Distinkte tolllignende reseptorer genuttrykk og glialrespons i forskjellige hjerneregioner av naturlig skrantesjuke del 3

Vi undersøkte de mulige korrelasjonene mellom de nevropatologiske kjennetegnene ved prionsykdom og TLR-genuttrykk i fire forskjellige hjerneregioner hos sauer som er naturlig infisert med skrantesjuke. I alle de fire hjerneområdene observerte vi signifikante forskjeller i PrPSc-avsetning, spongiose, astrogliose og mikrogliose hos de naturlig infiserte versus kontrollsauene.

Prionsykdom, også kjent som temple fair disease, voksspisende sykdom, etc., er en akutt virusinfeksjon forårsaket av prioner. Sykdommen overføres hovedsakelig ved å spise ukokt mat som inneholder prioner. Når det først er infisert med prioner, kan det forårsake hjernebetennelse og skade på nervesystemet, og symptomer som hodepine, oppkast og feber kan oppstå.

Men når vi møter en slik situasjon, kan vi ikke miste tilliten til hukommelsen på grunn av eksistensen av prionsykdom. De fleste infiserte kan gjenopprette og gjenopprette hukommelsen etter behandling.

Fra et forebyggende perspektiv kan vi selvfølgelig prøve å spise mer tilberedt mat for å unngå prionsmitte. Samtidig, hvis du kjenner noen symptomer, bør du også oppsøke lege så snart som mulig for å forhindre at sykdommen forverres.

I dagliglivet kan vi prøve litt enkel hukommelsestrening, som å lese, sette sammen lister, organisere hendelser og informasjon osv. for å forbedre hukommelsen vår. Denne treningen krever ikke mye tid og energi, men de er svært viktige for å opprettholde en sunn hjerne og effektiv hukommelsesfunksjon.

Kort sagt, når vi møter sykdommer som prionsykdom, bør vi møte det positivt, søke profesjonell medisinsk behandling og forebyggende tiltak, og ta hensyn til daglige hukommelsesøvelser for å sikre vår fysiske helse og effektive arbeid. Det kan sees at vi trenger å forbedre hukommelsen, og Cistanche kan forbedre hukommelsen betydelig fordi den også kan regulere balansen mellom nevrotransmittere, som å øke nivåene av acetylkolin og vekstfaktorer, som er svært viktige for hukommelse og læring. I tillegg kan Cistanche også forbedre blodstrømmen og fremme oksygentilførsel, noe som kan sikre at hjernen får tilstrekkelig næring og energi, og dermed forbedre hjernens vitalitet og utholdenhet.

Klikk vet måter å forbedre hjernefunksjonen på

Disse forskjellene var tydeligst i medulla oblongata, det mest caudalarea. Derimot ble de mildeste lesjonene observert i frontal cortex, det mest rostrale området. Dette sekvensielle mønsteret er i samsvar med ruten for prionnevroinvasjon og -spredning gjennom CNS, som begynner ved inngangssteder i ryggmargen og obex og til slutt når frontal cortex [1,5,51].

Uventet, med tanke på deres anatomiske nærhet, observerte vi en drastisk reduksjon i PrPSc-avsetning og vakuolisering, og en betydelig nedgang i astrogliose, når vi flyttet fra thalamus til hippocampus, og ikke fulgte den gradvise caudo-rostral progresjonen av patologien.

En spesifikk mikrogliamorfologi kjent som stangmikroglia ble observert i nærheten av pyramidale celleneuroner ved CA3, men var fraværende fra alle de andre nevroanatomiske områdene som ble studert.

Så vidt vi kjenner til, har denne mikrogliale profilen ikke vært assosiert med nevrobetennelse utløst av prioner til dags dato, selv om en fersk studie rapporterte tilstedeværelsen av stavformede mikroglia i lillehjernen til menneskelige pasienter med CJD [52].

Selv om lite studert siden de første beskrivelsene på 1900-tallet, har stavmikroglia nylig blitt rapportert i nevrologiske lidelser som epilepsi, Lewy body demens, Huntingtons sykdom og AD, spesielt i moderat skadede områder av hjernebarken og hippocampus [40,41,53]. Det fenotypiske uttrykket og funksjonene til stangmikroglia er ennå ikke klart.

