Kosthold påvirker immunopatologien og alvorlighetsgraden av nyreskade betydelig

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

John E. Brus, et al

Abstrakt: 

Kosthold er en ledende årsaksrisikofaktor for sykelighet og dødelighet over hele verden, men det blir sjelden vurdert i utformingen av prekliniske dyrestudier. Flere av de ernæringsmessige utilstrekkelighetene som er rapportert hos amerikanere har vist seg å være skadelig fornyreHelse; De ansvarlige mekanismene er imidlertid uklare og har i stor grad blitt tilskrevet utviklingen av diabetes eller hypertensjon. Her bestemte vi oss for å finne ut om kosthold påvirker mottakelighet for nyreskade hos C57Bl/6 hannmus. Mus ble matet med en standard chow-diett, en kommersielt tilgjengelig "vestlig" diett (WD), eller en ny amerikanisert diett (AD) i 12 uker før induksjon avnyreskadeved bruk av folsyrenefropati (FAN) eller unilateral renal ischemi-reperfusion injury (uIRI)-modeller. I FAN hadde musene som ble matet med WD og AD dårligere histologiske bevis på vevsskade og større nyreekspresjon av gener assosiert med nefrotoksisitet sammenlignet med mus som ble matet med chow. Mus som ble matet med AD utviklet mer alvorlig nyrehypertrofi etter FAN, og genekspresjonsdata tyder på at mekanismen for FAN var forskjellig mellom diettene. I mellomtiden hadde mus som ble matet med WD de største sirkulerende interleukin-6-konsentrasjonene. I uIRI ble det ikke observert noen forskjell i nyrevevsskade mellom diettene; mus som ble matet med WD og AD viste imidlertid bevis på undertrykt inflammatorisk respons. Til sammen støtter dataene våre hypotesen om at kosthold direkte påvirker alvorlighetsgraden og patofysiologien tilnyresykdomog er en kritisk eksperimentell variabel som må vurderes i mekanistiske prekliniske dyrestudier.

Nøkkelord: vestlig kosthold; mus; akuttnyreskade; kostholdskvalitet; ernæring

Klikk her for å få mer informasjon om Cistanche-produkter for å forbedre nyrene

1. Introduksjon

Livsstil er en ledende bidragsyter til generell velvære og påvirker i betydelig grad utfallet av hjerte- og karsykdommer (CVD) uavhengig av genetisk risiko [1]. Kosthold er en viktig del av livsstilen, og dårlig kosthold og kostholdsrelaterte sykdommer står for mer enn åtte av de 30 beste risikofaktorene for sykelighet og dødelighet på verdensbasis [2]. Mekanismene som beskriver hvordan dårlig ernæring påvirker helsen negativt, er imidlertid overraskende uklare.

En stor barriere i ernæringsforskningen har vært vanskelighetene med å uhensiktsmessig modellere den komplekse og mangefasetterte naturen til menneskelige kostholdsvaner i mekanistiske prekliniske dyrestudier. Chow-dietter er den mest brukte matkilden i prekliniske gnagerstudier på grunn av deres høye ernæringsmessige kvalitet, lagringsstabilitet og relativt lave produksjonskostnader. Sammensatt av kornbaserte blandinger som er supplert med høykvalitetsoljer og vitamin/mineralblandinger, er chow-dietter dårlige representasjoner av den relativt lave ernæringsmessige kvaliteten rapportert i utviklede samfunn. Dette har ført til opprettelsen av en rekke sykdomsinduserende dietter, hvorav de fleste fokuserer på høyt kaloriinntak i utviklede land og produserer fedme og metabolsk dysfunksjon hos villtype dyr. Selv om fedme og metabolsk dysfunksjon fortsatt er store helseproblemer verden over, representerer dagens kommersielt tilgjengelige høykaloridietter et ekstremt og veldig snevert syn på de komplekse ernæringsmessige mangelene som rapporteres i vestlige samfunn. De fysiologiske effektene av et gitt næringsstoff er ofte avhengig av eksistensen og overfloden av andre næringsstoffer (som natrium-kalium-forholdet [3,4]), og disse interaksjonene vurderes ikke i kommersielt tilgjengelige sykdomsinduserende dietter. Derfor er det mulig at den reduksjonistiske tilnærmingen som er vanlig i ernæringsforskning utilsiktet har hindret vellykket oversettelse av mekanistiske data fra gnagere til mennesker.

