Påvisning av forhøyet nivå av tetrahydrobiopterin i serumprøver av ME/CFS-pasienter med ortostatisk intoleranse: en pilotstudie

Abstrakt:Myalgisk encefalomyelitt eller kronisk utmattelsessyndrom (ME/CFS) er en multisystem kronisk sykdom karakterisert ved alvorlig muskeltretthet, smerte, svimmelhet og hjernetåke. Mange pasienter med ME/CFS opplever ortostatisk intoleranse (OI), som er preget av hyppig svimmelhet, svimmelhet og svimmelhet mens de opprettholder en oppreist holdning. Til tross for intens etterforskning er den molekylære mekanismen til denne svekkende tilstanden fortsatt ukjent. OI er ofte manifestert av kardiovaskulære endringer, som redusert cerebral blodstrøm, redusert blodtrykk og redusert hjertefrekvens. Biotilgjengeligheten til tetrahydrobiopterin (BH4), en essensiell kofaktor for endotelial nitrogenoksidsyntase (eNOS) enzym, er tett koblet med kardiovaskulær helse og sirkulasjon. For å utforske rollen til BH4 i ME/CFS, serumprøver av CFS-pasienter (n=32), CFS-pasienter med kun OI (n=10; CFS + OI), og CFS-pasienter med både OI og småfiber polynevropati (n=12; CFS + OI + SFN) ble utsatt for BH4 ELISA. Interessant nok avslørte resultatene våre at BH4-uttrykket er betydelig høyt i CFS-, CFS + OI- og CFS + OI + SFN-pasienter sammenlignet med alders-/kjønnsmatchede kontroller. Til slutt indikerte en ROS-produksjonsanalyse i dyrkede mikrogliaceller etterfulgt av Pearson-korrelasjonsstatistikk at den forhøyede BH4 i serumprøver av CFS + OI-pasienter kan være assosiert med den oksidative stressresponsen. Disse funnene tyder på at reguleringen av BH4-metabolismen kan være et lovende mål for å forstå den molekylære mekanismen til CFS og CFS med OI.

Cistanche kan fungere som en anti-tretthets- og utholdenhetsforsterker, og eksperimentelle studier har vist at avkok av Cistanche tubulosa effektivt kunne beskytte leverhepatocytter og endotelceller skadet i vektbærende svømmende mus, oppregulere uttrykket av NOS3 og fremme hepatisk glykogen syntese, og utøver dermed anti-tretthetseffekt. Phenylethanoid glykosid-rik Cistanche tubulosa-ekstrakt kan redusere serumkreatinkinase, laktatdehydrogenase og laktatnivåer betydelig, og øke hemoglobin (HB) og glukosenivåer i ICR-mus, og dette kan spille en anti-tretthetsrolle ved å redusere muskelskaden. og forsinke melkesyreanrikningen for energilagring hos mus. Compound Cistanche Tubulosa Tabletter forlenget den vektbærende svømmetiden betydelig, økte den hepatiske glykogenreserven og reduserte serumureanivået etter trening hos mus, noe som viste dens anti-tretthetseffekt. Avkoket av Cistanchis kan forbedre utholdenhet og akselerere eliminering av tretthet hos trenende mus, og kan også redusere økningen av serumkreatinkinase etter belastningstrening og holde ultrastrukturen til skjelettmuskulaturen til mus normal etter trening, noe som indikerer at det har effektene. for å øke fysisk styrke og anti-tretthet. Cistanchis forlenget også overlevelsestiden til nitrittforgiftede mus betydelig og forbedret toleransen mot hypoksi og tretthet.

Klikk på Over fatigue

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Nøkkelord:ME/CFS; tetrahydrobiopterin; ortostatisk intoleranse; liten fiber polynevropati; endotelial NOS; reaktive oksygenarter

1. Introduksjon

Myalgisk encefalomyelitt/kronisk utmattelsessyndrom (ME/CFS) er en kronisk multisystemsykdom som er preget av svekkende muskeltretthet, smerte, svimmelhet og hjernetåke [1,2]. En undergruppe av ME/CFS-pasienter viser alvorlig ortostatisk hypotensjon [3] karakterisert ved et betydelig blodtrykksfall som forårsaker svimmelhet og besvimelse mens de står i oppreist tilstand [4]. Denne tilstanden kalles ofte ortostatisk intoleranse (OI). En undergruppe av OI-pasienter oppfyller også de diagnostiske kriteriene for småfiberpolynevropati [5,6] som er diagnostisert ved bruk av kongorød farging for amyloidose i hudbiopsiprøver [7]. Til tross for intens undersøkelse er den molekylære mekanismen til OI ikke kjent.