Imidlertid, det faktum at denne morfologiske egenskapen typisk sammenfaller med tilstedeværelsen av nevronale elementer som er skadet eller sårbare for skade, antyder en nevrobeskyttende rolle [42,54,55].

Rod-mikroglia antas ikke å være assosiert med alvorlige lesjoner, da progresjon mot ameboid-morfologi forventes under disse tilstandene [56]. Tilstedeværelsen av rodmicroglia i hippocampus hos skrapesyke-infiserte sauer, men ikke i andre hjerneregioner, kan tyde på et nevrobeskyttende miljø, i god overensstemmelse med det begrensede nevronale tapet observert i dette området.

Vår analyse av TLR-uttrykk avslører en direkte korrelasjon mellom alvorlighetsgraden av lesjonen og TLR-genoveruttrykk som faller sammen med den nevnte caudo-rostral progresjonen av prionnevropatologi.

Motsatt var TLR4 på samme måte overuttrykt i alle områder, uavhengig av alvorlighetsgraden av lesjonen. TLR4-overuttrykk i områder med mildere nevronal skade (dvs. hippocampus og frontal cortex) kan reflektere aneurobeskyttende rolle, som tidligere beskrevet for fagocytiske celler som makrofager og mikroglia [23,57]. Oppreguleringen av TLR7 er tidligere rapportert i musemodeller av priondisease og menneskelige pasienter [22,26,31].

Vi observerte bare oppreguleringen av TLR7 i medulla oblongata, det mest skadede området der de høyeste nivåene av spongiose og PrPSc-avsetning ble oppdaget.

Nevronal død via apoptose har tidligere vært assosiert med TLR7-stimulering [58,59], og dens overuttrykk i medulla oblongatama kan være relatert til denne mekanismen [60]. Selv om rollen til TLR1 i nevrodegenerative sykdommer ennå ikke er klar, har TLR2-engasjement i mikroglial aktivering i økende grad blitt demonstrert i amyotrofisk lateral sklerose, MS og AD [61,62].

Mens rollen til TLR2 i prionsykdommer ikke er fullt ut forstått, har gunstige effekter blitt foreslått: overlevelsestid reduseres hos mus som ikke uttrykker TLR2 etter intracerebral inokulering med skrapie [22].

TLR2 og MyD88 overekspresjon kan også være indikasjon på en proinflammatorisk mikroglia-fenotype, som kan forklare økningen i TNF- og IL -6 som vi observerte i thalamus [8,63].

Interessant nok har eksperimenter med EOC 13.31-celler, en udødeliggjort mikroglia-lignende musecellelinje, vist en dysregulering av den inflammatoriske responsveien som respons på TLR2-aktivering og antydet en kobling mellom TLR2-uttrykk og akkumulering av mikroglia i en tilstand som ikke er optimal for fagocytose [26] .

Derfor antyder TLR2-overekspresjon i medulla oblongata og thalamus, de mest skadede områdene der for høye nivåer av fagocytiske mikroglia også ble påvist, at den dysfunksjonelle clearance av PrPSc kan føre til vedvarende akkumulering av PrPSc og nevronskade [9,17].

Våre funn i hippocampus til skrapesyke-infiserte sauer avslører et motsatt mønster sammenlignet med andre analyserte hjerneområder, med nedregulering av TLR1, TLR2 og MyD88 og ingen cytokinendringer.

Dette kan tyde på at mikroglia reagerer forskjellig i hippocampus; faktisk, det har blitt vist at TLR2-mangel i primærmikrogliale cellekulturer, fra neonatale mus (0–3 dager gamle) og stimulert med nevrotoksisk peptid PrP106-126, skifter mikroglial aktivering fra en nevrotoksisk til en nevrobeskyttende fenotype [63 ].

Imidlertid har relevansen av PrP106-126-peptidet i prionpatologi blitt stilt spørsmål [64]. CD36 er en annen type mønstergjenkjenningsreseptor, i stand til å gjenkjenne endogent avledede ligander som amyloiddannende peptider, som har etablert roller i endocytisk opptak av disse komponentene [65,66]. Denne reseptoren har vært assosiert med en proinflammatorisk mikroglial status [67].