I et forsøk på å løse dette problemet, utvikler vi en ny amerikanisert diett (AD) som inkluderer flere av de ernæringsmessige utilstrekkelighetene som er rapportert hos amerikanere [5]. AD er en diett med to pellets som består av en kornbasert pellet og en syntetisk "søt og salt" pellet og ble utviklet med interesse for å studere kostholdspreferanser og kan oppveie rapporterte bivirkninger av tradisjonelle gnagerdietter med høyt kaloriinnhold [6 ]. Interessant nok har flere av næringsendringene gjort i AD blitt foreslått å påvirkenyreHelsepå enten en direkte eller indirekte måte [7–10].Nyredysfunksjoner en ledende årsak til CVD og et vanlig utfall ved kostholdsinduserte sykdommer som f.eksdiabetesoghypertensjon. Nyere analyser har vist at dårlig kostholdskvalitet øker forekomsten avnyreskadeogsykdom[11]; De ansvarlige mekanismene er imidlertid fortsatt uklare. Derfor satte vi oss for å finne ut om kostholdet påvirker resultatene av to forskjellige musemodeller for nyreskade i betydelig grad.

2. Materialer og metoder

2.1. Dyr og dietter

Alle dyreforsøk ble utført etter protokoller godkjent av Liberty University Institutional Animal Care and Use Committee og i samsvar med Guide for Care and Use of Laboratory Animals [12]. Avvennende (3-uke gamle) hannmus C57Bl/6 ble kjøpt fra Jackson Laboratory og holdt i grupper (3–5 mus per bur) med maiskolbeseng, en standard gnagermat (Teklad Global 18 prosent , # 2018), og karbonfiltrert vann fra springen. Etter en 1-ukers akklimatiseringsperiode fikk mus ad libitum tilgang til en av tre dietter: chow (Teklad Global 18 prosent , #2018, n=14), en kommersielt tilgjengelig vestlig diett ("WD, " #TD.88137, n=13), eller vår roman "AD" (n=14).

AD består av to pellets, referert til som AD chow (TD.170651) og ADsyn thetic (TD.170698 & TD.170699). AD chow pellet er en modifisert chow-basert pellet med reduserte fettløselige vitaminer (A, D og E) og uløselig fiber (nøytral vaskemiddelfiber). Det syntetiske kostholdet ble formulert for å inkludere overflødig sukrose, fruktose, mettet fett, kolesterol, omega-6 flerumettede fettsyrer, transfettsyrer, natrium og fosfor samtidig som det hadde reduserte kalium og omega-3 flerumettede fettsyrer . Transfettsyrer ble inkludert i formuleringen da de fortsatt konsumeres fra naturlige kilder (som storfekjøtt), men inkluderingen i ADsyntetisk pellet var langt lavere enn det som ble brukt i andre tidligere studier [13–16]. Inkluderingen av hvert næringsstoff var basert på å matche prosentforskjellen mellom faktisk og anbefalt inntak hos mus og mennesker (avbildet i vedlegg A tabell A1) basert på nylige rapporter fra United States Department of Agriculture [5,12]. Næringssammensetningen for hver pellet var basert på den beregnede prosentforskjellen av rapporterte og anbefalte inntaksverdier for hvert næringsstoff hos amerikanere, og denne prosentvise forskjellen ble deretter brukt på musenæringsbehov [13]. Den endelige formuleringen av hver pellet ble deretter justert ytterligere for å ta hensyn til gjennomsnittlig daglig forbruk på henholdsvis 2 og 0,5 g AD syntetisk og ADchow. En annen syntetisk pellet, ADsythetic2, ble formulert for å imøtekomme en endring i diettpreferanse utover 8 uker, der mus inntok omtrent like store mengder (1,5 g) av både ADchow og ADsynthetic2 daglig. Et sammendrag av diettene brukt i denne studien er gitt i tabell 1.

2.2. Musemodeller av akutt nyreskade (AKI)

Mus forble på sine eksperimentelle dietter i 12 uker før induksjon avnyreskademed folsyreindusert nefropati (FAN) eller unilateral ischemi-reperfusjonsskade (uIRI) modeller. Disse modellene ble valgt ettersom de rutinemessig brukes i litteraturen og induserer robustenyreskadepå en doseavhengig måte [17]. FAN-modellen ble utført basert på tidligere publikasjoner [18–21] med modifikasjoner. På grunn av forskjellene i kroppsvekt mellom diettgruppene, beregnet vi dosen på 250 mg/kg for den minste musen i vår studie (25 g) og administrerte den samme dosen (6,25 mg/500 µL) til alle mus under kort isofluranbedøvelse (3 prosent i 100 prosent oksygen, 600 ml/min). Kontrollmus (n=4 for hver diett) mottok et likt volum (500 µL) 0,3 mM natriumbikarbonatbærer som mus som mottok FAN (n=4 for hver diett). For uIRI-modellen ble mus (n=5–6 for hver diett) bedøvet med isofluran og et flankesnitt ble laget og arterien og venen til venstrenyreble isolert fra omgivende binde- og fettvev og blokkert med en mikrovaskulær klemme. Etter 45 minutter ble klemmen fjernet og gjenoppretting av blodstrømmen ble visuelt bekreftet. Muskulaturen ble lukket med en 4.0 silkesutur og hudsnittet ble lukket med kirurgiske stifter. Overflatens kroppstemperatur ble holdt på 28–30 ◦C med en varmelampe og varmepute (normal overflatekroppstemperatur ~30 ◦C). Buprenorfin (0,1 mg/ml, 100 µL subkutan injeksjon) ble administrert som et smertestillende middel når dyret begynte å gjenvinne bevissthet.