BH4 er en viktig kofaktor for aminosyremetabolismen [8]. Aminosyrer, som fenylalanin, tyrosin og tryptofan, omdannes til viktige cellulære mellomprodukter ved virkningen av hydroksylaseenzymer. BH4 fungerer som en essensiell kofaktor for alle disse hydroksylaseenzymene [9–11]. Følgelig er biotilgjengeligheten av BH4 kritisk for syntesen av nevrotransmittere, som dopamin og serotonin [10]. Bortsett fra disse hydroksylaseenzymene, regulerer BH4 også funksjonen til nitrogenoksidsyntaseenzymer og kontrollerer produksjonen av nitrogenoksid (NO) i endotelet [12]. Endotelproduksjon av NO øker den vasodilatative responsen, senker blodtrykket og hjelper muskelavslapping [13,14]. På den annen side, i nærvær av oksidativt stress, kobles BH4 fra eNOS-indusert NO-produksjon [15] og forsterker direkte den mitokondrielle stressresponsen i hjertevev [16] og skjelettmuskulatur [17]. Derfor er reguleringen av BH4-metabolismen avgjørende for kardiovaskulær funksjon og sirkulasjonshelse. Siden OI-pasienter er rapportert å vise kardiovaskulære abnormiteter, er vi interessert i å studere om OI-pasienter har endret BH4-metabolisme. Til nå har det ikke vært noen studie som undersøker rollen til BH4-metabolisme i CFS. Videre undersøker vår studie også om CFS-pasienter med OI har endret BH4-biosyntese.

Serumprøver av 66 personer ble inkludert i studien med n=32 CFS og n=34 kontroller. En dobbeltblindet kvantitativ ELISA ble utført for å sammenligne BH4-nivåer mellom friske kontroller og CFS-pasienter. Interessant nok observerte vi at det var en sterk oppregulering av BH4 hos CFS-pasienter sammenlignet med friske kontroller. Mens vi sammenlignet nivået av BH4 mellom CFS-pasienter med OI (n=10) og alders-/kjønnstilpassede kontroller (n=10), observerte vi også at CFS-pasienter med OI hadde et betydelig høyere nivå av BH4 i serum. Samlet fremhever vårt nåværende manuskript at økningen av serum BH4 hos CFS-pasienter kan spille en kritisk rolle i patogenesen av OI.

2. Resultater

Emner inkludert i studien: For å kvantifisere BH4-nivåer i serumprøver ble totalt 66 mennesker inkludert i studien. Tabell 1 oppsummerer alder, kjønn, etnisitet og allerede eksisterende forhold for disse fagene. Fire personer fra kontrollgruppen hadde kreftrelaterte komplikasjoner og ble derfor ekskludert fra den endelige analysen. Minimum, median og maksimum alder for kontrollgruppen er henholdsvis 18, 64,5 og 82 år. For CFS-gruppen er disse verdiene 26, 59 og 76 år. Et frekvensfordelingsplott av alder i begge gruppene viste en lignende skjevhet og en påfølgende Bland-Altman-analysetest viste at gjennomsnittet av forskjellene var nær null, noe som tyder på at det ikke er noen skjevhet angående alder. Kontrollgruppen besto av 44 % menn og 56 % kvinner, mens CFS-gruppen besto av 41 % menn og 59 % kvinner. Alle pasientene var kaukasiere og bodde i den geografiske regionen Nord-Nevada og California.

ME/CFS-pasientpopulasjonen ble registrert basert på de kanadiske 2003- og Fakuda-kriteriene for ME/CFS. De oppfylte også diagnosekriteriene for SCID (ME/CFS sitt nye navn etablert av Institute of Medicine). Kontrollene ble alder/kjønn matchet med CFS-personer som også ble invitert sammen med pasienter i Dr. Petersons Internal Medicine Clinic.

CFS + OI og CFS + OI_SFN-undersett ble etablert via diagnostiske testregistreringer (gjennomgang av medisinsk skjema) og klinisk korrelasjon. For eksempel presenterte personer med OI på kontoret en modifisert positiv NASA magert test (som viser OI) og alle fikk IV volumekspansjonsterapi (saltvann). SFN-pasienter hadde biopsiprøver. For de inkluderte CFS + OI + SFN-personene ble Mass General Hospital-rapporten registrert, der kongorød farging for å telle neuritttetthet ble utført i det laterale ankelmuskelvevet.

