Cistanche: Echinacoside undertrykker pankreatisk adenokarsinom cellevekst ved å indusere apoptose via den mitogenaktiverte proteinkinasebanen

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG og XINFENG LI

Abstrakt.

Den kliniske anvendelsen av naturlige produkter avledet fra tradisjonell kinesisk medisin har fått oppmerksomhet i kreftkjemoterapeutika.Echinacoside(ECH), en av fenyletanoidene, isolert fra stilkene tilCistanche(en kinesisk urtemedisin) har vevsbeskyttende og anti-apoptotiske effekter på sentralnervesystemet. Imidlertid er det stort sett unnvikende om ECH har tumor-undertrykkende aktivitet. I denne studien ble det demonstrert at ECH markant kan hemme spredningen av adenokarsinomceller i bukspyttkjertelen ved å indusere produksjonen av reaktive oksygenarter og forstyrrelsen av mitokondriell membranpotensial og dermed utløse apoptose. Videre ble det belyst at ECH(Echinacoside)undertrykker tumorcellevekst gjennom modulerende MAPK-aktivitet. Avslutningsvis avslører denne studien en ny funksjon av ECH(Echinacoside) for å forhindre kreftutvikling, og innebærer at bruken av ECH kan være en potensiell kjemoterapeutisk strategi for kreft.

Introduksjon

P53-tumorsuppressorveien via induksjon av tumorsuppressoren, ARF reduserer den onkogene E3-ligase muse-dobbeltminutt (MDM)2-mediert p53-nedbrytning (3). Dette er en autoregulert, selvbeskyttende mekanisme som forhindrer celler fra ondartet transformasjon. Spesielt kan p53 undertrykke Myc-aktivitet ved å transkripsjonelt aktivere for eksempel miR-145 som er målrettetMycmRNA for translasjonsdemping (4,5), og danner dermed en reguleringssløyfe for negativ tilbakemelding.

Den mest enkle og effektive strategien for å behandle kreft er å drepe kreftcellene. De ofte brukte kreftmedisinene, som cisplatin (6), actinomycin D (7) og adriamycin (8), er vist å hemme tumorvekst ved å fremme apoptose. Nylig har økende bevis vist at en rekke naturlige produkter og derivater fra planter, spesielt fra medisinske planter brukt i tradisjonell kinesisk medisin (TCM), viser en tumor-undertrykkende funksjon ved å indusere apoptose av kreftceller og har potensial for klinisk anvendelse. i kreftbehandling (9). For eksempel er det naturlige antrakinonemodinet isolert fra mange typer kreftceller (10,11). Camptothecin, avledet fra det kinesiske "lykkelige treet",Camptotheca skarpsynt, er et verdifullt naturprodukt som hemmer ligeringen av DNA etter topo I-mediert trådbrudd (12). I en annen retrospektiv populasjonsbasert kohortstudie av totalt 729 pasienter med avansert brystkreft, ble det antydet at TCM-terapi kan bidra til kreftbehandling. Av denne kohorten var 115 pasienter TCM-brukere mens 614 pasienter ikke brukte TCM. Den multivariate analysen viste at, sammenlignet med ikke-brukere, var bruk av TCM assosiert med en signifikant redusert risiko for dødelighet av alle årsaker (13). Alle de nevnte funnene indikerte at TCM er en viktig komplementær og alternativ medisin som kan brukes i behandlingen av kreft.

mus med akutt lungeskade (16,17). Også ECH(Echinacoside)har vist seg å ha beskyttende effekter på nervevev og forbedre atferdsforstyrrelser i murine modeller av Parkinsons sykdom (18). Spesielt har det blitt funnet at ECH fremmer celleproliferasjon og hemmer apoptose i museintestinale MODE-K-celler (19). Så langt har imidlertid mindre oppmerksomhet blitt viet til den potensielle rollen til ECH i kreftforebygging.

I denne studien ble det undersøkt om ECH-behandling påvirker tumorcellevekst og spredning og om ECH(Echinacoside)induserer apoptose, øker produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) og reduserer mitokondriell membranpotensial (MMP), og undertrykker følgelig tumorcellevekst. Videre hadde den nåværende studien som mål å identifisere de molekylære mekanismene som er ansvarlige for ECH-mediert cellevekstinhibering.

Materialer og metoder

Celle linje, reagens, og antistoffer.SW1990 pankreasadenokarsinomceller (ATCC, Manassas, VA, USA) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium supplert med 10 prosent føtalt bovint serum, 50 U/ml penicillin og 0,1 mg/ml streptomycin ved 37˚C i en 5 prosent CO2 fuktet atmosfære. ECH(Echinacoside)ble kjøpt fra Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, Kina). Antistoffer mot AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 og GAPDH ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); anti-Bax og anti-Bcl-2 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA); og anti-Caspase-3 ble kjøpt fra Abcam (Shanghai, Kina).