Cistanche kan behandle nyreskade

2.3. Dyreavlivning, histologisk analyse og serummålinger av nyrefunksjon

Dyr ble avlivet 24 (uIRI) eller 48 timer (FAN) senere ved cervikal dislokasjon mens de var under kort isofluranbedøvelse. Hjertet ble fjernet og stammeblod ble samlet, latt stå i romtemperatur i 10 min, og gjennomgikk sentrifugering i 10 min ved 2500 g. Serum ble samlet og frosset ved -80 ◦C inntil det ble analysert for kreatinin (Crystal Chem), blodureanitrogen (BUN, Arbor Assays) eller interleukin-6 (IL6, Biolegend) ved bruk av kommersielt tilgjengelige analyser. Nyrene ble dissekert og dekapslet, og en sagittal seksjon i midten ble fiksert i 10 prosent fosfatbufret formalin, innebygd i parafin, og 5 µm seksjoner ble kuttet og farget med H&E eller Picro Sirius Red (ABCAM). I H&E-fargede seksjoner ble alvorlighetsgraden av akutt tubulær nekrose vurdert av en person blindet for eksperimentell design basert på en 0–4 skala, der (0) refererer til ingen bevis for skade, (1) er<25% of="" the="" identifiable="" tissue="" area="" consists="" of="" injury,="" (2)="" 25–50%,="" (3)="" 50–75%,="" and="" (4)="">75 prosent. I likhet med tidligere arbeid [22], besto "tubulær skade" av tubulær dilatasjon, proteinholdige avstøpninger og tilsynelatende tubulointerstitiell ombygging. Graden av tubulointerstitiell fifibrose ble vurdert i Picro Sirius-fargede seksjoner.

2.4. Nefrotoksisitet PCR-array

Omtrent 30–100 mg stykker dekapsletnyrevevble lagret i RNAlater™-løsning (Thermo). Et enkelt representativt utvalg fra hver diettgruppe i FAN-studien ble valgt som var svært lik gruppegjennomsnittet for serumkreatinin, BUN og histologiskåre i hver behandlingsgruppe. Den valgte prøven ble deretter behandlet for å kvantifisere ekspresjonen av 84 gener relatert til nefrotoksisitet ved bruk av RT2 ProfilerTM PCR Array—Mouse Nephrotoxicity(#PAMM-094Z) som anbefalt av produsenten (Qiagen). Totalt RNA ble isolert ved bruk av RNeasy®-settet, genomisk DNA ble fjernet ved DNA-fordøyelse, og 0,5 ug av totalt RNA ble brukt til cDNA-syntese ved bruk av RT2 First Strand Kit. cDNA-blandingen ble blandet med RT2 SYBR® Green Mastermix og nukleasefritt vann og deretter påført RT2-platen og analysert som anbefalt ved bruk av et Lightcycler™ 96-instrument (Roche). ∆Ct-verdiene for hver behandlingsgruppe ble beregnet basert på ekspresjonen av husholdningsgener ved å bruke følgende ligning: 2ˆ (∆CT), hvor ∆CT=(husholdning (GAPDH))-CT (interessegen)] . Den prosentvise forskjellen i uttrykk sammenlignet med kontrollmus (chow-matede mus med vehikelbehandling) ble beregnet for hvert gen. For å identifisere gener som potensielt er påvirket av FAN og kosthold, modifiserte vi analysen levert av produsenten (Qiagen). Gener med større enn den 2-foldige forskjellen fra kontrollmus ble identifisert, og fra denne listen identifiserte vi gener med en forskjell på større enn eller lik 25 prosent mellom mus som ble matet med WD og AD. Seks gener ble identifisert ved hjelp av denne metodikken og deres nyre-mRNA-uttrykk ble kvantifisert ved bruk av konvensjonell sanntids RT-PCR.