BH4-nivået er høyt i serumprøvene til ME/CFS-pasienter: Totalt ble 32 CFS og 34 kontrollpersoner inkludert i studien (tabell 1) for å måle serum BH4-nivåer ved konkurrerende ELISA. Standardkurven til BH4 ELISA var en eksponentiell kurve for negativ helning som ble utledet fra seks økende konsentrasjoner av BH4-standarder (5, 10, 25, 50, 10{{52 }} og 150 ng/ml). Helningen og skjæringspunktet til standardkurven ble brukt til å måle absolutte nivåer av BH4 fra OD-verdien. En seriefortynning av serumprøver etterfulgt av BH4 ELISA-analyse viste at en 1:2 fortynning av serum ga de mest kontrasterende resultatene sammenlignet med blank eller bakgrunn. Derfor ble alle serumprøver utsatt for 1:2 fortynning. Interessant nok, en dobbeltblindet ELISA-analyse etterfulgt av en ikke-parametrisk Mann–Whitney U-test [* p < 0,05 (=0.033); U=304.5] viste at nivåene av BH4 var signifikant høyere hos n=32 CFS-pasienter sammenlignet med n=28 kontrollpersoner (figur 1A). Fire forsøkspersoner (n=4) i kontrollgruppen ble ekskludert på grunn av deres allerede eksisterende kreft. Siden forsøkspersoner ble inkludert tilfeldig uavhengig av alder og kjønn, ønsket vi deretter å analysere korrelasjonen av BH4-nivå med alderen og kjønnet til forsøkspersonene. Følgelig avslørte en ikke-parametrisk Spearman-korrelasjonsanalyse (Figur 1B) at det ikke var noen sammenheng mellom BH4-nivå og alderen på forsøkspersonene (Spearman r=-0,1657; p=0.1835). Deretter sammenlignet vi nivået av BH4 mellom mannlige og kvinnelige forsøkspersoner (figur 1C). For å vurdere betydningen mellom mann og kvinne (effektor #1 er kjønn), samt mellom kontroll og CFS (effektor #2 er helsetilstand), ble det utført en toveis ANOVA-analyse. Følgelig viste ikke mannlige og kvinnelige forsøkspersoner noen signifikant forskjell i BH4-nivåer (p > 0,05; =0.3496). Imidlertid var det en signifikant forskjell i BH4 mellom kontroll- og CFS-personer (p < 0,05; =0.0375) uavhengig av kjønnsforskjellen.

Siden den nåværende kohorten er strengt begrenset under samme geografiske område, etnisitet og fra en enkelt leges praksis, ville en parvis sammenligningsanalyse av BH4 mellom tilfeller og kontroller som matcher alder og kjønn være mer avgjørende. Totalt 15 par ble sammenlignet (figur 1D). En ikke-parametrisk Wilcoxon matchet-par signert rangtest avslørte at CFS-pasienter hadde signifikant høyere BH4 (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >alfa ({{0}}.05)]. Siden alle CFS- og kontrollprøver ble matchet med alder og kjønn, ble det utført en parvis sammenligningsanalyse. Den påfølgende parede t-testen (t1,9=3.834; **p < 0.01=0.004) indikerte at CFS + OI serumprøver hadde signifikant høyere BH4 sammenlignet med kontrollserumprøver (Figur 2C ). En kumulativ kolonnestatistikktest (figur 2D) viste videre at 7 av 10 CFS + OI-pasienter hadde signifikant høyere BH4-nivåer enn medianen (=99.63 ng/ml). På den annen side hadde bare 2 av 10 kontrollpersoner høyere BH4 enn medianverdien. Samlet antyder disse dataene at CFS + OI-pasienter hadde signifikant høyere BH4 sammenlignet med kontrollpersoner.

En undergruppe av CFS-pasienter (n=12) har både OI og SFN. En sammenligning av BH4-nivåer (Figur 3A) mellom frisk kontroll og CFS + OI + SFN-personer viste at CFS + OI + SFN-pasienter hadde et signifikant høyere nivå av BH4 [t1,22=2.371; * s<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Mens vi sammenlignet BH4-nivåer mellom CFS alene og CFS + OI-pasienter, observerte vi at serumprøver av CFS + OI-pasienter (n=14) hadde høyere nivåer av BH4 (Figur 4A) sammenlignet med kontrollpersoner (n {{ 6}}). QQ-plottanalysen viser at fordelingen av data er normal i begge gruppene (Figur 4B), noe som tyder på at den parametriske testen kan brukes for å sammenligne gjennomsnitt. Følgelig avslørte en uparet t-test for å analysere betydningen av gjennomsnittet mellom grupper en sterk forskjell [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Kolonnestatistikk for den valgte kohorten (n=22) indikerte at 9 av 14 CFS + OI-pasienter hadde høyere serum BH4-nivåer sammenlignet med en median på 119,7 ng/ml (Figur 4C). Samlet antyder resultatene våre at CFS-pasienter med OI har forhøyede nivåer av BH4 i serum. Samlet identifiserer vårt nåværende manuskript BH4 som en potensiell blodbåren biomarkør for CFS + OI og CFS + OI + SFN-pasienter.

