apoptotiske celler. Videre dør noen av promastigotene i infeksjonsstadiet (uten involvering av caspaser) og avslører PS selv. Obligate intracellulære amastigote livsformer, men alle eksponerer PS på overflaten slik at de kan komme inn i vertsceller effektivt. Vi har nå vurdert om kunstig induserte PL-antistoffer er i stand til å gjenkjenne Leishmania-parasitter, og om disse er funksjonelt aktive for å lette parasittinntreden i relevante vertsceller. Vi observerte at murine og humane anti-fosfolipid-antistoffer binder Leishmania-livsformer. Ved å bruke ulike tilnærminger identifiserte vikryssreaktiveantistoffer i PL-serum som ser ut til å fortrinnsvis binde seg til overflatefosfolipider av L. major. Interessant nok, selv om promastigote-parasitter også uttrykker disse fosfolipidene som vist ved bruk av løselig parasittantigen fra denne parasittens livsform i en ELISA, ser overflatefosfolipider ut til å være sterkere eksponert på amastigoter. I tillegg viste vi at denne IgG-opsoniseringen var tilstrekkelig til å fremme parasittopptak av DC. Viktigere, in vivo induserte PL-opsoniserte parasitter et forbedret sykdomsutfall med mindre lesjonsvolumer og tidligere lesjonsoppløsning. Således, i tråd med tidligere observasjoner fra vår gruppe, på grunn av økt DC-infeksjon i nærvær av(kryssreaktiv)IgG på parasittene, en foretrukket induksjon av Th1/Tc1-celler ble indusert assosiert med redusert antall Th2- og Treg-celler, og dermed bedre sykdomsutfall.

Fig. 7Primær myeloid DC fra humant blod internaliserer fortrinnsvis parasitter medkryssreaktiveantifosfolipid IgG bundet til overflaten deres. CD1a pluss myeloid human DC ble isolert fra buffy coats ved bruk av MACS-kuler og belagt med 2 × 1 05 celler/ml. Amastigoter isolert fra µMT-mus ble inkubert med 5 prosent serum eller 10 µg/mL IVIG før samkubasjon med DC (1:3). Etter 18 timer ble infeksjonsrater bestemt på cytospins ved lysmikroskopi (n=3, *p Mindre enn eller lik 0,05 og ***p Mindre enn eller lik 0,002 sammenlignet med uopsoniserte kontroller)

Interessant nok fant vi at parasitter opsonisert med NMS fremmet bedre sykdomsutfall sammenlignet med uopsoniserte parasitter som indikerer tilstedeværelsen av naturlig IgG i NMS som er i stand til å gjenkjenne Leishmania. Dette var best synlig i IgMi (fri for B-celler som er i stand til å produsere noe IgG) substituert med NMS. Her ble de klart større lesjonsstørrelsene til IgMi-mus redusert til den for villtype C57BL/6-mus (fig. 5). Men tilstedeværelsen av naturlig, LeishmaniakryssreaktiveIgG ble også observert i villtype mus infisert med NMS-opsoniserte parasitter sammenlignet med uopsoniserte parasitter. Spesifisiteten til disse naturlige IgG i murint og humant serum er foreløpig uklart. Det er fristende å spekulere i at dette også er antistoffer som gjenkjenner PS på parasittoverflater siden de fortrinnsvis binder seg til amastigoter med kjent høyere eksponering av PS sammenlignet med promastigoter også.

Vi fant at serumet til friske menneskelige kontrollpersoner (fra en region hvor leishmaniasis bare er rapportert som en reisesykdom og ingen historie med tidligere infeksjon) også inneholdt IgG som var i stand til å binde seg til L. major amastigotes og fremme forbedret parasittopptak av DC. Det er viktig å merke seg at IVIG som ble brukt for vår studie er utarbeidet i Tyskland (ikke-endemisk for leishmaniasis). Interessant nok inneholdt beriket humant IgG fra IVIG fra Leishmania-negative individer dermed IgG som var i stand til å binde både promastigoter og (sannsynligvis på grunn av høyere PS-eksponering) L. major amastigotes. På linje inneholdt serumet til APS-pasienter med høye nivåer av antifosfolipidantistoffer IgG som fortrinnsvis bundet til amastigoter, mindre til promastigoter. Både IgG fra APS-sera så vel som IgG fra IVIG fremmet forbedret parasittopptak av primær human DC i en grad som var sammenlignbar (eller enda bedre i tilfellet med PL-holdige APS-sera) med immunserumavledet IgG fra leishmaniasispasienter.

