Doble modulatoriske effekter av diosmin på kalsiumoksalat nyresteinsdannelsesprosesser: krystallisering, vekst, aggregering, krystallcelleadhesjon, internalisering i nyrerørceller og invasjon gjennom ekstracellulær matrise
Mar 16, 2022
for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Visith Thongboonkerda,*
aMedisinsk proteomikkenhet, kontor for forskning og utvikling, Det medisinske fakultet Siriraj sykehus, Mahidol University, Bangkok 10700, Thailand
bInstitutt for medisinsk teknologi, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
cUnit of Excellence in Integrative Molecular Biomedicine, School of Allied Health Sciences, University of Phayao, Phayao 56000, Thailand
Nøkkelord: Bioaktiv forbindelse, Flavonoid, Inhibitor, Modulator, Nephrolithiasis, Promoter, Urolithiasis
ABSTRAKT
Diosminer et naturlig flavonglykosid (bioflavonoid) som finnes i frukt og planter med flere farmakologiske aktiviteter. Det har vært mye brukt som kosttilskudd eller terapeutisk middel ved ulike sykdommer/lidelser. Selv om det anbefales, bevis på dens beskyttende mekanismer motnyresteinsykdom (nephrolithiasis/urolithiasis), spesielt kalsiumoksalat (CaOx) monohydrat (COM), som er den vanligste typen, forble uklar. I denne studien har vi dermed systematisk evaluert effektene avdiosmin(ved 2,5–160 nM) på ulike stadier avnyresteindannelsesprosesser, inkludert COM-krystallisering, krystallvekst, aggregering, krystall-celleadhesjon, internalisering i nyretubulære celler og invasjon gjennom ekstracellulær matrise (ECM). Resultatene viste detdiosminhadde doseavhengige modulerende effekter på alle de nevnte COM-nyresteinsprosessene.Diosminbetydelig økt COM-krystallantall og -masse under krystallisering, men redusert krystallstørrelse og -vekst. Samtidig somdiosminfremmet krystallaggregering, det hemmet krystallcelleadhesjon og internalisering i nyretubulære celler. Til slutt fremmet diosmin krystallinvasjon gjennom ECM. Dataene våre gir bevis som viser både hemmende og fremmende effekter av diosmin på COMnyresteindannelsesprosesser. Basert på disse doble modulerende aktivitetene til diosmin, er dets anti-urolitiasis-rolle tvilsomt, og det bør tas forsiktighet ved bruk inyresteinsykdom.
1. Introduksjon
Diosmin(3′,5,7-trihydroksy-4′-metoksyflavon-7-rhamnoglucosid) er et naturlig bioflavonoid som vanligvis finnes i forskjellige planter og frukter, hovedsakelig Citrus spp. [1,2]. Det kan syntetiseres eller avledes fra den andre flavonoiden, hesperidin [1,2]. Diosmin alene eller i kombinasjon med hesperidin er mye brukt som et flebotropisk legemiddel for behandling av venøse og lymfatiske lidelser som kronisk venøs insuffisiens og hemoroider [3,4]. I tillegg viser diosmin flere andre biologiske og farmakologiske aktiviteter, inkludert antioksidant og anti-inflammatorisk aktivitet [5,6], anti-mutagene og anti-neoplastiske egenskaper [7,8], antibiotika effekter [9], anti-hyperglykemiske egenskaper [ 10], og beskyttende effekter mot multiorganskader, dvs.
kardiovaskulær [11], retinal [12],nyre, lever- og hjerneskade [13].
Nyresteinsykdom (eller nefrolithiasis/urolithiasis) er forårsaket av de faste tannsteinene utviklet og avsatt inne i nyrene og rammer mennesker i alle områder av kloden med høy tilbakefallsrate [14–17]. Blant alle forskjellige kausative krystaller er kalsiumoksalat (CaOx), spesielt monohydratform (COM), den mest patogene og vanligste krystallinske komponenten som finnes i steindannere (pasienter med nyrestein) [18]. Mekanistisk har COM-krystaller den mest potente klebeevnen og mest cytotoksiske effekter på renale tubulære epitelceller [19,20]. Under steinpatogenesen har både Randalls plakkmodell og intratubulære hypotese fellestrekk ved COM-steindannelsesprosessene, inkludert COM-krystallisering, vekst, aggregering, retensjon ved overflateadhesjon på renale tubulære celler eller nyrebekken, internalisering i cellene og invasjon i cellene. nyre interstitium gjennom ekstracellulær matrise (ECM) [21,22].
Nylig har mange studier fokusert på legemiddeloppdagelsen ved å bruke medisinske planter/frukter og deres bioaktive forbindelser med sikte på å forhindre ny og/eller tilbakevendende steindannelse. En rekke tidligere rapporter har vist at enkelte bioaktive forbindelser, spesielt fenolforbindelser (polyfenol, flavonoid, flavonglykosid, etc.) utvunnet fra flere medisinske planter/frukter, har forebyggende effekter mot de patogene mekanismene tilnyresteinsykdom både in vitro og in vivo [23–25]. Blant disse gunstige stoffene har noen få rapporter antydet at diosmin kan forhindre avsetning av CaOx-krystaller inne i nyrevev i dyremodeller [26,27]. Imidlertid var dens nøyaktige modulerende rolle (hemming eller promotering) og mekanismer (stadier eller steindannelsesprosesser) i COM-nyresteindannelse ikke blitt undersøkt. Den foreliggende studien evaluerte dermed systematisk effektene avdiosmin(ved 2,5–160 nM) på ulike stadier avnyresteindannelsesprosesser, inkludert krystallisering, krystallvekst, aggregering, krystall-celle-adhesjon, internalisering til renale tubulære celler og invasjon gjennom ECM.
Klikk for åCistanche tubulosa dosering for nyrefunksjon
2. Materialer og metoder
2.1. Diosmin forberedelse
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokyo, Japan) ble oppløst med 100 prosent dimetylsulfoksid (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) og arbeidsalikvoter ble laget i sluttkonsentrasjonene 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160 nM for å undersøke effektene på COM-krystaller. I tillegg ble 100 prosent DMSO brukt som negativ kontroll i alle eksperimenter.