Celle levedyktighetanalyse. For å vurdere hastigheten på tumorcellevekst ble celletellesett {{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Cellesuspensjoner ble sådd ved 5,000 celler per brønn med ECH-behandling i 0, 12, 24, 48 eller 72 timer i 96 -brønnkulturplater. Cellevekstinhibering ble bestemt ved å tilsette WST-8-reagens fra CCK-8-settet i en sluttkonsentrasjon på 10 prosent til hver brønn, og absorbansen til prøvene ble målt ved 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342 farging.Celler (60 prosent konfluens) ble behandlet med Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kina) ved en sluttkonsentrasjon på 1µg/ml, inkubert i 37˚C inkubator i 15 minutter, vasket med fosfatbufret saltvann to ganger, fikset i 4 prosent paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur og montert på objektglass. De morfologiske endringene av cellekjernene ble observert under et fluorescensmikroskop (Olympus BX51, Melville, NY, USA). De normale kjernene var runde og farget lyseblått, mens de apoptotiske kjernene var krympet og farget knallblått.

Fluorescensaktivert celle sortering (FACS) analyser.For vurdering av apoptose ble fluorescein isothiocyanat (FITC)-Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, Shanghai, Kina) brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble 5x104 celler vasket med iskald PBS, resuspendert i 0,1 ml bindingsbuffer (Beyotime Institute of Biotechnology), og farget med 10 ml FITC-konjugert Annexin V (10 mg/ml) og 10 ml propidiumjodid (PI) (50 mg/ml). Etter inkubering i 15 minutter ved romtemperatur i mørket og tilsetning av 400 ml bindingsbuffer, ble cellene analysert med et flowcytometer (C6; BD Biosciences, Shanghai, Kina).

Mål av reaktive oksygen arter (ROS).For å evaluere produksjonen av ROS ble analysesettet for reaktive oksygenarter (Vigorous Biotechnology, Beijing, Kina) brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble celler (80 prosent konfluens) høstet og vasket med PBS før farging med dihydroetidium (DHE) løsningen (Beyotime Institute of Biotechnology). Celler ble deretter analysert ved flowcytometriske analyser.

Mål av mitokondrie membran potensiell (MMP).

Et tetrametylrhodamin-metylester (TMRM) analysesett (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA) ble brukt for å oppdage endringene i MMP. Kort fortalt ble celler (80 prosent konfluens) høstet, vasket med PBS og farget med TMRM i 15-20 minutter i en 37˚C inkubator. Celler ble deretter vasket én gang med PBS og utsatt for flowcytometriske analyser.

Immunblottinganalyser. Cellene (80 prosent konfluens) ble høstet og lysert i RIPA-buffer (Jrdun Biotechnology) bestående av 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 prosent NP-40, 1 prosent natriumdeoksycholsyre og 0,1 prosent SDS og nytilsatte proteasomhemmere. Like mengder klart cellelysat ble brukt for immunoblotting-analyse som beskrevet tidligere (20).

Statistisk analyse.Kvantitative data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistiske forskjeller ble evaluert av uparet Students t-test ved bruk av statistisk SPSS 15.0-programvare. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultater

ECH (Echinacoside)undertrykker svulst cellevekst. Selv om det er rapportert at ECH(Echinacoside)viser en beskyttende rolle ved å hemme apoptose og inflammatoriske signaler i somatiske celler, som nevronale og intestinale epitelceller (16-19), er det fortsatt unnvikende om ECH kontrollerer kreftcellevekst og -proliferasjon. For å teste dette ble en celleoverlevelsesanalyse utført ved å behandle SW1990-celler, avledet fra et adenokarsinom i bukspyttkjertelen, med titrerte doser av ECH som vist i fig. 1. Spesielt ble det demonstrert at ECH signifikant forsinker tumorcelleproliferasjon i en dose. -avhengig måte i løpet av en 5-dagers kulturperiode (fig. 1).ECH utløserapoptose. Siden tap av apoptose er en av de viktigste årsaksmekanismene som ligger til grunn for den ukontrollerte spredningen av kreftceller i bukspyttkjertelen (21), utførte denne studien et sett med eksperimenter for å avgjøre om ECH utløser apoptose. For det første, ved å farge kjernene til tumorceller med Hoechst 33342, ble det demonstrert at ECH resulterer i apoptose på en doseavhengig måte (fig. 2A). I tillegg ble FACS-analyser utført ved bruk av Annexin V/PI-farging for ytterligere å bekrefte den apoptotiske effekten av ty ECH (fig. 2B). Gjennomsnittlig prosentandel av apoptotiske celler var 1,1 prosent under normale dyrkningsforhold, mens denne prosentandelen økte signifikant til 10,6, 21,4 og 51,3 prosent som respons på ECH-behandling på en doseavhengig måte (fig. 2C). Disse resultatene, sammen med cellelevedyktighetsanalysen vist i fig. 1, viser at ECH-behandling undertrykker spredningen av tumorceller ved å utløse apoptose.