2.5. RT-PCR for gener assosiert med nefrotoksisitet, betennelse og vevsremodellering

Nyrer og milter ble behandlet for RT-PCR ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett (Qiagen og BioRad) etter produsentens anbefalinger. Intron-spennende primere for gener involvert i nefrotoksisitet eller leukocyttspesifikke markører ble kjøpt fra BioRad eller laget ved hjelp av Primer3-programvare [23–25]. Grunningsinformasjon er gitt i Vedlegg C Tabell A2. Deretter ble 10 µL RT-PCR-reaksjoner utført ved bruk av iTaq Universal SYBR Green Supermix (BioRad) og ∆CT-verdier ble beregnet for hvert gen. Alle data presenteres som normalisert til gjennomsnittet av kontrollgruppene for hvernyreskademodell (chow-matede mus med vehikel-injisert for FAN eller en kontralateral nyre av chow-matede mus i IRI).

2.6. Statistisk analyse

Alle studiene ble utført ved hjelp av et fullstendig randomisert design. I FAN-studien var "Diet" og "Treatment" de uavhengige variablene med "Diet" som hadde de 3 nivåene (chow, WD og AD), og "Treatment" hadde 2 nivåer (vehicle eller FAN). Lignende analyser ble brukt i uIRI-studien, hvor "Behandling" ble bestemt ved å sammenligne genuttrykksdataene i den iskemiske nyren med den ikke-iskemiske, kontralaterale kontrollnyren. Alle data ble gjennomgått før GLM-analyse og uteliggere ble identifisert ved hjelp av Explore-funksjonen og analysert ved bruk av generelle lineære modellprosedyrer i SPSS (IBM). Verdier ble ansett som signifikante med p Mindre enn eller lik 0.05 med Tukey Post Hoc-analyse, og en tendens ble definert som p Mindre enn eller lik 0,1.

3. Resultater

3.1. Dårlig kosthold forverrer vevsskade i FAN

Mus som ble matet med WD hadde størst total kroppsvekt (37,4 ± 4,1 g) sammenlignet med mus som ble matet med AD (30.3 ± 1.0, p=0.{{ 17}}01) og mus matet chow (26,8 ± 1,1, p < {{20}}.001).="" fettet="" var="" også="" forskjellig="" mellom="" gruppene,="" der="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" wd="" hadde="" den="" høyeste="" vekten="" av="" epididymal="" fettpute="" (2.0="" ±="" {{30}},6="" g,="" p="">< 0.="" 001)="" sammenlignet="" med="" mus="" matet="" med="" chow="" (0,4="" ±="" 0,08,="" p="">< 0,001)="" og="" ad="" (0,7="" ±="" 0,3,="" p="">< 0,001).="" økningen="" i="" kropps-="" og="" fettvekt="" observert="" hos="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" ad="" var="" også="" større="" enn="" hos="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" chow="" (henholdsvis="" p="0.001" og="" p="">< 0.001).="" fettvevsvekten="" var="" ikke="" forskjellig="" mellom="" mus="" i="" gruppene="" som="" ble="" behandlet="" med="" bærer="" eller="" fan="" (p="">

Interessant nok hadde mus som ble matet med AD den største nyrevekten sammenlignet med både mus som ble matet med chow (p < {{0}}.001)="" og="" wd="" (p="" {{2="" }}.01)="" (tabell="" 2).="" nyrevekten="" var="" ikke="" forskjellig="" mellom="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" chow="" eller="" wd="" (p="0.1)," og="" disse="" dataene="" var="" konsistente="" når="" kroppsvekt="" ble="" brukt="" som="" en="" kovariat="" (p="0.52)." sirkulerende="" kreatinin="" (p="">< 0,001)="" og="" bun="" (p="">< 0,001)="" var="" signifikant="" forhøyet="" som="" respons="" på="" fan,="" men="" ingen="" av="" dem="" ble="" signifikant="" påvirket="" av="" kostholdet="" (henholdsvis="" p="0,74" og="" 0,67).="" diett="" påvirket="" imidlertid="" alvorlighetsgraden="" av="" vevsskaden="" vurdert="" ved="" mikroskopi="" med="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" wd="" (p="0.001)" og="" ad="" (p="0.004)" med="" mer="" alvorlig="" vevsskade="" sammenlignet="" med="" mus="" matet="" chow="" (tabell="" 2="" og="" figur="" 1).="" de="" dominerende="" histologiske="" trekk="" ved="" nyreskade="" var="" tubulær="" dilatasjon="" og="" akutt="" tubulær="" nekrose,="" som="" var="" mer="" alvorlig="" og="" utbredt="" i="" hele="" cortex="" hos="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" ad="" og="" wd.="" det="" ble="" ikke="" observert="" noen="" forskjell="" i="" nyrefifibrose="" mellom="" diettgruppene="" i="" picro="" sirius-fargede="" snitt="" (vedlegg="" c="" figur="" a1).="" fan="" forårsaket="" en="" signifikant="" (p="0.005)" økning="" i="" sirkulerende="" interleukin-6="" (il6)="" som="" ble="" ytterligere="" forverret="" med="" wd="" sammenlignet="" med="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" ad="" (p="0.01)" og="" chow="" (s="0.006," tabell="" 2).="" på="" samme="" måte="" forårsaket="" fan="" en="" drastisk="" økning="" i="" renal="" il6="" mrna-ekspresjon="" (p="">< 0,001);="" det="" var="" imidlertid="" ingen="" signifikant="" forskjell="" mellom="" diettgruppene="" (s="">