Forhøyede BH4-nivåer kan være assosiert med økt oksidativt stress: For å forstå den funksjonelle betydningen av forhøyet BH4 i serum, undersøkte vi den ROS-induserende evnen til serumprøver av CFS-pasienter med OI (n=10). DCFDA-infunderte mikrogliaceller ble behandlet med 1:2 fortynnede serumprøver fra 1 0 CFS + OI og 10 alders-/kjønnstilpassede kontroller i 90 minutter etterfulgt av måling av ROS-produksjonen ved hjelp av en fluorescensplateleser (eks: Em { {12}} nm/535 nm) som beskrevet i material- og metodedelen. Som vi tidligere har rapportert [18], indikerte en histogramanalyse at den ROS-produserende kapasiteten til CFS + OI serumprøvene var signifikant høyere enn kontrollserumprøvene (Figur 5A) [t1,18=2.541; p < 0,05 (=0.0205)]. Siden alle datapunkter i begge gruppene var normalfordelt (Figur 5B), utførte vi en parametrisk test for å studere betydningen av gjennomsnittet mellom grupper. Interessant nok viste en Pearson-korrelasjonsstatistisk analyse i denne kohorten at det eksisterte en moderat positiv korrelasjon mellom BH4-nivåer og ROS-produksjon, noe som tyder på at forhøyede BH4-nivåer i CFS + OI-serumprøver kan være assosiert med en økt oksidativ respons (Figur 5C).

Samlet sett fremhever vårt nåværende manuskript at CFS-pasienter er assosiert med forhøyede nivåer av BH4 i serum og at oppregulering ble mer signifikant observert hos CFS-pasienter med OI. Dessuten kan den forhøyede BH4 være assosiert med den oksidative stressresponsen som fremhever en potensiell rolle av BH4-metabolisme i patogenesen til CFS og CFS med OI (Figur 5D).

3. Diskusjon

Tetrahydrobiopterin (BH4) biosyntese er en tett regulert metabolsk prosess i helse, og dens unormale uttrykk er knyttet til en rekke sykdommer. Dens mangel fører til metabolsk underskudd av aminosyremetabolisme [19,20], svekkelse av dopaminregulering [21] og svekkelse av blodstrøm [22,23] og er assosiert med hypertensjon, diabetes, aterosklerose, aldring og andre metabolske forstyrrelser. På den annen side svekker oppregulert BH4-biosyntese mitokondriell energiproduksjon [24], induserer oksidativt stress [25], og forsterker autofagi svekkelse [26]. Forhøyet BH4 er også knyttet til en reduksjon i blodtrykk [27] ved å indusere den vasodilatative responsen via aktivering av endotelial NOS [28]. Derfor kan oppregulert biosyntese av BH4 direkte fremme reduksjonen i blodtrykk eller hypotensjon. En studie tyder på at mangelen på BH4 demper LPS-indusert hypotensjon hos mus [23]. Inntil nå har ikke rollen til BH4-metabolisme blitt utforsket hos CFS-pasienter, spesielt CFS-pasienter med OI. Derfor var målet vårt å vurdere serum BH4-ekspresjonen i denne pasientpopulasjonen. Overraskende nok viste ELISA-analysen vår at serumprøver fra CFS-pasienter hadde signifikant høyere nivåer av BH4 sammenlignet med alders- og kjønnstilpassede friske kontrollpersoner. Følgelig indikerte Spearman korrelasjonsstatistikk at det ikke var noen signifikant korrelasjon av BH4-oppregulering med hensyn til verken alder og kjønn, noe som opphever mulighetene for enten alders- eller kjønnsrelatert svekkelse av BH4-biosyntese hos disse pasientene.

Deretter observerte vi at serumprøvene av CFS + OI-pasienter også viste en sterk økning av BH4 sammenlignet med serumprøvene til alders- og kjønnsmatchede kontroller. Vår kumulative kolonnestatistikk viste at 7 av 10 CFS + OI-pasienter hadde bemerkelsesverdig høye nivåer av BH4, noe som tyder på at serumøkningen av BH4 kan være knyttet til patogenesen av OI. Resultatet ble ytterligere bekreftet da en undergruppe av CFS + OI-pasienter med småfiberpolynevropati (SFN) også viste høy ekspresjon av BH4 i serumprøvene deres sammenlignet med kontrollene med alder og kjønn. Interessant nok viste en sammenligning av serum BH4-nivåer mellom bare CFS og CFS-pasienter med OI at det var signifikant forhøyede nivåer av BH4 hos OI-pasienter.

Hvordan bidrar forhøyet BH4 til patogenesen av ME/CFS? Det er flere veier som forhøyet BH4 direkte kan bidra til patogenesen av ME/CFS (Figur 5D). For det første er BH4-oppregulering rapportert å forårsake mitokondriell svekkelse av energimetabolismen via hemming av kompleks I og IV i elektrontransportkjeden, noe som resulterer i reduksjon i mitokondriell membranpotensial, frigjøring av cytokrom C og apoptose [24]. BH4-eksponering er også rapportert å forårsake oksidativt stress [29]. Selv om BH4 fysiologisk støtter endotelial NO-produksjon ved eNOS-aktivering, kobler oksidasjon av BH4 av superoksid det fra eNOS, noe som gir oksidativt stress til hjertevev og påvirker kardiovaskulær helse (Figur 5C). Til støtte viste resultatene våre at de forhøyede nivåene av BH4 i CFS + OI serumprøver hadde en positiv korrelasjon med ROS-induserende evner. Dessuten aktiverer BH4 også pattedyrmål for rapamycinkompleks1 (mTORC1) kinase for å svekke autofagi. Tidligere rapporterte vi at aktiveringen av mTORC1 og påfølgende svekkelse av autofagi kan være assosiert med ME / CFS-patogenese. Både mTORC1-avhengig svekkelse av autofagi [18] og mitokondriell mangel på energimetabolisme [30] har blitt rapportert å bidra til patogenesen av ME/CFS. Derfor kan en økning av BH4-nivået i serumprøver av ME/CFS-pasienter indusere oksidativt stress og forsterke eNOS-frakobling, etterfulgt av kardiovaskulært stress, hypotensjon, mitokondriell toksisitet og autofagi-svekkelse hos CFS-pasienter.