Oppsummert viser dataene våre at normale musesera så vel som menneskelige sera, til og med tatt fra individer som aldri har blitt eksponert for Leishmania, inneholder IgG-antistoffer som er i stand til å binde seg til denne parasitten, forenkle dens oppsluking av DC-er og forsterke en beskyttende immunrespons av parasitten. vert. Selv om det eller de gjenkjente Leishmania-antigenene ikke er helt klare, kan noe av reaktiviteten være rettet mot fosfolipider som er mer rikelig på amastigot, sammenlignet med promastigotoverflater. Funnene våre kan bane vei for å utforme bedre terapi for denne parasitten og kan til og med tjene som en førstelinje-forholdsregel for personer som reiser til Leishmania-infiserte områder.

Anerkjennelser

Forfatterne takker oppriktig Mark C. Udey og Philipp von Landenberg for de nyttige diskusjonene og for å gi pasientprøver.

Forfatterbidrag 

FD, SLK og ST utførte eksperimentene beskrevet i dette manuskriptet. ST, AW og EvS sikret finansieringen av prosjektet og ledet arbeidet. AW og EvS skrev manuskriptet.

Finansiering

Open Access-finansiering aktivert og organisert av Projekt DEAL. Studien ble støttet av midler fra DFG (SFB 490 til EvS og AW og SFB 1292 til EvS, AW og ST) og Senter for molekylær medisin (CMMC) Köln til EvS.

Tilgjengelighet av data og materialer 

Ikke aktuelt.

Erklæringer

Etikkgodkjenning og samtykke til å delta

Alle eksperimenter med mus ble utført i henhold til veiledningen fra delstaten Rheinland Pfalz.

Samtykke til publisering

Alle forfattere samtykker til publisering.

Konkurrerende interesser

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Open Access Denne artikkelen er lisensiert under en Creative Commons Attribution 4.0 International License, som tillater bruk, deling, tilpasning, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium eller format, så lenge du gir passende kreditt til den opprinnelige forfatteren (s) og kilden, oppgi en lenke til Creative Commons-lisensen, og angir om endringer ble gjort. Bildene eller annet tredjepartsmateriale i denne artikkelen er inkludert i artikkelens Creative Commons-lisens med mindre annet er angitt i en kredittgrense til materialet. Hvis materiale ikke er inkludert i artikkelens Creative Commons-lisens og din tiltenkte bruk ikke er tillatt av lovbestemt regulering eller overskrider tillatt bruk, må du innhente tillatelse direkte fra opphavsrettsinnehaveren.

Referanser

1.Burza S, Croft SL, Boelaert M (2018) Leishmaniasis Lancet 392:951–970.

2. von Stebut E, Tenzer S (2018) Kutan leishmaniasis: distinkte funksjoner av dendrittiske celler og makrofager i samspillet mellom vertens immunsystem og Leishmania major. Int J Med Microbiol 308:206–214.

3. Sacks D, Noben-Trauth N (2002) Immunologien til mottakelighet og resistens mot Leishmania major hos mus. Nat Rev Immunol 2:845-858.

4. de Freitas ESR, von Stebut E (2021) Avdekke rollen til immunkontrollpunkter i leishmaniasis. Front Immunol 12:620144.

5. Schonlau F, Scharfetter-Kochanek K, Grabbe S, Pietz B, Sorg C, Sunderkotter C (2000) I eksperimentell leishmaniasis mangel på CD18 resulterer i parasittspredning assosiert med endrede makrofagfunksjoner og ufullstendig Th1-cellerespons.Eur J Immunol 30: 2729–2740.