3.2. Diett påvirker i betydelig grad det renale mRNA-uttrykket av nefrotoksiske og leukocyttspesifikke gener i FAN

Vi satte deretter ut for å identifisere potensielle mekanismer som er ansvarlige for forverring av vevsskade hos mus matet med WD og AD. Representative prøver fra hver diett ble valgt og uttrykket av 84 gener assosiert med nefrotoksisitet ble screenet ved å bruke en kommersielt tilgjengelig PCR-array (rådata er presentert i vedlegg E tabell A3). Sammenlignet med vehikelbehandlede chow-matede mus, ble 57 nefrotoksiske gener identifisert som å ha en større enn 50 prosent endring i uttrykk med FAN, og seks av disse ble identifisert som forskjellige basert på diett (vedlegg F, tabell A4). Av de seks genene identifisert av nefrotoksisitetsanalysen, var nyreekspresjon av Btg2 (p=0.03), Cdkn1a (p=0.01) og Spp1 (p=0.001) signifikant påvirket av kostholdet som bestemt ved bruk av konvensjonell RT-PCR. Mus som ble matet med WD hadde større uttrykk for Btg2 og Spp1 sammenlignet med mus som ble matet med chow og AD, mens mus som ble matet med AD hadde et større uttrykk for Cdkn1a sammenlignet med mus som ble matet med chow og WD (vedlegg F tabell A4 og figur 2) . Vi kvantifiserte også nyre-mRNA-ekspresjonen av 4 leukocyttspesifikke markører (CD3e, CD19, CCR2 og Ly6G), som alle var signifikant påvirket av FAN (vedlegg F, tabell A4). En diett hadde imidlertid ingen signifikant effekt på ekspresjonen av leukocyttspesifikke markører i nyrene.

Vi har tidligere vist at milten påvirker immunopatologien ved nyreskade betydelig [26–28]. Derfor satte vi oss for å bestemme om dietten modifiserer miltens mRNA-uttrykk av de samme leukocyttspesifikke markørene i FAN. FAN forårsaket en signifikant reduksjon i milt-mRNA-ekspresjon av T-cellemarkøren Cd3e (p=0.001) og B-cellemarkøren Cd19 (p < 0,001)="" (figur="" 3)="" og="" vedlegg="" f="" tabell="" a4).="" når="" det="" gjelder="" kosthold,="" hadde="" mus="" som="" ble="" matet="" ad,="" lavere="" milt-mrna-ekspresjon="" av="" cd3e="" (p="0.01)" og="" cd19="" (p="0.009)" sammenlignet="" med="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" chow,="" men="" ikke="" mus="" som="" ble="" matet="" med="" wd="" (p="" større="" enn="" eller="" lik="" 0,2).="" det="" var="" ingen="" signifikant="" effekt="" av="" diett="" (p="0.8)" eller="" fan="" (p="0.1)" på="" miltens="" il6-uttrykk="" (data="" ikke="">

3.3. Diett påvirker i betydelig grad leukocyttspesifikk genuttrykk i uIRI

Vi gjentok diettstudiene våre i uIRI-modellen for å vurdere generaliserbarheten til FAN-dataene. Til tross for den signifikante forskjellen i adipositas mellom diettbehandlingsgruppene, var det ingen signifikante forskjeller i operasjonstid (~5 min) mellom behandlingsgruppene (p=0.5). Kostholdet hadde ingen effekt på alvorlighetsgraden av vevsskaden bestemt ved kvantifisering av H&E- (p=0.7, figur 4) eller Picro Sirius-fargede lysbilder (vedlegg D, figur A2). Mens AD-matede mus hadde høyere nyrevekt i FAN-studien, var det bare en tendens til at en diett påvirket nyrevekten (p=0.07) i uIRI-studien. I den ikke-iskemiske kontralaterale nyren hadde mus som ble matet chow lavere numerisk nyrevekt (160 ± 22 mg) sammenlignet med mus som ble matet med AD (168 ± 14) og WD (186 ± 15). Lignende numeriske trender ble observert i de iskemiske nyrene der mus som ble matet med chow (173 ± 24 mg) eller AD-matede mus (170 ± 12) hadde lavere numerisk nyrevekt sammenlignet med mus som ble matet med WD (195 ± 32). Disse dataene tyder på at effekten av kosthold på nyrevekt med skade er avhengig av modellen som brukes.