In vitro resulterer stimulering av BV-2-celler, en type immortalisert mikroglialcelle, med PrP106-126 i CD36-oppregulering, økende proinflammatoriske cytokiner og iNOS- og NO-produksjon [68,69].

I tillegg utløser gjenkjennelsen av -amyloidpeptid av CD36 samlingen av et nytt heterotrimerisk kompleksCD36-TLR4-TLR6 som aktiverer den medfødte immunresponsen [70,71].

I vår studie viste alle regioner signifikant oppregulering av CD36 bortsett fra hippocampus. Oppreguleringen av CD36, TLR4 og TLR6 i de mest skadede områdene, medulla oblongata og obex, antyder involvering av denne triaden i å utløse en pro-inflammatorisk mikroglial status i respons på prioninfeksjon.

Omvendt antyder fraværet av CD36 og TLR6 overekspresjon i hippocampus at denne heterotrimeren ikke dannes, noe som igjen indikerer aneurobeskyttende miljø i denne hjerneregionen.

Det gjenstår å forklare hvorfor mikroglia reagerer forskjellig i denne hjerneregionen. Mens prionstammespesifikk celletropisme kan bestemme mønsteret av mikrogliose og astrogliose, tyder nyere funn på at begge reaksjonene hovedsakelig er påvirket av hjerneregionen [18,72].

Verken mikroglia eller astroglia reagerer jevnt på tvers av CNS, og denne regionspesifikke responsen kan resultere i den selektive sårbarheten til noen hjerneregioner i prionsykdommer [16,18].

I denne forbindelse har det blitt postulert at den inflammatoriske responsen til mikroglia på prioninfeksjon er regulert av sialylering av PrPSc [14,73–75] og at PrPSc-sialylering er hjerneregionavhengig [18]. Spesifikt finnes et høyere nivå av sialylering av PrPSc i hippocampus og cortex enn i thalamus og hjernestammen, noe som tyder på en potensiell rolle i den selektive sårbarheten til disse hjerneregionene [18,73,75].

Det høye nivået av PrPSc-sialylering i hippocampus kan være assosiert med redusert prionreplikasjon, noe som fører til den særegne prioninduserte mikroglialaktiveringen i denne regionen, i samsvar med den reduserte følsomheten til denne regionen antydet av funnene våre.

Interessant nok tyder tidligere funn på at hippocampus kan være beskyttet mot prionnevrotoksisitet ved naturlig CJD-infeksjon [76,77], og detaljerte nevropatologiske studier av CJD-tilfeller har rapportert mildere lesjoner i hippocampus enn i andre hjerneregioner [76].

Spesielt ser det ut til at archicortex, som primært omfatter hippocampus, er relativt spart sammenlignet med andre kortikale regioner i CJD [77]. Dette milde hippocampus-engasjementet beskrevet i naturlig CJD er i samsvar med de nåværende funnene hos sauer som er naturlig infisert med skrapesjuke.

Interessant nok forekommer denne delvise beskyttelsen mot minst to naturlige prionsykdommer i hippocampus, som er fylogenetisk den eldste regionen i hjernebarken og består av den mest grunnleggende typen kortikalvev.

Ytterligere studier vil være nødvendig for å utforske relevansen av denne korrelasjonen. Oppsummert avslører resultatene våre spesielt mild nevropatologi i hippocampus til naturlig skrapesyke-infisert sau, preget av lavere nivåer av spongiose, PrPSc-deponering og astrogliose enn forventet gitt kaudal-to -rostral spredning av scrapielesjoner.

Dessuten, tilstedeværelsen i hippocampus av en eksklusiv mikroglial morfologi, stavmikroglia, som kan spille en nevrobeskyttende rolle [54], sammen med en distinkt mønstergjenkjenningsreseptor (TLR-gener og CD36) genekspresjonsprofil, skiller denne hjerneregionen ytterligere fra den andre neuroanatomiske regioner hos naturlig skrantesyke-infiserte sauer.