4. Materialer og metoder

Prøveanskaffelse: Prøveanskaffelse, avidentifikasjon og lagringsplan ble diskutert før [18]. Kort fortalt ble blodprøver og spørreskjemadata samlet inn under tilsyn av Dr. Daniel Peterson (Sierra Internal Medicine, Incline Village, NV, USA) (Western IRB) #20201812. Blodprøver ble sentrifugert, og serumprøver ble alikvotert og deretter umiddelbart frosset ved -80 ◦C. Hver prøve ble gitt et unikt identifikasjonsnummer og registrert både i en notatbok og Microsoft Excel med dato og signatur i henhold til den IRB-godkjente protokollen. Prøver ble deretter levert til vårt forskningsanlegg i Wisconsin på tørris over natten. Ved mottak ble prøver behandlet og analysert umiddelbart. Spørreskjema og avidentifiserte kliniske data lagres i en sikker Redcap-serverdatabase med begrenset tilgang administrert av forskningsstaben og klinisk stipendiat ved Sierra Internal Medicine. Pasientjournaler ble opprettholdt av retningslinjer for personvern fastsatt av Sierra Internal Medicine. Undergrupper av ME/CFS-pasienter i OI- og OI + SFN-gruppene ble etablert ved hjelp av blinddiagramgjennomgang, og post-laboratorieanalyse ble bekreftet av den kliniske PI. De fire kreftpasientene ble blindt inkludert i denne analysen og fungerte som en sykdomspositiv kontroll.

De diagnostiske kriteriene for OI inkluderte relevante funn (resultater fra hjertetilttabellen) fra klinisk kartgjennomgang. I tillegg, på tidspunktet for blodinnsamling, fullførte den kliniske stipendiaten en NASA-lean-analyse. SFN-diagnose ble etablert via en klinisk kartgjennomgang og histologisk undersøkelse av en hudpunchbiopsi samlet fra pre-tibial-regionen. Hudbiopsier ble uavhengig vurdert ved Massachusetts General Hospital for morfometrisk kvantifisering av epidermale nerveender for å studere neuritttettheten til hudoverflaten.

BH4 Competitive ELISA: BH4-nivå ble målt og kvantifisert i serumprøver av ME-CFS-pasienter og alderstilpassede friske kontroller i henhold til produsentens instruksjoner (Human BH4 konkurrerende ELISA-sett; Leverandør: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, USA; Katt # MBS733839). Settet ble validert i laboratoriet vårt (Perkin Elmer Victor X3 multimodal plateleser, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) og hadde en standardkurve (R2=0.98) og følsomhet så lav som 1 ng/mL konsentrasjon om den positive kontrollen. Kort fortalt ble serumprøver fortynnet med analysefortynningsmiddel (eller 1 x PBS) og deretter pipettert på en mikroplate som var forhåndsbelagt med polyklonalt anti-BH4-antistoff. Etter 30 minutters inkubering med prøven ble BH4-HRP-konjugat tilsatt til platen og inkubert i ytterligere 1 time ved 37 ◦C. De resterende serumprøvene ble dekantert og vasket på platen med 1 x vaskebuffer (alternativt med 1 x PBS-T) tre ganger i fem minutter hver ved bruk av en flerkanalspipette. Etter vasking ble hver brønn reagert med TMB-substrat i 10 minutter i mørket. Utviklingen av farge finner sted etter 10 min med substratinkubasjon under risteforhold. BH4-HRP-konjugatet ville konkurrere med serum BH4 om å binde seg til det belagte primære antistoffet. Derfor, jo mer serum BH4 i en prøve, jo mindre BH4-HRP-binding vil oppstå og dermed generere mindre farge. Totalt 66 serumprøver (34 kontroll + 32 ME-CFS-pasienter) ble ervervet (detaljer i avsnittet "anskaffelse av prøver") med riktige institusjonelle regulatoriske retningslinjer og analysert under GLP-forhold. Prøvefordelingen var tilfeldig, og analysen var dobbeltblindet, som beskrevet under avsnittet "Begrunnelse for prøvestørrelse".