Alle nefrotoksiske og leukocyttspesifikke gener kvantifisert i nyrene ble signifikant påvirket av uIRI bortsett fra Cd3e (p=0.1, vedlegg G tabell A5). Imidlertid var ingen av de nefrotoksiske genene identifisert i FAN-studien signifikant påvirket av kostholdet. Når det gjelder ekspresjonen av leukocyttspesifikke gener, var effekten av uIRI på renal Cd19-mRNA-ekspresjon svært avhengig av diettmat (p=0.008), med mus matet med WD og AD som hadde omtrent fire ganger høyere renal Cd19-ekspresjon etter uIRI sammenlignet med mus som ble matet med chow (figur 5). Det var også en tendens til at mus som ble matet med chow hadde et større renalt Ly6g-uttrykk etter uIRI (s.=0.06, vedlegg G, tabell A5). Interessant nok hadde mus som ble matet med WD (p=0.006) og AD (p=0.004) signifikant lavere sirkulerende IL6-konsentrasjoner sammenlignet med mus som ble matet med chow (Figur 5).

Kostholdet påvirket miltens mRNA-ekspresjon av Cd19 (p=0.008), Ccr2 (p =0.004) og Ly6g (p {{7} signifikant) }.03) etter uIRI (Figur 6 og Vedlegg G Tabell A5). Mus matet chow hadde det høyeste miltekspresjonen av disse markørene, med Ccr2 enn mus matet med WD (p=0.02) og AD (p=0.005), Cd19-ekspresjonen var signifikant høyere enn mus matet AD (p=0.007), men ikke WD (p=0.4), og større Ly6g-uttrykk enn mus matet AD (p=0.04) og en tendens til større uttrykk i mus matet med WD (p=0.07). Det var ingen forskjeller i uttrykket av leukocyttspesifikke markører mellom mus som ble matet med WD eller AD (p=0.9, 0.8 og 0.1 for henholdsvis Ccr2, Cd19 eller Ly6g.

4. Diskusjon

Her presenterer vi data som viser effekten av kosthold på alvorlighetsgraden og immunopatologien til nyresykdom i prekliniske musemodeller. Mus som ble matet med WD og AD hadde begge forhøyede grader av vevsskade og differensiell ekspresjon av nefrotoksiske gener etter FAN sammenlignet med mus som ble matet med chow. Mus som ble matet med WD, men ikke AD, hadde også signifikant høyere sirkulerende nivåer av IL6 etter FAN. I uIRI observerte vi ikke en signifikant effekt av kosthold på alvorlighetsgraden av vevsskade eller nyreekspresjonen av lignende nefrotoksiske gener. Imidlertid observerte vi en betydelig reduksjon i sirkulerende IL-6 og ekspresjonen av leukocyttspesifikke gener i nyrene og milten til mus som ble matet med WD og AD. Til sammen antyder disse dataene at kostholdet påvirker immunopatologien til to separate musemodeller av nyreskade betydelig.

Det er overraskende få studier som tar for seg effekten av kosthold på utfall av nyreskade. C57Bl/6-mus som ble matet med en fettrik diett i 9 uker, hadde verre cisplatin-indusert nyreskade sammenlignet med chow-matede mus [29]. Det bør bemerkes at dosen av cisplatin i denne studien var basert på kroppsvekt og resulterte i at musene med høyt fettinnhold fikk en høyere absolutt mengde cisplatin. Dette er en vanlig komplikasjon i kostholdsstudier og var begrunnelsen for vår administrering av samme volum og absolutte mengde FA til alle mus.

Mens det er et begrenset antall artikler som beskriver effekten av kosthold på utfall av nyresykdom, er det betydelig tilgjengelig litteratur som beskriver effekten av diabetes på mottakelighet og progresjon av nyreskade hos gnagere [30–33]. Pågående (upubliserte) studier i laboratoriet vårt antyder at mus matet med WD og AD har høyere daglig kaloriinntak (henholdsvis 16 og 15 kcal/dag) sammenlignet med mus som ble matet med chow (12 kcal/dag). Interessant nok viser bare mus som ble matet med WD bevis på insulinresistens, med fastende hypoglykemi (120,3 mg/dL) observert så tidlig som 8 uker etter diettstart og utviklet en fire ganger økning i fastende sirkulerende insulin ( 4,2 ng/ml) etter 24 uker. Mus matet med chow og AD har nesten identiske fastende glukose (henholdsvis 166 og 167 mg/dL) og insulinnivåer (henholdsvis 0,6 og 1,0) på lignende tidspunkter. Gitt kinetikken til disse dataene, tror vi at AD lykkes med å modellere moderate ernæringsmessige mangler og er blottet for metabolsk dysfunksjon i tidsrammen for den nåværende studien, mens mus som ble matet med WD sannsynligvis utviklet insulinresistens.