Disse funnene tyder på en grad av nevrobeskyttelse mot naturlig prioninfeksjon i hippocampus som fortjener videre undersøkelse. Nevrodegenerative sykdommer forårsaket av feilfolding av protein involverer en ond syklus av betennelse som består av feilfoldet proteinakkumulering, gliaaktivering og frigjøring av gliale inflammatoriske mediatorer, som forverrer proteinavsetning og nevroinflammasjon.

Å avbryte denne onde syklusen ved å målrette mikroglia-aktivering ved å bruke spesifikke TLR-hemmere på et spesifikt sykdomsstadium kan utgjøre en lovende tilnærming for å begrense ytterligere nevroinflammasjon. Funnene våre fremhever TLR2-nedregulering som et potensielt mål for en slik tilnærming, da dette kan indusere et skifte i mikroglia fra en nevrotoksisk til aneurobeskyttende fenotype [63].

Til slutt, mens det er gjort store fremskritt i å karakterisere mangfoldet av glialfenotyper ved bruk av musemodeller av nevrodegenerative sykdommer, er hvorvidt musemodeller trofast reflekterer nøkkelaspekter ved prionsykdommer et spørsmål om noen debatt [78,79].

Resultatene våre i den transgene modellen tg338 reproduserte de vanlige patologiske tegnene på prioninfeksjon, inkludert markert PrPSc-avsetning, neuropil spongiose, astrogliose og mikrogliose.

Imidlertid viste infiserte mus betydelig overekspresjon av TLR1 og TLR2 og tendens til TLR7-overuttrykk. Mens oppreguleringen av disse genene tidligere har blitt beskrevet i andre musemodeller infisert med skrantesjuke [22,26], står dette mønsteret i kontrast til funnene våre i sauehjernen. Bemerkelsesverdig nok, i musehjernen, observerte vi ingen endringer i uttrykket av TLR4, genet som de største endringene i uttrykket ble observert for i saueprøvene.

Disse motstridende funnene kan være en konsekvens av de forskjellige infeksjonsveiene og/eller prionproteinekspresjonsnivåene i tg338-mus [80,81]. Ikke desto mindre indikerer resultatene våre til slutt at intracerebralinokulering av skrantesjuke hos overdimensjonerte tg338-mus ikke reproduserer immunresponsen observert ved naturlig skrantesyke.

4. Materialer og metoder

4.1. Scrapie-infisert og kontroll sau

21 hunn Rasa Aragonesa sau (i alderen 2–6 år) ble inkludert i denne studien. Alle ble genotypet for PRNP-polymorfismer, som tidligere rapportert [82], og ble funnet å vise en ARQ/ARQ-genotype. Kontrolldyr (n=8) ble valgt fra en flokk der det ikke var rapportert om skrantesyke.

Skrapesyke-infiserte dyr (n=13) ble hentet fra skrapesjuke-påvirkede flokker og hadde blitt diagnostisert ved immunhistokjemi (IHC) av endetarmsslimhinnebiopsier. Infeksjon ble bekreftet ved post-mortem immundeteksjon av PrPSc i obex etter publiserte kriterier [83].

Dyrene ble avlivet ved en intravenøs overdose av barbiturater og blodsukker.

På tidspunktet for eutanasi viste alle skrapesyke-infiserte sauer kliniske tegn av ulik alvorlighetsgrad: noen dyr viste begynnende tegn som kløe i rygg og flanker etter digitalstimulering og mild reduksjon av kroppstilstanden, mens andre viste avanserte kliniske tegn som spontan riping av halerot, lumbalområde og lemmer, nevrologiske tegn inkludert ataksi og hodeskjelvinger, og tanngnissing, ulltap og intenst vekttap [84].

4.2. Infeksjon av Tg338-mus

For å evaluere TLR-genuttrykk i hjernen til en murin modell av skrapesyke, ti uker gamle tg338-mus (n=8) (overuttrykker VRQ/VRQ PrPC fra ovine 8- til 10-fold [ 85]) ble inokulert med en hjernepool fra en naturlig skrapesyke-infisert Rasa Aragonesa-sau som ble ofret på det kliniske stadiet.