Prøvestørrelsesbegrunnelse og statistisk analyse: Prøvestørrelse ble begrunnet ved hjelp av følgende ligning. Prøvestørrelse {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z er z-poengsum, som er 1,28 for potens 0.8. p er befolkningsandelen; for et 95 % konfidensintervall vil p være {{20}}.95. ε er feilmarginen, som er 0,05. For å oppnå signifikans i gjennomsnittsforskjellen mellom grupper ved p < 0,05, ble derfor totalt n=32 prøver per gruppe inkludert. For sammenligningen mellom kontroll- og CFS + OI-pasienter ble n=10 prøver per gruppe inkludert. En lignende prøvestørrelse ble inkludert under sammenligning av kontroll- og kontroll- +OI + SFN-grupper. Prøvestørrelsesberegningen ble utført basert på ε=0.05 og p=0.99. En ikke-parametrisk Mann–Whitney U-test ble tatt i bruk for å teste betydningen av gjennomsnittet mellom de to gruppene når de to gruppene viste identiske og normale datafordelinger; ellers ble en parametrisk uparet t-test utført. For paret analyse mellom grupper ble det utført en parametrisk paret t-test hvis datapunkter fra begge gruppene var normalfordelt; ellers ble det utført en Wilcoxon rangtest for å evaluere betydningen mellom grupper. En toveis ANOVA med post hoc Bonferroni eller Tukey ble brukt for å teste betydningen av gjennomsnittet i mer enn to grupper som vurderer kjønn (mann eller kvinne) og helse (sunn eller CFS) som effektorer. Alle statistiske analyser ble utført i GraphPad Prism versjon 9.5.1 (733) programvare (Boston, MA 02110, USA).

ROS-analyse:HMC3 humane embryonale mikrogliaceller ble dyrket og passert med komplette DMEM-medier. Kort fortalt ble HMC3-celler belagt i en 96-brønns plate for ROS-fluorometrisk studie. Celler ble dyrket til 75–80 % konfluens og inkubert med en DCFDA-probe (Cat# ab113851; Abcam, Cambridge, Storbritannia) i 45 minutter ved 37 ◦C i mørket. Standardmediet ble erstattet med 100 µL (1:2 fortynning=50 µL serum + 50 µL media) av serumsupplert medium i 90 minutter for å oppnå den optimale fluorescensverdien. På slutten av inkubasjonsperioden ble media aspirert og deretter målt ved eksitasjonsemisjonen ved bruk av 485 nm og 535 nm filtersett i PerkinElmer Victor X3 plateleser (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).

Forfatterbidrag:AR unnfanget ideen, designet, utførte forskning og skrev manuskriptet. CGG utførte forskning og skrev manuskriptet. RW hjalp til med innsamling av blodprøver og føring av pasientjournaler. DP er en klinisk PI, som var ansvarlig for innsamling av bioprøver, spørreskjemaer og IRB-godkjenning. Alle forfattere har lest og samtykket til den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering:Dette arbeidet ble støttet av Simmaron Research Inc., en non-profit 501C forskningsorganisasjon, Incline Village, NV 89451, som et resultat av midler fra Ramsay Award 2023 til AR av Solve ME initiativet og Foundation Hesse Sibylla, Quebec, QC, Canada.

Uttalelse fra institusjonell revisjonskomité:Ingen del av denne forskningsartikkelen, inkludert bilder og tekster, hadde blitt publisert eller gjengitt tidligere i noen bok, artikkel eller annen publisert litteratur. Bildene er originale og ikke kopiert fra andre kilder. Dette er ikke en klinisk studie, men en institusjonell observasjonsstudie. Innsamlingen av bioprøver, retningslinjer for spørreskjemaer, journalføring og generering av unike identifikasjonsnumre ble utført av Western IRB, protokoll #20201812 (Gjeldende fornyelsesdato #7/21/23).

Erklæring om informert samtykke:Alle forfattere ga sitt samtykke til å publisere denne oversiktsartikkelen.

Datatilgjengelighetserklæring:Det er ikke noe elektronisk datablad knyttet til denne artikkelen. Ingen data i et elektronisk depot.

Interessekonflikter:AR, CGG, RW og DP er ansatte i Simmaron Research INC, en 501C non-profit forskningsorganisasjon. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Forkortelser

ME/CFS=Myalgisk encefalomyelitt eller kronisk utmattelsessyndrom; OI=Ortostatisk intoleranse; SFN=liten fiber polynevropati; BH4=tetrahydrobiopterin; eNOS=endotel nitrogenoksidsyntase; NEI=Nitrogenoksid. ROS=Reaktive oksygenarter. ME/CFS=Myalgisk encefalomyelitt eller kronisk utmattelsessyndrom; OI=Ortostatisk intoleranse; SFN=småfiberpolynevropati; BH4=tetrahydrobiopterin; eNOS=endotel nitrogenoksidsyntase; NEI=Nitrogenoksid; og ROS=Reaktive oksygenarter.