2.2. Cellekultur
MDCK renal tubulær epitelcellelinje avledet fra det distale tubulære segmentet av nefronet (ATCC; Manassas, VA) ble forplantet i Eagles minimum essensielle medium (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) supplert med 10 prosent føtalt bovint serum (FBS), 60 U/ml penicillin G (Sigma-Aldrich) og 60 ug/ml streptomycin (Sigma-Aldrich). Cellene ble holdt i en fuktet inkubator med 5 prosent CO2 ved 37 ◦C.
2.3. COM-krystalliseringsanalyse
COM-krystallisering ble utført som beskrevet tidligere [28,29]. Kort fortalt ble 500 ul 10 mM CaCl2⋅2H2O i krystalliseringsbuffer (inneholdende 10 mM Tris-HCl og 90 mM NaCl) (pH 7,4) tilsatt i hver brønn på 24-brønnplaten (Corning Inc.; Corning, NY). Et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 eller 160 nM) ble blandet med CaCl2. Til slutt ble 500 ul av 1,0 mM Na2C2O4 i krystalliseringsbufferen deretter tilsatt for å gjøre sluttkonsentrasjonene av CaCl2 og Na2C2O4 til henholdsvis 5 mM og 0,5 mM. Blandingen ble inkubert ved 25 ◦C i 1 time og deretter undersøkt. Krystallbilder ble tatt tilfeldig fra minst 15 høyeffektfelt (HPF) under Nikon Eclipse Ti-S invertert fasekontrast lysmikroskop (Nikon; Tokyo, Japan). Krystallstørrelse og antall ble målt fra minst 15 HPF-er for hver prøve ved å bruke NIS Element D-programvareversjon 4.11 (Nikon). Krystallmasse ble beregnet ut fra minst 100 krystaller i 15 HPF ved å bruke følgende formel: Krystallmasse (µm2/HPF)=Gjennomsnittlig krystallstørrelse i hvert felt (µm2) × Antall krystaller i hvert felt (/HPF) ( 1)
2.4. COM krystallvekstanalyse
Krystallvekstanalyse ble utført som beskrevet tidligere [30,31].
Kort fortalt ble et likt volum (500 ul) av 10 mM CaCl2⋅2H2O og 1,0 mM Na2C2O4 i krystalliseringsbuffer blandet (1:1) (v/v) i hver brønn i { {12}}brønnplate. Blandingen ble inkubert ved 25 ◦C i 1 time for å tillate fullstendig krystallisering. På dette tidspunktet (T0), et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 eller 160 nM) ble tilsatt i hver brønn og blandingen ble videre inkubert i 60 minutter (T60). Ved T0 og T60 ble krystallbilder tatt tilfeldig fra minst 15 HPFs under Nikon Eclipse Ti-S invertert fasekontrast lysmikroskop. Krystallstørrelser ved T0 og T60 ble målt ved bruk av NIS Element D programvareversjon 4.11 (Nikon), mens krystallvekst (representert ved Δ Krystallstørrelse) ble beregnet fra minst 100 krystaller i 15 HPF-er ved å bruke følgende formel: Δ Krystallstørrelse (µm2)=Krystallstørrelse ved T60 − Krystallstørrelse ved T0 (2)
2.5. COM krystallaggregeringsanalyse
Krystallaggregeringsanalyse ble utført som beskrevet tidligere [32,33]. COM-krystaller ble generert som nevnt ovenfor i krystallvekstanalysen, men med et større volum i et 50-ml konisk rør (Corning Inc.) og deretter høstet ved sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter. Supernatanten ble kastet, mens COM-krystaller ble vasket tre ganger med metanol. Etter en ny sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter, ble metanol kastet og krystallene ble lufttørket over natten ved 25 ◦C. COM-krystaller (1000 µg tørrvekt) ble resuspendert i 1 ml krystalliseringsbuffer i hver brønn på 6-brønnplaten (Corning Inc.). Et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 eller 160 nM) ble tilsatt i COM-krystallsuspensjonen i hver brønn. Platen ble kontinuerlig ristet i en rysteinkubator (Zhicheng; Shanghai, Kina) ved 150 rpm og 25 ◦C i 1 time. Deretter ble dannelsen av COM-krystallaggregat (definert som "en sammenstilling av tre eller flere individuelle COM-krystaller som er tett knyttet sammen" [32]) undersøkt og avbildet under Nikon Eclipse Ti-S invertert fasekontrast lysmikroskop. Antall COM-krystallaggregater ble talt fra minst 15 tilfeldige HPF-er per brønn.
2.6. COM krystallcelle-adhesjonsanalyse
Krystallcelle-adhesjonsanalyse ble utført som beskrevet tidligere [34,35]. Kort fortalt ble COM-krystaller generert som nevnt ovenfor i et 50-ml konisk rør og deretter høstet ved sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter. Supernatanten ble kastet, mens COM-krystaller ble vasket tre ganger med metanol. Etter en ny sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter, ble metanol kastet og krystallene ble lufttørket over natten ved 25 ◦C. Krystallene ble dekontaminert med UV-lysstråling i 30 minutter før intervensjon med cellene.
MDCK-celler (med en tetthet på 2 × 105 celler/brønn) ble sådd og dyrket i hver brønn på 6-brønnplaten (Corning Inc.) i 48 timer for å oppnå konfluent monolag. Kulturmediet ble deretter forfrisket før tilsetning av COM-krystaller (100 ug tørrvektskrystaller per ml kulturmedium). Et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 eller 160 nM) ble tilsatt i hver brønn. Cellene ble videre inkubert i en fuktet inkubator med 5 prosent CO2 ved 37 ◦C i 1 time. Deretter ble cellene kraftig vasket med PBS fem ganger og avbildet under Nikon Eclipse Ti-S invertert fasekontrast lysmikroskop. Antallet av de gjenværende COM-krystallene festet til renal tubulær celleoverflate ble talt fra minst 15 tilfeldige felt per brønn.