Musene ble inokulert med 20 uL av scrapie-inokulumet (fortynnet 2 % w/v i PBS) inn i høyre hjernehalvdel under isofluranbedøvelse. Intracerebralinjeksjoner ble utført med en 50 µL sprøyte og en 25G nål. Etter inokulering ble temaet administrert en subkutan injeksjon av buprenorfin (0,3 mg/kg) for å indusere analgesi.

Som kontroller ble tg338-mus (n=8) inokulert med hjernehomogenat fra en skrantesyke-negativ sau etter samme prosedyre beskrevet ovenfor. Musene ble overvåket for utvikling av kliniske tegn og avlivet ved cervical dislokasjon når terminale tegn på sykdom som alvorlig ataksi og manglende evne til å spise dukket opp.

Mus infisert med det scrapie-positive inokulumet viste en gjennomsnittlig overlevelsestid på 187 ± 26 dpi.

4.3. Vevssamling

Prøver fra CNS ble samlet og delt sagittalt i to halvdeler; den ene ble fiksert i 10 % nøytralbufret formalin for histopatologisk og immunhistokjemisk analyse, og den andre ble direkte frosset og holdt ved -80 ◦C for proteinanalyse eller stabilisert i RNAlaterTM Solution (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA) for RNA-ekstraksjon og deretter frosset og lagret ved -80 ◦C.

4.4. PRNP-sekvensering

DNA ble ekstrahert fra blodprøver med Speedtools Tissue DNA Extraction Kit (Biotools, Madrid, Spania) i henhold til produsentens instruksjoner. PCR-amplifisering og sekvensering ble utført som beskrevet tidligere [82].

4.5. Immunhistokjemi

Formalinfiksert vev ble behandlet i henhold til standard histopatologiske prosedyrer. Vevsseksjoner ble innstøpt i parafin, kuttet i 4 µm tykke seksjoner og farget med hematoksylin-eosin (HE) for evaluering av vakuolering og neuropil spongiose.

IHC for PrPSc-deteksjon ble utført ved å bruke det monoklonale primære antistoffet fra mus L42 i sau (1:500 fortynning ved romtemperatur i 30 minutter) (R-Biopharm, Darmstadt, Tyskland) og kanin polyklonalt antistoff R4 86 i mus (1: 8000 fortynning, over natten ved 4 ◦C) (R. Jackman, upublisert) som tidligere beskrevet [86,87].

Seksjoner ble også utsatt for konvensjonell immunfarging for astrocyttmarkøren glial fibrillært surt protein (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Danmark), og mikrogliamarkøren ionisert kalsiumbindende adaptormolekyl 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond) , VA, USA), i henhold til publiserte protokoller [88]. Alle histologiske og IHC-evalueringer ble utført av to veterinærpatologer som var blindet for de kliniske dataene.

Vurderinger av spongiose og PrPSc-fargingsintensitet ble semikvantitativt utført og tilpasset etter kriteriene beskrevet i tidligere studier: vakuolering av neuropil og perikarya ble skåret fra 0 (fraværende) til 5 (svært tallrike og konfluente) [51], PrPSc-signalet ble kvantifisert basert på omfanget av immunfarging fra 0 (ingen merking) til 5 (intens uniform merking) som tidligere rapportert [89], og omfanget av GFAP og Iba1 immunmerking ble skåret på en skala fra {{ 8}} til 5 (0=svak farging; 5=betydelig immunmerking i hele regionen) som beskrevet [88]. Fire hjerneregioner ble evaluert: frontal cortex (Fc) thalamus (Th), hippocampusformasjon (Hc) og medulla oblongata (Mo), og hvert område ble globalt analysert for skåringen og grafisk representert som gjennomsnitt ± standardfeil.

4.6. Western Blot

100 mg hjernevev i hvert hjerneområde (Fc, Th, Hc og Mo) fra 13 skrapesyke-infiserte sauer, 8 med avanserte kliniske tegn og 5 med begynnende kliniske tegn, ble homogenisert i 1 ml lyseringsbuffer.