6. Woelbing F, Kostka SL, Moelle K, Belkaid Y, Sunderkoetter C, Verbeek S, Waisman A, Nigg AP, Knop J, Udey MC, et al (2006) Opptak av Leishmania major av dendritiske celler medieres av Fcgamma-reseptorer og letter anskaffelsen av beskyttende immunitet. J Exp Med 203:177–188

7. Nagele EP, Han M, Acharya NK, DeMarshall C, Kosciuk MC, Nagele RG (2013) Naturlige IgG-autoantistoffer er rikelig og allestedsnærværende i menneskelige sera og deres antall påvirkes av alder og kjønn og sykdom. PLoS ONE 8:e60726.

8. Lutz HU, Binder CJ, Kaveri S (2009) Naturlig forekommende autoantistoffer i homeostase og sykdom. Trender Immunol 30:43–51.

9. Wanderley JL, Barcinski MA (2010) Apoptose og apoptotisk mimikk: Leishmania-forbindelsen. Cell Mol Life Sci 67:1653–1659.

10. Waisman A, Croxford AL, Demircik F (2008) Nye verktøy for å studere rollen til B-celler i cytomegalovirusinfeksjoner. Med Microbiol Immunol 197:145-149

11. Von Stebut E, Ehrchen JM, Belkaid Y, Kostka SL, Molle K, Knop J, Sunderkotter C, Udey MC (2003) Interleukin 1alpha fremmer Th1-differensiering og hemmer sykdomsprogresjon i Leishmania major-følsomme BALB/c-mus. J Exp Med 198:191–199

12. Levine JS, Subang R, Nasr SH, Fournier S, Lajoie G, Wither J, Rauch J (2006) Immunisering med et apoptotisk cellebindende protein rekapitulerer nefritten og sekvensiell autoantistofffremvekst av systemisk lupus erythematosus. J Immunol 177:6504-6516.

13. Wanderley JLM, DaMatta RA, Barcinski MA (2020) Apoptotisk mimikk som en strategi for etablering av parasittiske infeksjoner: parasitt- og vertsavledet fosfatidylserin som et nøkkelmolekyl. Cell Commun Signal 18:10.

14.McDonnell T, Wincup C, Buchholz I, Pericleous C, Giles I, Ripoll V, Cohen H, Delcea M, Rahman A (2020) Rollen til beta-2-glykoprotein I i helse- og sykdomsassosierende struktur med funksjon : mer enn bare APS. Blood Rev 39:100610.

15. Dominguez M, Torano A (1999) Immunadherensmediert opsonofagocytose: mekanismen for Leishmania-infeksjon. J Exp Med 189:25–35.

16. Belkaid Y, Hofmann KF, Mendez S, Kamhawi S, Udey MC, Wynn TA, Sacks DL (2001) Rollen til interleukin (IL)-10 i vedvarende Leishmania major i huden etter helbredelse og terapeutisk potensial for anti-IL-10-reseptorantistoff for steril kur. J Exp Med 194:1497–1506.

17. Waisman A, Kraus M, Seagal J, Ghosh S, Melamed D, Song J, Sasaki Y, Classen S, Lutz C, Brombacher F et al (2007) IgG1 B-cellereseptorsignalering hemmes av CD22 og fremmer utviklingen av B-celler hvis overlevelse er mindre avhengig av Ig{alfa}/{beta}. J Exp Med 204:747–758

18. Panda S, Ding JL (2015) Naturlige antistoffer bygger bro med medfødt og adaptiv immunitet. J Immunol 194:13-20.

19. Puga I, Cerutti A (2013) Beskyttelse med naturlig IgG: et søtt partnerskap med løselige lektiner gjør susen! EMBO J 32:2897–2899.

20. Duncan AR, Winter G (1988) Bindingssetet for C1q på IgG. Nature 332:738–740.

21. Panda S, Zhang J, Tan NS, Ho B, Ding JL (2013) Naturlige IgG-antistoffer gir medfødt beskyttelse mot kolon-opsoniserte bakterier. EMBO J 32:2905–2919.

22. El-Hani C, Borges V, Wanderley JL, Barcinski M (2012) Apoptose og apoptotisk mimikk i Leishmania: et evolusjonært perspektiv. Front Cell Infect Microbiol 2:96.

For mer informasjon kontakt oss på:david.deng@wecistanche.com tel:0013632399501