Cistanche for nyrefunksjon
2.7. COM-krystallinternaliseringsanalyse
De fluorescensmerkede COM-krystallene ble generert som beskrevet tidligere [36,37]. Sammensetninger/konsentrasjoner av kjemikalier brukt til krystallisering var de samme som nevnt ovenfor for de vanlige (ikke-merkede) krystallene, men 0.1 µg/ml fluorescein isothiocyanat (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) var tilsettes til CaCl2⋅2H2O-løsning før blanding med Na2C2O4. De påfølgende trinnene (krystallisering og høsting) ble utført som nevnt ovenfor, men i mørket.
For å evaluere krystallinternalisering i renale tubulære epitelceller, ble MDCK-celler (med en tetthet på 2 × 105 celler/brønn) sådd og dyrket i hver brønn på 6-brønnplaten (Corning Inc.) i 48 timer for å oppnå sammenflytende monolag. Cellemonolaget ble inkubert med FITC-merkede COM-krystaller (1000 µg krystall/ml medium) i en fuktet inkubator med 5 prosent CO2 ved 37 ◦C i 1 time. Deretter ble cellene vasket med PBS og inkubert med trypsin-EDTA-løsning for å eliminere ikke-internaliserte (både adherente og ikke-adherente) krystaller. Prosentandelen av cellene med internaliserte krystaller ble kvantifisert fra totalt 10 000 ervervede hendelser ved bruk av et flowcytometer (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA). Cellene inkubert med vanlige (umerkede) COM-krystaller ble brukt for å forhåndsinnstille støyen og terskelen for det positive fluorescenssignalet. Cellene med positive fluorescenssignaler ble deretter talt og brukt for slik prosentberegning.
2.8. COM-krystallinvasjon gjennom ECM-analyse
COM-krystaller ble fremstilt som beskrevet ovenfor for krystallaggregering og krystallcelleadhesjonsanalyser. Krystallinvasjonsanalyse ble utført i henhold til protokoll etablert tidligere [38,39]. Kort fortalt, totalt 20 µg COM-krystaller belagt med krystalliseringsbuffer (blank kontroll), DMSO (negativ kontroll), albumin (Sigma-Aldrich) (positiv kontroll) ellerdiosmin(2,5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 eller 160 nM) ble lagt til 200 ul MEM. Deretter ble 200 ul av 0,3 pM Lys-plasminogen (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) i PBS blandet og inkubert med krystall-proteinkomplekset ved 37 ◦C i 1 time. Det ubundne plasminogenet ble kastet ved sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter og pelleten ble vasket med PBS én gang. Deretter ble 100 ul av 0,15 pM urokinaseplasminogenaktivator (uPA) (Fitzgerald Industries International) i PBS blandet med krystall-protein-plasminogen/plasmin-komplekset. Blandingen ble deretter tilsatt på toppen av matrisegelen inne i ECM-migrasjonskammeret og inkubert ved 37 ◦C. Etter 24- timers inkubering ble løsningen igjen på den øvre delen av migrasjonskammeret fjernet ved å bruke et gasbind eller silkepapir. De invaderte COM-krystallene inne i matrisegelen ble deretter avbildet ved hjelp av et lysmikroskop med differensiell interferenskontrast (DIC)-modus (Nikon H600L). Krystallinvasjonsavstanden ble målt og gjennomsnittsberegnet fra minst 15 laveffektfelt (LPF-er) i samme kammer ved bruk av NIS Element D-programvareversjon 4.11 (Nikon).
2.9. Statistisk analyse
Alle de ovennevnte eksperimentene ble utført i tre eksemplarer (tre uavhengige eksperimenter) og de kvantitative dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SEM. Flere sammenligninger ble utført ved bruk av enveis variansanalyse (ANOVA) med Tukeys post-hoc test. Pearson korrelasjonstest ble utført for å bestemme sammenhengen mellom variabler. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av SPSS-programvare (versjon 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). P-verdi mindre enn 0.05 ble ansett som statistisk signifikant.
3. Resultater
3.1. Effekt av diosmin på COM-krystallisering
Krystallisering er et av de essensielle tidlige trinnene inyresteindannelsesprosesser av alle typer. Etter 1-h krystallisering med eller utendiosminved forskjellige konsentrasjoner (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 eller 160 nM), ble COM-krystallstørrelse og antall målt og krystallmasse ble beregnet. Krystallisasjonsbuffer og fortynningsmidlet DMSO tjente som henholdsvis blindprøve og negativ kontroll. Dataene viste at alle doser (2,5–160 nM) av disomin reduserte krystallstørrelsen betydelig, men økte krystalltallet på en doseavhengig måte sammenlignet med blanke og negative kontroller (fig. 1A–1C). I samsvar med krystalltallet økte krystallmassen doseavhengig (fig. 1D). Totalt sett indikerer disse dataene at diosmin fremmer COM-krystallisering (neokrystaller).
3.2. Effekt av diosmin på COM-krystallvekst
Den modulerende effekten avdiosminpå COM ble krystallvekst evaluert ved å måle endring i krystallstørrelse (Δ Krystallstørrelse) etter 60-min videre inkubering etter fullføring av det første krystalliseringstrinn, når neokrystaller var fraværende. Resultatene viste at alle doser (2,5–160 nM) av disomin reduserte Δ-krystallstørrelsen signifikant på en doseavhengig måte sammenlignet med de blanke og negative kontrollene (fig. 2). Disse funnene indikerer at diosmin hemmer COM-krystallvekst.
3.3. Effekt av diosmin på COM-krystallaggregering
I tillegg til krystallvekst, er aggregering av individuelle krystaller som fester seg tett sammen et annet viktig skritt undernyresteinpatogenese. Den høye graden av krystallaggregering kan til slutt føre til steinforstørrelse og obstruksjon av små renal tubulær lumen. Sammenligning med tomme og negative kontroller,diosminved 10–160 nM doseavhengig økt antall COM-krystallaggregater (fig. 3). Disse resultatene indikerer at diosmin fremmer COM-krystallaggregering.