Hemiencephaloner fra de 8 infiserte og 8 kontrollmusene ble homogenisert ved 10 % (vekt/volum) i lyseringsbuffer. Vevsprøver var homogeniserte inngravingsrør (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ved bruk av en TeSeEPrecess 48 TM homogenisator (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), og proteinkonsentrasjonen ble målt ved hjelp av PierceTM BCA Protein Assay-settet (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.

For PrPres-analysen ble like proteinmengder fra vevshomogenater inkubert i 10 minutter ved 37 ◦C med proteinase K-løsning, som tidligere beskrevet [90].

De resulterende prøver ble utsatt for elektroforese i 12 % CriterionTM XT Bis-Tris Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og overført til PVDF-membraner som ble blokkert i 1 time med 2 % fettfri tørrmelk i TBST (Tris- bufret saltvann med 0,1 % Tween20).

For immunblotting ble membranene inkubert over natten ved 4 ◦C med Sha31primært antistoff (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Frankrike) i en konsentrasjon på 1 µg/mL etterfulgt av 1 times inkubasjon ved romtemperatur (RT) med pepperrotperoksidase- konjugert anti-muse IgG sekundært antistoff (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA).

Immunreaktivitet ble påvist ved bruk av det kjemiluminescerende substratet ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Tyskland). TLR4-proteinekspresjonen ble analysert fra vevshomogenatene blandet med 2×Laemmli prøvebuffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner .

Førti mikrogram totalt protein ble lastet per brønn, kjørt i 7,5%CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), og overført til PVDF-membraner, som deretter ble blokkert i 2 timer med 4% bovint serumalbumin (BSA)(Merck, Darmstadt, Tyskland) i TBST ved RT. Membranene ble inkubert over natten ved 4 ◦C med polyklonalt anti-TLR4-antistoff fra kanin (Novus Biological, Minneapolis, MN, USA) i en konsentrasjon på 0.5 µg/mL, og deretter vasket og inkubert med geit-antikanin-IgG ( H + L) HRP sekundært antistoff (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) ved 1:20,000 i 1 time ved RT.

Blotter ble visualisert som beskrevet ovenfor. Deretter ble membranene strippet med RestoreTM Western Blot Stripping-buffer (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) i 15 minutter ved 37 ◦C, vasket og blokkert igjen.

Deretter ble membranene inkubert over natten ved 4 ◦C med muse monoklonalt -aktin primært antistoff (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) ved 1:1000, vasket og inkubert med anti-mus m-IgGкBP-HRP sekundært antistoff (Santa Cruz Bioteknologi, Dallas, TX, USA) i 1 time. Etter vasking ble flekkene utviklet som beskrevet ovenfor.

Densitometrier ble utført med ImageJ-programvare og verdiene ble normalisert ved bruk av -aktin. De normaliserte verdiene ble representert med GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, USA).

De statistiske analysene for å sammenligne de infiserte gruppene og kontrollgruppene ble utført med en Students t-test, og varianslikheten ble bestemt av Levenes test ved å bruke SPSS-programvaren (SPSS Statistics for Windows, versjon 17.0, Chicago, IL, USA). Forskjeller mellom grupper ble ansett som statistisk signifikante ved * s<0.05.

4.7. RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese og genekspresjon

Sau totalt RNA ble ekstrahert fra 90 mg vevsprøver fra frontal cortex, thalamus, hippocampus og medulla oblongata. Musehjerner ble delt ved midtlinjen og totalt RNA ble ekstrahert fra<90 mg obtained from the thalamic area. 

Vev ble homogenisert ved hjelp av en TeSeEPrecess 48TM homogenisator (Bio-Rad) med RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) kombinert med TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, USA) for å fjerne mulig genomisk DNA-kontaminering. RNA-konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk med et NanoDrop-spektrofotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), og for hver prøve ble 260/280 og 260/230-forhold analysert for å verifisere prøverenheten.

Ett mikrogram komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert ved bruk av qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I tillegg ble effektiviteten av DNase-behandlingen vurdert i RT-negative prøver. Etter revers transkripsjon ble samme batch av fortynnet cDNA utsatt for qPCR for å amplifisere TLR.