Previous work has shown diabetic mice have altered renal hemodynamics [30], exacerbated inflflammatory response [31,32], and altered expression of cell-cycle regulators [33] following kidney injury. Interestingly, we also observed alterations in the immune response and cell-cycle regulators in both WD- and AD-fed mice. Regarding the immune response, mice fed the WD had greater circulating IL6 concentrations than mice fed chow and the AD. This suggests that the overt obesity and developing metabolic dysfunction that is likely developing in the WD-fed mice exacerbates the immune response in FAN. We did not observe a signifificant increase in renal or splenic mRNA expression of IL6 in either the FAN or uIRI model suggesting another tissue source (perhaps the liver [34]) is responsible. The spleen is a reservoir of deployable leukocytes [35,36] and we have previously shown the spleen to play a signifificant role in the pathophysiology of kidney injury with splenic size being inversely correlated with kidney injury [26–28]. Mice fed the WD and AD had a>30 prosent reduksjon i uttrykket av leukocyttmarkører i milten, noe som kan tolkes som at det er økt utplassering av leukocytter fra milten. Dette tyder på økt betennelse hos musene som ble matet med WD og AD; de sirkulerende IL6-dataene støtter imidlertid bare denne hypotesen i WD-matede mus. Ytterligere studier med flowcytometri og bredere karakterisering av sirkulerende kjemokiner og cytokiner er nødvendig for bedre å forstå hvordan kosthold påvirker immunologien og patofysiologien til FAN.

Når det gjelder regulatorer av cellesyklusprogresjon, påvirket dietten også signifikant mRNA-ekspresjonen av Btg2 og Cdkn1a (p21) etter FAN. Knockout-studier antyder en beskyttende rolle for Cdkn1a ved nyresykdom (gjennomgått i [37]) og Btg2-ekspresjon ble også vist å være økt i iskemisk, men ikke kontralateral kontroll, nyre [38]. Funksjonen og betydningen av oppreguleringen av Btg2 ved nyreskade og sykdom er imidlertid ikke fastslått. Btg2 er en nedstrøms effektor av NFκB og cellesyklusregulatorene p53 og p19 som resulterer i cellesyklusblokkade ved bruk av forskjellige cellulære mekanismer (gjennomgått i [39]). Sammen antyder den nåværende litteraturen at cellesyklushemmere er gunstige for å redusere innledende nyreskade, men kan også forsterke, eller til og med lette, den påfølgende progresjonen til mer kroniske former av sykdommen [37,38,40–43]. Forskjellen i uttrykk for Btg2 og Cdkn1a hos musene som ble matet med WD og AD antyder sykelig fedme og ernæringsmessige mangler påvirker patofysiologien til nyreskade via forskjellige cellulære mekanismer og kan ha forskjellige langsiktige utfall. Videre kan forskjellene i Btg2- og Cdkn1a-uttrykk bidra til nyrehypertrofien observert i FAN-modellen. FAN-modellen har vist seg å indusere akutt nyrehypertrofi [20,21], og AD har en mineralsammensetning i kosten som også har vist seg å indusere nyrehypertrofi og skade hos rotter [44,45]. Derfor er det mulig at det endrede mineralinnholdet (spesielt kalsium og fosfor) i AD er ansvarlig for forverringen av nyrehypertrofi i FAN. Fremtidige studier er nødvendig for å bekrefte denne spekulasjonen og om Btg2 og Cdkn1a er involvert.

Vi fant også nyre-Spp1-mRNA-uttrykk å være betydelig påvirket av både FAN og diett, med høyere uttrykk hos mus som ble matet med WD sammenlignet med mus som ble matet med chow, men ikke AD. Spp1 (osteopontin) er et glykoprotein som normalt skilles ut i urinen og er sterkt uttrykt i nyrene, spesielt i det distale kortikale nefronet. Spp1 spiller en nøkkelrolle i å regulere kalsiumkrystalldannelse og avsetning i nyretubuli [46–49], en prosess som er avhengig av kosthold, østrogen og FGF23 [7,50,51]. Det er generelt oppregulert etter nyreskade [52]; rollen til Spp1 i iskemisk nyreskade er imidlertid uklar, og ytterligere studier er nødvendig for å belyse den fysiologiske betydningen av dets økte uttrykk med fett og sykdom.