Cistanche for nyrefunksjon
3.4. Effekt av diosmin på COM-krystallcelleadhesjon
Oppbevaring av de forårsakende krystallene er et av de avgjørende trinnene fornyresteindannelse og kan induseres av krystall-celle-adhesjon som hindrer krystallene i å drive ut sammen med urinutstrømningen. Vi evaluerte dermed den modulerende aktiviteten tildiosminpå COM-krystallcelleadhesjon. Dataene avslørte at diosmin ved 5–160 nM betydelig reduserte klebeevnen til COM-krystaller på renale tubulære celler på en doseavhengig måte sammenlignet med blanke og negative kontroller (fig. 4). Disse dataene indikerer at diosmin hemmer COM-krystallcelleadhesjon.
3.5. Effekt av diosmin på COM-krystallinternalisering i renale tubulære celler
Etter adhesjon kan noen COM-krystaller internaliseres i de renale tubulære cellene og forårsake flere påfølgende cellulære responser [37,40]. Krystallinternalisering ble evaluert ved å bruke FITC-merkede COM-krystaller og kvantifisert ved flowcytometri. Vanlige COM-krystaller (uten merking) ble brukt for å trekke fra teknisk støy og for å sikre at fluorescensintensiteten var fra FITC-signalet. Sammenlignet med blanke og negative kontroller ble prosentandelen av cellene med internaliserte krystaller betydelig redusert meddiosminved 10–160 nM på en doseavhengig måte (fig. 5). Funnene indikerer at disomin hemmer COM-krystallinternalisering i renale tubulære celler.
3.6. Effekt av diosmin på COM-krystallinvasjon gjennom ECM
Krystallinvasjon gjennom ECM er en patogen/destruktiv prosess undernyresteinpatogenese som kan utløse ulike inflammatoriske responser og kaskader, og dermed forverre sykdomsmekanismene. Vi undersøkte dette fenomenet ved å bruke en etablert protokoll basert på plasminogen-plasmin-aktiviteten til krystall-proteinkomplekset [38,39]. Resultatene viste at alle doser av disomin (2,5–160 nM) betydelig forbedret COM-krystallinvasjonen gjennom ECM på en doseavhengig måte (fig. 6). Interessant nok,diosminved 160nM kunne fremme COM-krystallinvasjonen som kan sammenlignes med albumin, som er den kjente potente promoteren for COM-krystallinvasjon [41] (fig. 6). Disse resultatene indikerer at diosmin sterkt fremmer COM-krystallinvasjon gjennom ECM.
Fig. 1. Effekt avdiosminpå COM-krystallisering. Krystalliseringsanalyse ble utført med et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160 nM). (A): Krystallmorfologi i hver tilstand etter 1-h krystallisering. Opprinnelig forstørrelse var 400× for alle paneler. (B): Krystallstørrelse. (C): Krystallnummer. (D): Krystallmasse (se formel 1 i "Materialer og metoder") ble analysert fra minst 100 krystaller i 15 HPF. Hver søyle representerer gjennomsnitt ±SEM av dataene avledet fra 3 uavhengige eksperimenter. *=s< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 2. Effekt avdiosminpå COM-krystallvekst. Krystallvekstanalyse ble utført etter at krystalliseringen var fullført (for å forhindre nykrystallisering) med et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160nM). (A): Krystallmorfologi i hver tilstand ved T0 og T60. Opprinnelig forstørrelse var 400 × for alle paneler. (B)-(J): Histogrammer av krystallstørrelser målt fra individuelle krystaller ved T0 og T60 i hver gruppe. (K): Δ Krystallstørrelse (se formel 2 i "Materialer og metoder") ble analysert fra minst 100 krystaller i 15 HPF. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SEM av dataene avledet fra 3 uavhengige eksperimenter. *= p < 0,05="" vs.="" tom="" kontroll;="" #="p">< 0,05="" vs.="">
Fig. 3. Effekt avdiosminpå COM-krystallaggregering. Krystallaggregeringsanalyse ble utført med et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160 nM). (A): Mikrofotografier av de aggregerte COM-krystallene (merket med stiplede sirkler). Opprinnelig forstørrelse var 400 × for alle paneler. (B): Antall krystallaggregater ble talt fra minst 15 tilfeldige HPF-er i hver brønn. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SEM av dataene avledet fra 3 uavhengige eksperimenter. *=s< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Fig. 4. Effekt avdiosminpå COM-krystallcelleadhesjon. Krystallcelleadhesjonsanalyse ble utført med et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160 nM). (A): Mikrografer av de gjenværende krystallene som festet seg tett på cellemonolaget etter fjerning av de ubundne krystallene ved kraftig vask med PBS. Opprinnelig forstørrelse var 200 × for alle paneler. (B): Antall adhererte krystaller ble talt fra minst 15 tilfeldige felt i hver brønn. Hver søyle representerer gjennomsnitt ±SEM av dataene avledet fra 3 uavhengige eksperimenter. *{{8 poeng<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Fig. 5. Effekt avdiosminpå COM-krystallinternalisering i renale tubulære celler. Krystallinternaliseringsanalyse ble utført ved bruk av FITC-merkede COM-krystaller (FITC-COM), mens de vanlige (ikke-merkede) COM-krystallene ble brukt for bakgrunns-/støysubtraksjon. Analysen ble utført med et likt volum (4 ul) krystalliseringsbuffer (blankkontroll), DMSO (negativ kontroll) eller diosmin (2,5–160nM). (A): Flowcytometrisk dot-plot-analyse av størrelse (y-akse) og FITC-fluorescensintensitet (x-akse) av cellene etter fjerning av ikke-internaliserte krystaller med 0,1 prosent trypsin/2,5 mM EDTA. (B): Prosentandel av cellene med internaliserte FITC-merkede COM-krystaller. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SEM av dataene avledet fra 3 uavhengige eksperimenter. *= s<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Fig. 6. Effekt avdiosminpå COM-krystallinvasjon gjennom ECM. Krystallinvasjon gjennom ECM-analyse ble utført ved bruk av COM-krystaller belagt med krystalliseringsbuffer (blank kontroll), DMSO (negativ kontroll), albumin (positiv kontroll) eller diosmin (2,5–160nM). (A): Mikrofotografier av COM-krystallene invaderte eller migrerte gjennom ECM-migrasjonskammeret. Opprinnelig forstørrelse var 100 × for alle paneler. (B): Krystallinvasjonsavstand ble målt fra minst 15 tilfeldige LPF-er i hvert kammer. Hver søyle representerer gjennomsnitt ±SEM av dataene avledet fra 3 uavhengige eksperimenter. *= s<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Diskusjon
Nyresteinssykdom er forårsaket av dannelse av tannstein inne inyreog pelvokalyceal system. Vanlige prosesser for dannelse av nyrestein inkluderer COM-krystallisering, vekst, aggregering, retensjon ved krystallcelleadhesjon og invasjon gjennom nyrenes interstitium rik på ECM [21,22]. Det er flere forsøk på å forhindre denne sykdommen ved å bruke en rekke medisiner og/eller kosttilskudd. Mange linjer med nyere bevis har rapportert at flavonoider, flavonglykosider og andre forbindelser ekstrahert fra sitrusfrukter kan ha forebyggende effekter på nyresteinsykdom og andre lidelser [23–25]. Blant disse,diosmin, et naturlig flavonglykosid- og hesperidinderivat som hovedsakelig finnes i sitrusfrukter [1,2], har blitt foreslått å spille en forebyggende rolle mot skade og skade pånyrevev [13,42]. Dessuten har dens anti-urolitiasis-rolle blitt rapportert i noen få tidligere studier med dyremodeller [26,27]. Likevel forble de gunstige effektene og underliggende mekanismene til diosmin i forebygging av nyrestein uklare. Vi undersøkte dermed den modulerende aktiviteten til diosmin på COM-krystaller. De systematiske analysene ble gjort på ulike stadier av COMnyresteindannelse, inkludert krystallisering, krystallvekst, aggregering, krystall-celle-adhesjon, internalisering til nyrerørceller og invasjon gjennom ECM.