generere etidium som interkalerer med DNA, ble brukt i denne studien for å evaluere ROS-produksjon. Det ble funnet at, i likhet med andre kreftmedisiner, stimulerer ECH også ROS-produksjon på en doseavhengig måte som vist av den forhøyede fluorescensintensiteten ved ECH-behandling (fig. 3).

ECH (Echinacoside)reduserer MMP.Mitokondriell dysfunksjon har vist seg å være involvert i induksjon av apoptose. Åpning av mitokondriell permeabilitetsovergangspore har vist seg å indusere depolarisering av transmembranpotensialet og frigjøring av pro-apoptotiske faktorer (23). Derfor ble det testet om ECH kunne indusere tap av MMP i tumorceller ved å utføre en TMRM-analyse, som er en veletablert tilnærming, da intensiteten av TMRM-fluorescens er proporsjonal med membranpotensialet. Det ble vist at ECH-behandling reduserer MMP signifikant på en doseavhengig måte (fig. 4).ECH kontroller svulst celle vekst via mitogenaktivert proteindet molekylære grunnlaget for ECH-mediert tumorcelledød, aktiviteten til flere vitale signalveier, som MAPK og AKT (24,25), som kontrollerer celleoverlevelse og -død, ble undersøkt. MAPK-ene er evolusjonært konserverte, prolin-rettede Ser/Thr-proteinkinaser, inkludert ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERKs), c-Jun NH 2-terminal kinase (JNKs) og p38-familiemedlemmene som aktiveres gjennom tre- tier kinase signalering kaskader (26,27). I denne studien ble uttrykket av MAPK-er og AKT, så vel som deres aktiverte fosforylerte former, vurdert, og det ble avslørt at ECH undertrykker JNK- og ERK1/2-aktivitet markant, men øker p38-aktiviteten (fig. 5). Spesielt ble det vist at AKT-aktivitet, som også er kritisk viktig for celleproliferasjon, ikke påvirkes av ECH-behandling (fig. 5). I tillegg ble det vist at ECH-behandling øker uttrykket av Bax og Caspase-3 samtidig som det reduserer Bcl-2-uttrykket (fig. 5), noe som samsvarer med fig. 2. Resultatene indikerer derfor at ECH utløser tumorcelleapoptose via MAPK-veien.

Diskusjon

Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser at ECH har en tumor-undertrykkende funksjon ved å utløse apoptose (fig. 2), fremme ROS-produksjon (fig. 3) og indusere mitokondriell membranpotensialdepolarisering (fig. 4). , som følgelig fører til hemming av tumorcellevekst (fig. 1). Videre ble den molekylære grunnlaget for ECH-mediert tumorcelledød vist å skje ved å regulere MAPK-signalveier (fig. 5). Disse funnene demonstrerer en ny funksjon av ECH for å forhindre tumorgenese og antyder dermed at det kan være et kandidatmiddel for kreftbehandling.

Flertallet av kreftmedisiner kan indusere tumorcelleapoptose, senescens og/eller cellesyklusstans, noe som fører til hemming av tumorcellevekst og spredning. Cellesyklusstans er en cellulær respons på milde stresssignaler som lar celler reparere skadet DNA før de starter replikativ DNA-syntese eller mitose, mens apoptose og senescens (permanent cellesyklusstans) oppstår som respons på stresssignaler som eliminerer irreparable eller ondartede celler ( 28,29). Derfor ble bare den apoptotiske effekten av ECH på tumorceller vurdert i denne studien, da dreping av kreftceller er et hovedkriterium for å evaluere styrken til et kreftmiddel. Spesielt ble det demonstrert at ECH induserer uttrykket avBax(Fig. 5), et pro-apoptotisk gen, transkripsjonelt aktivert av tumorsuppressoren p53 (30). Dermed er det verdt å teste om ECH kan aktivere p53-signalveien. I så fall kan ECH også være i stand til å fremkalle p53-avhengig cellesyklusstans, senescens, apoptose eller autofagi. I denne studien ble den tumor-undertrykkende funksjonen til ECH i SW1990 pankreatisk adenokarsinomcellelinje belyst. Det er imidlertid nødvendig med ytterligere studier som observerer flere kreftcellelinjer i bukspyttkjertelen. Det er vist at mutasjoner i det onkogene proteinet RAS og tumorsuppressoren p53 er assosiert med utvikling av kreft i bukspyttkjertelen (31); SW1990-cellelinjen har imidlertid ingen p53-mutasjon, ifølge IARC p53-databasen (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Derfor er det viktig å undersøke om ECH kan påvirke veksten og spredningen av andre kreftcellelinjer i bukspyttkjertelen med forskjellige p53-mutasjoner. I tillegg ville det være interessant å finne ut om ECH er i stand til å fremme apoptose og hemme veksten av andre typer svulster.