Referanser

1. Lim, EJ; Ahn, YC; Jang, ES; Lee, SW; Lee, SH; Son, CG Systematisk gjennomgang og metaanalyse av prevalensen av kronisk utmattelsessyndrom/myalgisk encefalomyelitt (CFS/ME). J. Transl. Med. 2020, 18, 100. [CrossRef]

2. Sønn, C.-G. Gjennomgang av utbredelsen av kronisk tretthet over hele verden. J. Korean Med. 2012, 33, 25–33.

3. Natelson, BH; Lin, J.-MS; Blate, M.; Khan, S.; Chen, Y.; Unger, ER Fysiologisk vurdering av ortostatisk intoleranse ved kronisk utmattelsessyndrom. J. Transl. Med. 2022, 20, 95. [CrossRef]

4. Bateman, L.; Bested, AC; Bonilla, HF; Chheda, BV; Chu, L.; Curtin, JM; Dempsey, TT; Dimmock, ME; Dowell, TG; Felsenstein, D. Myalgisk encefalomyelitt/kronisk utmattelsessyndrom: Essentials of diagnose and management. I Mayo Clinic Proceedings; Elsevier: Amsterdam, Nederland, 2021; s. 2861–2878.

5. Basantsova, NY; Starshinova, AA; Dori, A.; Zinchenko, YS; Yablonskiy, PK; Shoenfeld, Y. Småfibernevropati definisjon, diagnose og behandling. Neurol. Sci. 2019, 40, 1343–1350. [CrossRef]

6. Shoenfeld, Y.; Ryabkova, VA; Scheibenbogen, C.; Branch, L.; Martinez-Lavin, M.; Ikeda, S.; Heidecke, H.; Watad, A.; Bragazzi, NL; Chapman, J. Komplekse syndromer av kronisk smerte, tretthet og kognitiv svekkelse knyttet til autoimmun dysautonomi og småfibernevropati. Clin. Immunol. 2020, 214, 108384. [CrossRef]

7. Leonardi, L.; Adam, C.; Beaudonnet, G.; Beauvais, D.; Cauquil, C.; Ikke, A.; Morassi, O.; Benmalek, A.; Trassard, O.; EchanizLaguna, A.; et al. Hudamyloidavleiringer og tap av nervefiber som markører for nevropatiutbrudd og progresjon ved arvelig transthyretin-amyloidose. Eur. J. Neurol. 2022, 29, 1477–1487. [CrossRef] [PubMed]

8. Ichinose, H.; Nomura, T.; Sumi-Ichinose, C. Metabolisme av tetrahydrobiopterin: Dens relevans i monoaminerge nevroner og nevrologiske lidelser. Chem. Rec. 2008, 8, 378–385. [CrossRef] [PubMed]

9. Xia, T.; Gray, DW; Shiman, R. Regulering av rottelever fenylalaninhydroksylase. III. Kontroll av katalyse med (6R)-tetrahydrobiopterin og fenylalanin. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24657–24665. [CrossRef]

10. Nagatsu, T.; Nagatsu, I. Tyrosinhydroksylase (TH), dets kofaktor tetrahydrobiopterin (BH4), andre katekolamin-relaterte enzymer, og deres menneskelige gener om medikamenter og genterapier av Parkinsons sykdom (PD): Historisk oversikt og utsikter. J. Neural Transm. 2016, 123, 1255–1278. [CrossRef]

11. Sawada, M.; Sugimoto, T.; Matsuura, S.; Nagatsu, T. (6R)-Tetrahydrobiopterin øker aktiviteten til tryptofanhydroksylase i skiver av rotter. J. Neurochem. 1986, 47, 1544–1547. [CrossRef]

12. Chen, D.-D.; Chen, L.-Y.; Xie, J.-B.; Shu, C.; Yang, T.; Zhou, S.; Yuan, H.; Chen, AF Tetrahydrobiopterinregulering av eNOS redoksfunksjon. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3554–3562. [CrossRef] [PubMed]

13. Higashi, Y.; Sasaki, S.; Nakagawa, K.; Kimura, M.; Noma, K.; Hara, K.; Jitsuiki, D.; Goto, C.; Oshima, T.; Chayama, K. Tetrahydrobiopterin forbedrer aldringsrelatert svekkelse av endotelavhengig vasodilatasjon gjennom en økning i nitrogenoksidproduksjon. Aterosklerose 2006, 186, 390–395. [CrossRef]

14. Wang, WZ; Fang, XH; Stephenson, LL; Khiabani, KT; Zamboni, WA Effekter av tilskudd av BH4 etter langvarig iskemi i skjelettmuskulatur. Mikrokirurgi 2007, 27, 200–205. [CrossRef]

15. Yang, Y.-M.; Huang, A.; Kaley, G.; Sun, D. eNOS frakobling og endotelial dysfunksjon i gamle kar. Er. J. Physiol.-Heart Circ. Physiol. 2009, 297, H1829–H1836. [CrossRef]

16. Karbach, S.; Wenzel, P.; Waisman, A.; Munzel, T.; Daiber, A. eNOS frakobling i kardiovaskulære sykdommer - rollen til oksidativt stress og betennelse. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3579–3594. [CrossRef]