Etter oralt inntak avdiosmin, varierer plasmanivået hos mennesker fra {{0}},5 til 200ng/ml (eller 0,8–300nM) [43,44]. Maksimal plasmakonsentrasjon (Cmax) er omtrent 50 ng/ml (eller 85 nM) [43,44]. Derfor var dosene av diosmin brukt i vår nåværende studie (2,5–160 nM) i det farmakologisk relevante området for dets farmakokinetikk. Fordi DMSO ble brukt som fortynningsmiddel for å fullstendig oppløse diosmin i henhold til anbefaling, ble DMSO brukt som negativ kontroll i denne studien i tillegg til blankkontrollen for å sikre at det ikke var noen effekter fra selve fortynningsmidlet som kunne forstyrre datatolkningen. I alle analyser viste dataene at det ikke ble observert noen signifikante effekter fra DMSO, og alle de kvantitative dataene fra den negative kontrollen var sammenlignbare med de fra blindkontrollen.
COM-krystalliseringsanalyse viste at alle konsentrasjoner avdiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 og 160nM) kunne redusere COM-krystallstørrelsen, men på den annen side økte antallet krystaller. Ettersom krystallmasse er sluttproduktet av både krystallstørrelse og antall og er mer relevant for å gjenspeile graden av COM-krystallisering, evaluerte vi om diosmin påvirket denne krystallindeksen. Dataene viste at alle konsentrasjoner av diosmin hadde den fremmende effekten på COM-krystallmasse, i samsvar med dataene om krystallantall. Etter krystallisering kan COM-krystaller vokse videre til større størrelse for neste trinnnyresteinformasjon.
I motsetning til krystallisering, viste diosmin i alle konsentrasjoner den hemmende effekten på COM-krystallvekst på doseavhengig måte. Noen tidligere studier har rapportert at løseligheten til CaOx-krystaller kan økes av derivater av hydroksyantrakinoner med glykosylering [45]. I tillegg kan tilstedeværelsen av sukker i slike bioaktive forbindelser bindes med fritt kalsiumion muligens på grunn av hydroksylgruppene i molekylstrukturen, og dermed hemme dannelsen av CaOx-krystaller [45,46]. Diosmin kan også påvirke overgangen av de solubiliserte kalsium- og oksalationene til COM-krystallinske partikler i renal tubulær væske i prosessen med COM-krystallisering basert på denne mekanismen.
Ikke desto mindre ble COM-krystallaggregering fremmet med 10–160nMdiosmin, som impliserer evnen til diosmin til å fungere som en linker eller adhesiv molekyl for å rekruttere individuelle krystaller for å binde seg sammen for å danne krystallaggregatene. Denne bindingen resulterer også i progresjon av klebende broer mellom individuelle krystaller og kan indusere den store strukturdannelsen av COM-krystaller, som lett bidrar til avsetning av steinnidus inne inyre[32].
COM-krystallretensjon gjennom adhesjon av krystaller på renale tubulære celleoverflater har blitt etablert som et annet viktig trinn for nyresteindannelse [47]. Våre data avslørte at diosmin kunne redusere den adhesive evnen til COM-krystaller til å binde seg til apikale overflater av MDCK-nyre-tubulære celler. Noen tidligere studier har vist at glykosaminoglykaner (polysakkaridforbindelser) belagt på CaOx-krystaller eller uttrykt på renale tubulære celler kan forstyrre klebeevnen til CaOx-krystaller på renale tubulære celler [48]. I tillegg er uttrykket av krystallreseptorer på renale tubulære celler en av de avgjørende mekanismene som bestemmer krystallcelleadhesjon [21]. Mens CaOx-krystaller induserer skade på apikale membraner, spesielt mikrovilli, kan noen polyfenoler som epigallocatechin gallat (EGCG) forhindre krystallcelleadhesjon og cellulær skade [49]. Dessuten er det tidligere rapportert at flavonoidstoffer i forskjellige planteekstrakter øker pH-nivået i urinen, noe som fører til hemming av krystallcelleadhesjon [50,51]. Kanskje,diosminkan også dempe slik cellulær skade indusert av COM, og dermed redusere krystallcelleadhesjon.
COM-krystallinternalisering har vist seg hovedsakelig ved endocytose via aktincytoskjelettmediert makropinocytosevei [40]. Flavonoider som quercetin har blitt rapportert å påvirke aktincytoskjelett som kreves for makropinocytose [52,53]. Funnene våre viste at diosmin betydelig reduserte evnen til MDCK-celler til å internalisere COM-krystaller. En slik hemmende effekt av diosmin kan være assosiert med montering eller organisering av aktincytoskjelett inne i cellene som direkte påvirker makropinocytoseveien [54,55].