ROS-økning og MMP-reduksjon, som ble forårsaket av ECH-behandling, har vist seg å være avgjørende for apoptoseinduksjon (22). I tillegg har det blitt funnet at ROS kan indusere oksidasjon av mitokondrieporene som bidrar til frigjøring av cytokromc, et mellomprodukt i apoptose, på grunn av forstyrrelse av MMP (22). Dermed gjenstår det å fastslå om ECH forstyrrer MMP indirekte gjennom induksjon av ROS. Dessuten har ROS-utløst oksidativt stress også vist seg å være involvert i å modulere et utall av cellevekstkontrollerende signaler, inkludert p53, NF-KB, HIFs og PI3K (32). Det gjenstår å bestemme om og i så fall hvordan ECH regulerer disse viktige signalveiene. Spesielt forårsaker oksidativt stress ulike nevrodegenerative sykdommer på grunn av høyt oksygenforbruk, svake antioksidative systemer og terminale differensieringsegenskaper i sentralnervesystemet (33). Imidlertid har flere studier vist at ECH har beskyttende og anti-apoptotiske effekter på nervevev. I denne forbindelse er det rimelig å anta at ECH kan redusere ROS-produksjonen i de terminal-differensierte nevrale cellene. Derfor gjenstår det også å bestemme om reguleringen av ROS-produksjon av ECH er avhengig av celledifferensieringsstatus. Derfor viser de nåværende resultatene sammen med andre studier at ECH, den mye brukte TCM, kan være en viktig kjemoterapeutisk strategi, ikke bare for behandling av nevrodegenerative sykdommer, men også ondartede karsinomer.

Nylig har bruk av TCM i kreftbehandling fått stadig mer oppmerksomhet. Potensialet til naturlige produkter fra medisinske planter brukt i TCM har blitt anerkjent av det vitenskapelige miljøet selv i den vestlige verden (9). Det kreves innsats for å belyse de underliggende virkningsmekanismene til disse naturlige produktene, som til slutt kan føre til utvikling av effektive og trygge medisiner for kreftbehandling.

Avslutningsvis demonstrerte denne studien den tumorhemmende funksjonen til ECH og utdyper også det molekylære grunnlaget for ECH-mediert tumorundertrykkelse, og antyder dermed den potensielle kliniske anvendelsen av ECH i kreftterapi.

Anerkjennelser

Denne studien ble finansiert og støttet av FMUs nøkkelprogram for vitenskapelig forskning (stipend nr. 09ZD014). Forfatterne vil gjerne takke Biomedworld (Shanghai, Kina) for hjelpen med å redigere manuskriptet.

Referanser

1. Hanahan D og Weinberg RA: Kjennetegn på kreft: Den neste generasjonen. Celle 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkripsjon: De transkripsjonelle effektene av MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ og Roussel MF: Myc-signalering via ARF-tumorsuppressoren regulerer p53-avhengig apoptose og immortalisering. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K og Mo YY: p53 undertrykker c-Myc gjennom induksjon av tumorsuppressoren miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X og Lu H: Ny innsikt i p53-funksjoner gjennom målmikroRNAene. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB og Lippard SJ: Cisplatin og DNA-reparasjon i kreftkjemoterapi. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H og Korc M: Actinomycin D induserer apoptose og hemmer veksten av kreftceller i bukspyttkjertelen. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P og Dass CR: Doxorubicin: En oppdatering om molekylær virkning mot kreft, toksisitet og nye medikamentleveringssystemer. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS og Kaina B: Fra tradisjonell kinesisk medisin til rasjonell kreftbehandling. Trender Mol Med 13: 353-361, 2007.