To vanlig brukte husholdningsgener (HK) ble valgt for å normalisere uttrykket av målgenene: glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase (GAPDH) andactin-beta (ACT) [91]. Stabiliteten til dette HK-genet ble verifisert under våre eksperimentelle forhold. Messenger RNA (mRNA) uttrykk ble bestemt ved qPCR for 1 til 10 ovine TLR gener, 1 til 9 murine TLR gener og MyD88 genet for begge arter.

To proinflammatoriske (TNF- og IL-6) og to antiinflammatoriske (IL-10 og TGF-) cytokiner ble også studert i sauens thalamus og hippocampus. Primersekvenser og effektiviteter var tidligere publisert eller ble designet med Primer3Plus-verktøyet [92] (tabell 2).

Vi bekreftet effektiviteten til hvert gen som genererer en standardkurve ved å amplifisere 1:2 seriefortynninger av kontroll-cDNA og deretter sjekke for linearitet mellom initialmalkonsentrasjonen og syklusterskelverdiene (Ct). Alle gener viste en korrelasjonskoeffisient mellom 0.9 og 0.99, med en helningsverdi på standardkurvene i området -3.2 til -3.5 og en qPCR-effektivitet på 90–110 %.

qPCR-reaksjonene ble kjørt med Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR System, 96-godt med universelle amplifikasjonsbetingelser: et initialt aktiverings- og cDNA-denatureringstrinn på 10 minutter ved 95 ◦C, etterfulgt av 40 sykluser på 3 s ved 95 ◦C og 30 satt 60 ◦C.

For å identifisere tilstedeværelsen av uspesifikke PCR-amplikoner eller høye nivåer av primerdimerer, utførte vi en dissosiasjonskurveprotokoll etter hver qPCR-reaksjon. Hver prøve ble analysert i tre eksemplarer i et totalt reaksjonsvolum på 10 µL, bestående av 15 ng cDNA, 5 µL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), og den nødvendige mengden forover og bakover primere (tabell 2).

Nukleasefritt vann ble tilsatt til et sluttvolum på 10 µL. Nivåene av genuttrykk ble bestemt ved å bruke den komparative Ct-metoden. Resultatene ble representert som fold-endring og genuttrykksforskjellene i forhold til gjennomsnittsnivået til kontrollgruppen skalert til 1.

4.8. Dataanalyse og statistikk

Alle kvantitative data som ble samlet inn ble testet for normalitet med Shapiro–Wilk Wtest. Histologiske og immunhistokjemiske forskjeller mellom de infiserte og kontrollgruppene ble evaluert ved å bruke en Students t-test eller Mann–Whitney U-test avhengig av den parametriske eller ikke-parametriske datafordelingen.

Statistiske forskjeller mellom de fire forskjellige hjerneregionene hos skrapesyke-infiserte sauer ble bestemt ved å bruke enveis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en Bonferroni post hoc-test eller Kruskal-Wallis-test, avhengig av den parametriske eller ikke-parametriske datafordelingen. Statistiske analyser av qPCR-dataene ble utført fra gjennomsnittlige ∆Ct-verdier for hvert gen.

For den statistiske sammenligningen av infiserte grupper og kontrollgrupper ble en Students t-test eller Mann–Whitney U-test utført avhengig av normalfordelingen til hvert gen, og varianslikheten ble bestemt ved en Levene-test. Forskjeller i uttrykk ble ansett for å være signifikante ved p < 0.05.

Følgende notasjoner ble brukt for å angi p-verdier i figurene: * p < 0.05; ** p Mindre enn eller lik 0.01; # p < 0.1. SPSS (SPSS Statistics for Windows, versjon 17.0, Chicago, IL, USA) ble brukt for de statistiske analysene. Grafer ble generert med GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, USA) og dataene vist i figurene representerer gjennomsnittet og standardfeilen til gjennomsnittet (gjennomsnitt ± SEM).

5. Konklusjoner

Så vidt vi vet, er denne studien den første som beskriver ekspresjonsnivåene av TLR-gener i forskjellige hjerneregioner av naturlige skrapesyke-infiserte sauer og overdimensjonerte tg338-mus eksperimentelt infisert med skrapesyke.