Etter internalisering ble COM-krystallene degradert av endolysosomer, noe som resulterte i økninger av frie kalsium- og oksalationer i nyrenes interstitium [37]. Slike økninger i kalsium- og oksalationer kan føre til COM-neokrystallisering i nyrenes interstitium [56,57]. I tillegg kan tilstedeværelsen av interstitielle COM-krystaller være fra defekter av stramme koblinger og paracellulære adhesjonsbarrierer, noe som resulterer i økt paracellulær permeabilitet og krystalltranslokasjon [58–60]. Disse krystallene kan deretter invadere nyrenes interstitium gjennom ECM og deretter utløse flere inflammatoriske responser og vevsskader [58–60]. I denne studien observerte vi at invasjonen av COM-krystaller gjennom ECM-migrasjonskammeret ble indusert av alle konsentrasjoner av diosmin. Diosmin kan binde seg til COM-krystalloverflatene og interagere med plasminogen-plasmin-systemet som drev krystallmigrasjonen i ECM-migrasjonskammeret [38,39].
Cistanche for nyre
Fordidiosmininduserte både hemmende og fremmende effekter på forskjellige forskjellige prosesser for COM-steindannelse, bestemte vi derfor forholdet deres ved å bruke Pearson-korrelasjonstest. Korrelasjonsanalysen viste at krystalltallet var omvendt korrelert med både krystallstørrelse og krystallvekst (Δ Krystallstørrelse) (fig. 7A og B). Krystallstørrelse korrelerte sterkt med krystallvekst (fig. 7C), men omvendt korrelert med krystallmasse (fig. 7D). Til slutt korrelerte krystallmasse sterkt med både krystallantall og krystallaggregering (fig. 7E og F). Fra korrelasjonsanalysen indikerer dataene at krystallantall og krystallmasse er mer relevante for å reflektere krystallisering enn krystallstørrelse (fig. 7A, D og E). I tillegg er størrelsen på neokrystaller under krystallisering relatert til vekst av de forhåndsformede krystallene (fig. 7C), mens krystalliseringsgrad (som reflektert av krystallantall og krystallmasse) er nært knyttet til grad av krystallaggregering (fig. 7E og F). Imidlertid er disse korrelasjonene mest sannsynlig spesifikke for diosmin-effektene, mens effekter fra andre modulatorer kan ha eller ikke ha de samme korrelasjonene. For eksempel reduserer fibronektin krystallmasse og hemmer krystallvekst, men fremmer krystallaggregering [31]. I tillegg øker intakt levedyktig Escherichia coli krystallstørrelse og masse, men har ingen effekter på krystallantall [33]. Disse dataene indikerer at korrelasjonene mellom ulike COM-krystallanalyser ikke er universelle for alle modulatorer.
Til slutt har vi oppsummert resultatene oppnådd fra forskjellige analyser og integrert dem med de patogene mekanismene tilnyresteinsykdom (se skjema i fig. 8). Fra korrelasjonsanalysen fremmer diosmin krystallisering (fig. 8A). Mellom krystallisering og krystallvekst,diosminholder en god balanse ved å fremme krystallisering, men på den annen side hemme krystallvekst (fig. 8B). Når det gjelder alle effektene på COM-krystaller alene (uten hensyn til celler og ECM som også griper inn), er den fremmende aktiviteten til diosmin mer fremtredende enn dens hemmende aktivitet på COM-krystaller, da den fremmer både krystallisering og krystallaggregering, men hemmer bare krystallvekst ( Fig. 8C). Selv om krystalliseringen øker, avtar krystallstørrelsen og er assosiert med vekstinhiberingen (fig. 7C). Disse dataene er i samsvar med resultatene rapportert av Kavanagh et al. [61–63], som viser at økningen i krystallisering fører til nedgang av overmetning av kalsium- og oksalationer i løsningen, og reduserer dermed veksten. Krystallvekst er imidlertid ikke den eneste faktoren som bestemmernyresteinpatogenese [64], spesielt når krystallmassen overvelder og er assosiert med økningen av krystallaggregering (fig. 7F) som kan øke sjansen for at krystallmaterialer setter seg fast i små rørformede segmenter (i den intratubulære hypotesen), og derved øker sjansen for steindannelse. Dessuten har en tidligere studie vist dataene i samsvar med funnene våre, noe som indikerer at økningen i krystallantall er assosiert med økningen av krystallaggregering og steinforstørrelsen [63].
Fig. 7. Korrelasjonsanalyse. (A)–(F): Korrelasjoner mellom COM-krystallnummer, krystallstørrelse, Δ Krystallstørrelse, krystallmasse og en rekke krystallaggregater ble analysert ved Pearson-korrelasjonstest.
Fig. 8. Skjematisk oppsummering av de modulerende effektene avdiosminpå COMnyresteindannelsesprosesser. (A): Effekter av diosmin på COM-krystallisering. (B): Effekter av diosmin på COM-krystallisering og krystallvekst. (C): Effekter av diosmin på COM-krystallisering, vekst og aggregering. (D): Effekter av diosmin på hele COM nyresteinsdannelsesprosesser.