Vi vurderte også utfall i en ensidig iskemi-reperfusjonsskademodell. Vi observerte ikke endringer i histologi eller mRNA-uttrykk av de nefrotoksisitetsassosierte genene identifisert i FAN-studien i vår uIRI-modell. Mangelen på forskjell i nyre-Btg2- og Cdkn1a-uttrykk i uIRI-studien kan forklare hvorfor nyrehypertrofi ikke ble observert hos mus som ble matet med AD i FAN-studien. Imidlertid var det effekter av kostholdet på uttrykket av immunmarkører i nyrene og milten. Nyreekspresjonen av B-cellemarkøren CD19 ble mer enn doblet hos mus som ble matet med WD og AD sammenlignet med mus som ble matet med chow. Betydningen av dette funnet er uklart, siden rollen til B-celler i musemodeller av iskemisk AKI er kompleks og resultatene er avhengige av flere faktorer (subtype, antistoffklasse, etc.) [53–56]. Diett påvirket også i betydelig grad mRNA-ekspresjonen av immunmarkører i milten (Ccr2, Cd19 og Ly6g), der mus som ble matet med WD og AD hadde et lavere uttrykk sammenlignet med mus som ble matet med chow. Som nevnt ovenfor kan dette tolkes som en økt utplassering av leukocytter fra milten og en forverring av den systemiske immunresponsen hos mus matet med WD og AD. Imidlertid vil den undertrykte sirkulerende IL6 hos mus matet med WD og AD foreslå en immundempende effekt av disse diettene i uIRI-modellen. Ulike molekylære mekanismer for cellulær skade i nyresykdomsmodeller har blitt beskrevet [57–59], og vår studie antyder at kosthold kan endre disse mekanismene. Ytterligere studier er nødvendig for å verifisere denne spekulasjonen og bestemme hvordan kostholdet signifikant endrer den inflammatoriske responsen og celledødsveiene involvert i nyreskade

Det er begrensninger å vurdere når du sammenligner våre data med andre i litteraturen, spesielt i uIRI-studiene. Vi valgte en ensidig modell for å redusere komplikasjonene vi møtte mens vi isolerer nyrevaskulaturen fra overflødig fettvev i WD- og AD-matede mus. Derfor ble serummål for nyrefunksjon ikke kvantifisert i uIRI-studiene gitt tilstedeværelsen av en sunn, ikke-iskemisk kontralateral nyre. Vi brukte også isofluran-anestesi da overvektige mus ikke tolererte ketamin/xylazin-anestesiblandingen som vanligvis brukes i denne modellen [60]. Isofluran har vist seg å redusere nyreskade ved IRI [61] og krevde at vi økte vår iskemiske tid fra 30 til 45 minutter for å oppnå den observerte skaden. Disse erfaringene skapte bekymring for resultatene av våre uIRI-studier og var begrunnelsen for vårt fokus på FAN-modellen. Det er også viktig å fremheve at endringer i genuttrykk ikke tilsvarer endringer i proteinproduksjon, og ytterligere studier er nødvendig for å validere endringer i proteinoverflod og påfølgende endringer i cellulær helse og funksjon.

Cistanche kan behandle nyreskade

5. Konklusjoner

Avslutningsvis presenterer vi data som støtter betydningen av kosthold på mottakelighet for nyreskade. Våre funn tyder på at en diett laget for å modellere den 50. persentilen av næringsinntak hos amerikanere er tilstrekkelig til å forverre nyreskade hos gnagere i samme grad som observert i en kommersielt tilgjengelig WD. Dataene våre antyder også en mekanistisk kobling mellom ernæring, betennelse og cellesyklusregulering i immunopatologien til nyreskade som signifikant endrer sykdomsutfall. Samlet sett fremhever vår studie behovet for å øke verdsettelsen og hensynet til ernæring i mekanistiske prekliniske dyrestudier.

Forfatterbidrag:

Konseptualisering, JCG; metodikk, JCG, JFH, JEB, RL; formell analyse, JCG; undersøkelse, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; ressurser, JCG, JFH; datakurering, JCG, JFH; skriving – originalutkast, JCG, JFH; skriving— anmeldelse og redigering, JEB, DLQ, KJW, BB, HTH, RL, JFH; tilsyn, JCG, JFH; prosjektadministrasjon, JCG, JFH; finansieringsoppkjøp, JCG Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering:

Denne forskningen ble støttet av interne stipender fra Liberty University og Liberty University College of Osteopathic Medicine, et stipend fra American Osteopathic Association (stipend #19133749), og et stipend fra National Institutes of Health (1R01DK113632-01A1) .

Uttalelse fra institusjonell revisjonskomité:

Studien ble utført i henhold til Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [8] og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Liberty University (#49.190710, 11. juli 2019).

Anerkjennelser:

Vi vil gjerne takke Jessica Flowers, ved Teklad Diets (Envigo) for hennes hjelp med å opprette AD og University of Virginia Histology Core Facility for deres histologitjenester.

Interessekonflikter:

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Fra: 'Diett påvirker immunopatologien og alvorlighetsgraden av nyreskade betydelig' avJohn E. Brus, et al

---Næringsstoffer 2021, 13, 1521