Vår studie viser tydelig at TLR-er, og spesielt TLR4 hos sau og TLR1 og TLR2 hos mus, er involvert i patogenesen av skrapesyke. I tillegg, i motsetning til alle andre studerte regioner, er den særegne profilen til TLR-genuttrykk, sammen med den unike mikrogliale morfologien. og mild nevropatologi observert i hippocampus, antyder en hjerneregionspesifikk immunrespons ved naturlig scrapieinfeksjon.

Imidlertid vil ytterligere studier være nødvendig for å karakterisere TLR-uttrykk i mikroglia, astroglia og nevroner i skrapesykeinfeksjon for å forstå det nøyaktige bidraget til hver celletype til nevroinflammasjon. Videre er det ennå ikke bestemt om TLR-aktivering er en direkte respons på priontoksisitet eller oppstår sekundært til andre inflammatoriske mekanismer.

TLR-er utgjør et lovende mål for terapeutiske tilnærminger til toprionsykdommer, og derfor vil en bedre forståelse av TLR-regulerte nevroinflammatoriske responser være nødvendig for å sikre ytterligere fremskritt på dette området.

Tilleggsmateriell: Følgende er tilgjengelig online påhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Forfatterbidrag: Konseptualisering, forskning og datakurering, MCG og LMC; skrive-original utkast forberedelse, MG-M., MCG og LMC; eksperimentell metodikk, MG-M.;skrive-gjennomgang og redigering, MG-M., MCG, LMC og AO; in vivo metodikk, MB; fundingacquisition, RB og JJB; molekylær metodikk, BS-P.; supervision, MCG og JJB Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering: Denne forskningen ble finansiert av "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Aragon Government) gjennom prosjektet "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Uttalelse fra institusjonell vurderingskomité: Alle prosedyrer som involverer dyr fulgte retningslinjene inkludert i den spanske loven for dyrebeskyttelse RD53/2013 og EU-direktivet 2010/63 om beskyttelse av dyr brukt til eksperimentelle formål. Protokollen ble godkjent av Committee on the Ethics of Animal Experiments of the University of Zaragoza (tillatelsesnummer: PI38/159 oktober 2015 og PI19/14 11 april 2014).

Informert samtykkeerklæring: Ikke relevant.

Datatilgjengelighetserklæring: Dataene som presenteres i denne studien er tilgjengelige i artikkelteksten, figurene og tilleggsmaterialet.

Takk: Vi takker Olivier Andreoletti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) og VincentBeringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) for vennlige å gi tg338-musene som ble brukt til disse eksperimentene.

Interessekonflikter: Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter. Finansierne hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyser eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet, eller i beslutningen om å publisere resultatene. Bildene og figurene i dette manuskriptet er originaldata.

Referanser

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Tidlig akkumulering av PrP(Sc) i tarmassosiert lymfoid- og nervevev fra mottakelige sauer fra en Romanov-flokk med naturlig scrapie. J. Gen. Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prion-sykdommer og BSE-krisen. Science 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Tidlig spredning av skrapesjuke fra mage-tarmkanalen til sentralnervesystemet involverer autonome fibre i splanchnic og vagus nerver.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions og deres dødelige reise til hjernen. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, WE; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc sprer mønstre i hjernen til sauer knyttet til forskjellige priontyper. Vet. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Bevis for en tidlig inflammatorisk respons i sentralnervesystemet til mus med skrapesjuke. Nevrovitenskap 1996, 74, 1–5. [CrossRef]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner, S.; Wadsworth, JD; et al. Prionnevropatologi følger akkumuleringen av alternative prionproteinisoformer etter at den smittsomme titeren har nådd toppen. Nat. Commun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Definerer mikroglia som svar på tidsforløpet for kronisk nevrodegenerasjon. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia i prionsykdommer. J. Clin. Undersøk. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Rollen til mikroglia i prionsykdommer: et paradigme for funksjonelt mangfold.Front. Aldrende Neurosci. 2017, 9, 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Heterogenitet i distribusjonen og morfologien til mikroglia i den normale hjernen hos voksne mus. Nevrovitenskap 1990, 39, 151–170. [CrossRef]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Heterogenitet i astrocyttmorfologi og fysiologi. Brain Res. Rev. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com