Når interaksjoner med renale tubulære celler og ECM vurderes, vil det globale bildet av de doble effektene avdiosminpå COM blir nyresteindannelsen mye tydeligere (fig. 8D). Diosmin hemmer krystallcelleadhesjon, og reduserer derved krystallinternalisering i cellene. Dette kan forklares at den mindre størrelsen på COM-krystaller har mindre klebende evne til å binde de renale tubulære cellene sammenlignet med de større som rapportert i vår nylige studie [34] og tidligere studie av en annen gruppe [65]. Den mindre klebeevnen til de mindre COM-krystallene skyldes deres mindre klebekraft til celleoverflaten og færre antall COM-krystallreseptorer bundet til dem som bestemt av henholdsvis atomkraftmikroskopi og proteomanalyse [34]. Diosmin hemmer også krystallinternalisering. Legg merke til at internaliseringsprosessen er et tveegget sverd som trenger nøye tolkning. Internalisering eller endocytose i en av forsvarsmekanismene som cellene brukte for eliminering av krystaller av endolysosomer. Imidlertid genererer nedbrytning av de intakte krystallene frie kalsium- og oksalationer som kan bevege seg fra intracellulært rom til det renale interstitium, hvor de kan generere neokrystaller [56,57]. På den annen side fremmer diosmin krystallinvasjon gjennom ECM, som er en av mekanismene som er viktige for nyresteinspatogenese (spesielt i Randalls plakkmodell) [58–60]. Totalt sett oppsummerer fig. 8D alle de doble modulatoriske effektene av diosmin på COMnyresteindannelsesprosesser. Det skal bemerkes at balansen mellom disse fremmende og hemmende effektene ikke kan beregnes nøyaktig (i motsetning til en matematisk ligning). Dessuten er det flere andre endogene og eksogene faktorer som også kan gripe inn i steindannelsesprosessene. Endelig viser diosmin også flere indirekte effekter på dannelse av nyrestein, inkludert dets antioksidant- og antiinflammatoriske egenskaper [5,6] som bør tas i betraktning. Derfor er det endelige resultatet av disse doble modulerende effektene avdiosminpå COMnyresteindannelse trenger ytterligere in vivo-undersøkelse og prospektiv studie med stor kohort.
5. Konklusjoner
Oppsummert rapporterer vi her de doble effektene av diosmin på COM-krystallmodulasjon på en doseavhengig måte. Mens det hemmer COM-krystallvekst, krystallcelleadhesjon og internalisering til nyrerørceller,diosminfremmer COM-krystallisering, aggregering og invasjon gjennom ECM. Derfor er dens anti-urolitiasis-rolle tvilsom, og det bør tas forsiktighet ved bruk ved nyresteinsykdom.
CRediT forfatterbidragserklæring
Supaporn Khamchun: konseptualisering, metodikk, programvare, validering, formell analyse, undersøkelse, datakurering, skriving – originalutkast, visualisering, Sunisa Yoodee: konseptualisering, metodikk, programvare, validering, formell analyse, undersøkelse, datakurering, skriving – originalutkast, Visualisering, besøk Thongboonkerd: konseptualisering, metodikk, programvare, validering, ressurser, skriving – gjennomgang og redigering, veiledning, prosjektadministrasjon, anskaffelse av finansiering.
Erklæring om interessekonflikt
Forfatterne erklærer INGEN interessekonflikt.
Anerkjennelser
Vi er takknemlige for den tekniske bistanden til Kittiya Suwannakud. Dette arbeidet ble støttet av The Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council (NXPO) gjennom PMU-B og Thailand Research Fund (IRN60W0004). VT er også støttet av "Chalermphrakiat" Grant, Fakultet for medisin Siriraj Hospital.
Referanser
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– isolasjonsteknikker, bestemmelse i plantemateriale og farmasøytiske formuleringer, og klinisk bruk, Nat. Prod. Commun. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Metabolisme og farmakologiske aktiviteter av den naturlige helsebringende forbindelsen diosmin, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: evaluering av effekter på livskvalitet ved kronisk venøs insuffisiens, Angiology 57 (2006) 131–138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Mikronisert renset flavonoidfraksjon: en gjennomgang av bruken ved kronisk venøs insuffisiens, venøse sår og hemorroider, Drugs 63 (2003) 71–100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-inflammatorisk, den antioksidant og anti-apoptotisk aktivitet av diosmin i eddiksyre-indusert ulcerøs kolitt, Hum. Exp. Toxicol. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin undertrykker de proinflammatoriske mediatorene i lipopolysakkarid-induserte RAW264.7-makrofager via NF-kappaB og MAPKs signalveier, Gen. Physiol. Biofys. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin induserer apoptose gjennom modulering av STAT-3-signalering i 7,12 dimethylbenz(a)antracene-indusert harmster buccal pouch carcinogenesis, Biomed. Pharm. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, Diosmin-indusert senescens, apoptose og autofagi i brystkreftceller med forskjellig p53-status og ERK-aktivitet, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117–130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Kombinasjon av gjenbrukt medikament diosmin med amoxicillin-klavulansyre forårsaker synergistisk hemming av mykobakteriell vekst, Sci. Rep. 9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, Antihyperglykemisk virkning av diosmin, en sitrusflavonoid, induseres gjennom endogent beta-endorfin i type I-lignende diabetiske rotter, Clin. Exp. Pharm. Physiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminforbehandling forbedrer hjertefunksjonen og undertrykker oksidativt stress i rottehjerte etter iskemi/reperfusjon, Eur. J. Pharm. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin beskytter rottenetthinnen mot iskemi/reperfusjonsskade, J. Ocul. Pharm. Ther. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Beskyttende effekter av hesperidin og diosmin mot akrylamid-indusert lever, nyre, og hjerneoksidativ skade hos rotter, Environ. Sci. Forurense. Res. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, AD Rule, Determining the true burden ofnyresteinsykdom, Nat. Rev. Nephrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nephrolithiasis, Prim. Care 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Renal stones, Ann. Clin. Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Stone composite and vascular calcifications in patients with nephrolithiasis, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Steinanalyse, Urol. Res. 34 (2006) 146–150.