17. Sindler, AL; Delp, MD; Reyes, R.; Wu, G.; Muller-Delp, JM Effekter av aldring og treningstrening på eNOS-frakobling i skjelettmuskelmotstandsarterioler. J. Physiol. 2009, 587, 3885–3897. [CrossRef]

18. Gottschalk, G.; Peterson, D.; Knox, K.; Maynard, M.; Whelan, RJ; Roy, A. Forhøyet ATG13 i serum fra pasienter med ME/CFS stimulerer oksidativ stressrespons i mikrogliaceller via aktivering av reseptoren for avanserte glykeringssluttprodukter (RAGE). Mol. Celle. Neurosci. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. Blau, N.; Thony, B.; Spada, M.; Ponzone, A. Tetrahydrobiopterin og arvelige hyperfenylalaninemier. Turk. J. Pediatr. 1996, 38, 19–35. [PubMed]

20. Birnbacher, R.; Scheibenreiter, S.; Blau, N.; Bieglmayer, C.; Frisch, H.; Waldhauser, F. Hyperprolactinemia, et verktøy i behandlingskontroll av tetrahydrobiopterin-mangel: Endokrine studier hos en affisert jente. Pediatr. Res. 1998, 43, 472–477. [CrossRef]

21. Hyland, K.; Kasim, S.; Egami, K.; Arnold, L.; Jinnah, H. Tetrahydrobiopterin-mangel og dopamintap i en genetisk musemodell av Lesch-Nyhans sykdom. J. Arve. Metab. Dis. 2004, 27, 165–178. [CrossRef]

22. Li, L.; Chen, W.; Rezvan, A.; Jo, H.; Harrison, DG Tetrahydrobiopterinmangel og nitrogenoksidsyntase-frakobling bidrar til aterosklerose indusert av forstyrret strømning. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 2011, 31, 1547–1554. [CrossRef]

23. Chuaiphichai, S.; Starr, A.; Nandi, M.; Channon, KM; McNeill, E. Endotelcelle-tetrahydrobiopterinmangel demper LPS-indusert vaskulær dysfunksjon og hypotensjon. Vasc. Pharmacol. 2016, 77, 69–79. [CrossRef] [PubMed]

24. Choi, HJ; Lee, SY; Cho, Y.; Nei, H.; Kim, SW; Hwang, O. Tetrahydrobiopterin forårsaker mitokondriell dysfunksjon i dopaminerge celler: Implikasjoner for Parkinsons sykdom. Neurochem. Int. 2006, 48, 255–262. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, SY; Moon, Y.; Hee Choi, D.; Jin Choi, H.; Hwang, O. Spesiell sårbarhet av rotte mesencefaliske dopaminerge nevroner til tetrahydrobiopterin: Relevans for Parkinsons sykdom. Neurobiol. Dis. 2007, 25, 112–120. [CrossRef]

26. Kwak, SS; Suk, J.; Choi, JH; Yang, S.; Kim, JW; Sohn, S.; Chung, JH; Hong, YH; Lee, DH; Ahn, JK; et al. Autofagi-induksjon ved tetrahydrobiopterin-mangel. Autophagy 2011, 7, 1323–1334. [CrossRef] [PubMed]

27. Porkert, M.; Sher, S.; Reddy, U.; Cheema, F.; Niessner, C.; Kolm, P.; Jones, DP; Hooper, C.; Taylor, WR; Harrison, D.; et al. Tetrahydrobiopterin: En ny antihypertensiv terapi. J. Hum. Hypertens. 2008, 22, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

28. Channon, K. Tetrahydrobiopterin: Regulator av endothelial nitrogenoksidsyntase ved vaskulær sykdom. Trender Cardiovasc. Med. 2004, 14, 323–327. [CrossRef]

29. Feng, Y.; Feng, Y.; Gu, L.; Liu, P.; Cao, J.; Zhang, S. Den kritiske rollen til tetrahydrobiopterin (BH4) metabolisme i modulering av radiosensitivitet: BH4/NOS-aksen som en engel eller en djevel. Front. Oncol. 2021, 11, 720632. [CrossRef]

30. Mandarano, AH; Maya, J.; Giloteaux, L.; Peterson, DL; Maynard, M.; Gottschalk, CG; Hanson, MR Pasienter med myalgisk encefalomyelitt/kronisk utmattelsessyndrom viser endret T-cellemetabolisme og cytokinassosiasjoner. J. Clin. Undersøk. 2020, 130, 1491–1505. [CrossRef] [PubMed]

Ansvarsfraskrivelse/utgivers merknad:Uttalelsene, meningene og dataene i alle publikasjoner er utelukkende de fra den enkelte forfatter(e) og bidragsyter(e) og ikke fra MDPI og/eller redaktøren(e). MDPI og/eller redaktøren(e) fraskriver seg ansvar for enhver skade på personer eller eiendom som følge av ideer, metoder, instruksjoner eller produkter som refereres til i innholdet.

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】