[19] A. Vinaiphat, S. Aluksanasuwan, J. Manissorn, S. Sutthimethakorn, V. Thongboonkerd, Response of renal tubular cells to differential types and doses of calcium oxalate crystals: integrative proteome network analysis and functional research, Proteomics 17 (2017) ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Proteinnettverksanalyse og funksjonelle studier av kalsiumoksalatkrystallindusert cytotoksisitet i renale tubulære epitelceller, Proteomics 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nephrolithiasis: molekylær mekanisme for nyresteindannelse og den kritiske rollen som spilles av modulatorer, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mechanisms of stone formation, Clin. Rev. Bone Miner. Metab. 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Protective roles of flavonoids and flavonoid-rich planteextracts against urolithiasis: a review, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Dietary plants for the prevention and management ofnyresteiner: preklinisk og klinisk bevis og molekylære mekanismer, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, The mechanistic insight of polyphenols in calcium oxalate urolithiasis mitigation, Biomed. Pharm. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Evaluering av beskyttende effekter av diosmin (en sitrusflavonoid) i kjemisk indusert urolithiasis hos eksperimentelle rotter, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminreduserer kalsiumoksalatavsetning og vevsdegenerasjon ved nefrolithiasis hos rotter: en stereologisk studie, koreanske J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Faktorer som bestemmer typer og morfologier av kalsiumoksalatkrystaller: molare konsentrasjoner, buffering, pH, omrøring og temperatur, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120–131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Proteomic analysis of calcium oxalate monohydrate crystal-indused cytotoxicity in distale renal tubular cells, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Forlengelsesfaktor Tu on Escherichia coli isolert fra urin fra nyresteinpasienter fremmer kalsiumoksalatkrystallvekst og aggregering, Sci. Rep. 7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Modulatory effects of fibronectin on calcium oxalate crystallization, growth, aggregation, adhesion on renal tubular cells, and invation through extracellular matrix, J. Biol. Inorg. Chem. 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Definere og systematiske analyser av aggregeringsindekser for å evaluere graden av kalsiumoksalatkrystallaggregering, Front. Chem. 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum er ansvarlig for å fremme effekten av levedyktig Escherichia coli på kalsiumoksalatkrystallisering, krystallvekst og krystallaggregering, Front. Microbiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Differensial bound proteins and adhesive capabilities of calcium oxalate monohydrate crystals with different sizes, Int. J. Biol. Macromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Surface heat shock protein 90 tjener som en potensiell reseptor for kalsiumoksalatkrystall på apikale membran av renale tubulære epitelceller, J. Biol. Inorg. Chem. 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Ikke-radioaktiv merking av kalsiumoksalatkrystaller for undersøkelser av krystall-celleinteraksjon og internalisering, Anal. Metoder 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongboonkerd, Calcium oxalate monohydrate krystaller internalisert i renale tubulære celler brytes ned og oppløses av endolysosomer, Chem. Biol. Samhandle. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, En ny analyse for å evaluere fremmende effekter av proteiner på kalsiumoksalatkrystallinvasjon gjennom ekstracellulær matrise basert på plasminogen/plasminaktivitet, Talanta 101 (2012) 240–245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Calcium oxalate crystals økte enolase-1 sekresjon fra renale tubulære celler som deretter forsterket krystall- og monocyttinvasjon gjennom nyreinterstitium, Sci. Rep. 6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Makropinocytose er hovedmekanismen for endocytose av kalsiumoksalatkrystaller inn i nyrenes tubulære celler, Cell Biochem. Biofys. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: en database fornyresteinmodulerende proteiner med eksperimentelt bevis, Sci. Rep. 10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Effektene av diosmin på aflatoksin-indusert lever- og nyreskade, Environ. Sci. Forurense. Res. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Comparative bioavailability of twodiosminformuleringer etter oral administrering til friske frivillige, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Pharmacokinetics of flavanone glycosider etter inntak av enkeltdoser ferskpresset appelsinjuice versus kommersielt bearbeidet appelsinjuice hos friske mennesker, J. Agric . Food Chem. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Syntese av glykosidderivater av hydroksyantrakinon med evne til å oppløse og hemme dannelsen av krystaller av kalsiumoksalat. Potensielle forbindelser i nyresteinsterapi, Eur. J. Med. Chem. 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Studie av en myo-inositol heksafosfatbasert krem for å forhindre dystrofisk calcinosis cutis, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Proteomics of crystal-cell interactions: a model for nyrestein research, Cells 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Krystallretensjon ved nyresteinsykdom: en avgjørende rolle for glykosaminoglykanet hyaluronan? J. Am. Soc. Nephrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Microvillar injury in renal tubular epitelial cells induced by calcium oxalate crystal and the protective role of epigallocatechin-3-gallate, FASEB J. 31 (2017) 120 –131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Totale flavonoider av Desmodium styracifolium demper dannelsen av hydroksy- L-prolin-indusert kalsiumoksalat urolithiasis hos rotter, Urolithiasis 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Systematisk evaluering for effekter av urin pH på kalsiumoksalatkrystallisering, krystallcelleadhesjon og internalisering i nyretubulære celler, Sci. Rep. 7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Inhiberende effekt på fagocytose av Candida albicans indusert ved forbehandling med quercetin via aktin-cytoskjelettinterferens, J. Tradit. Hake. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin hemmer LPS-indusert makrofagmigrasjon ved å undertrykke iNOS/FAK/paxillin-veien og modulere cytoskjelettet, celleadhes . Migr. 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, Makropinocytose-mediert membranresirkulering driver nevrale kammigrasjon ved å levere F- aktin til lamellipodium, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, F-aktinbindende RapGEF GflB er nødvendig for effektiv makropinocytose i Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalens, patofysiologiske mekanismer og faktorer som påvirker urolithiasis, Int. Urol. Nephrol. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mechanisms of human kidney stone formation, Urolithiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19–32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Mitokondriell dysfunksjon ognyresteinsykdom, Front. Physiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Histologiske aspekter av "fast-partikkel"-modellen for steindannelse: dyrestudier, Urolithiasis 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Hvordan dannes steiner? Er det mulig å forene teorier om steindannelse? Arch. Esp. Urol. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Metoder for studiet av kalsiumoksalatkrystallisering og deres anvendelse på urolithiasisforskning, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, diskusjon 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Kalsiumoksalat krystalliseringskinetikk ved forskjellige konsentrasjoner av menneskelig og kunstig urin, med et konstant forhold mellom kalsium og oksalat, Urol. Res. 27 (1999) 231-237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, krystalluri og aggregering: nøkkelingredienser for steinforstørrelse, Urol. Res. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverse engineering the kidney: modellering calcium oxalate monohydrate crystallization in the nephron, Med. Biol. Eng. Comput. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Effekten av intrakrystallinsk og overflatebundet osteopontin på bindingen av kalsiumoksalatdihydratkrystaller til Madin-Darby hundenyre (MDCK) celler i ultrafiltrert human urin, BJU Int. 109 (2012) 1100–1109.