Del 2:Acteosid undertrykker RANKL-mediert osteoklastogenese ved å hemme C-Fos-induksjon og NF-KB-vei og dempe ROS-produksjon

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Vennligst klikk her tilbake til del 1

AkteosidHemmer beinresorpsjon av makrofager Acteosid forhindret også RANKL-mediert benresorpsjon på en doseavhengig måte, målt med et in vitro modellsystem (fig. 3A). Benresorpsjon ble signifikant hemmet når BMM ble inkubert med 1 mM akteosid (fig. 3B). En 10 mM akteosidbehandling svekket nesten fullstendig RANKL-indusert gropdannelse av BMMer. Tilsvarende reduserte akteosid benresorpsjon i RANKL-stimulerte RAW264.7-celler (fig. S2A og B). Akteosids evne til å hemme benresorpsjon var avhengig av tidspunktet for behandlingen i forhold til RANKL-stimulering. Acteosid (10 mM) tilsatt 4 dager etter RANKL-stimulering reduserte ikke gropdannelse i BMM, mens det undertrykte antall dannede osteoklaster (fig. 3C). Dette forskjellige resultatet var delvis på grunn av gropen området allerede dannet etter 4 dager med RANKL stimulering formasjon (fig. 3D).

CISTANCHE EKSTRAKT

AkteosidNedregulerer tidlige RANKL-signalveier

RANKL induserer aktivering av 3 velkjente MAPKer og NF-kB i osteoklastforløpere, og denne aktiveringen er nødvendig for tidlig osteoklastdifferensiering. For å forstå de mulige mekanismene somakteosidhemmer osteoklastogenese, undersøkte vi effekten avakteosidpå MAPK-er og NF-kB-aktivering i makrofager. BMM-er og RAW264.7-celler ble forbehandlet med 10 mM akteosid i 2 timer og deretter stimulert med 100 ng/ml RANKL i 30 minutter. MAPK-fosforylering ble undersøkt ved Western blotting og immunometrisk analyse. RANKL induserte fosforylering av p38, ERK og JNK i BMM-er (fig. 4A) og RAW264.7-celler (fig. 4B). Acteosid forhindret disse RANKL-induserte økningene i p-p38, p-ERK og p-JNK. Dette resultatet ble støttet av immunometrisk analyse, som forbehandling med 10 mM acteosid signifikant hemmet nivåene av fosforylerte MAPK-er i disse makrofagene (fig. 4C). RANKL-behandling økte DNA-bindingen av NF-kB, mens acteosid hemmet RANKL-indusert aktivering av NF-kB-DNA-binding (fig. 5A). Denne hemmingen var mer fremtredende i BMM enn i RAW264.7-celler. Acteosid reduserte også RANKL-stimulert p65- og IkBa-fosforylering i BMM-er og RAW264.7-celler (fig. 5B og C). Tilsetning av 10 mM akteosid hemmet nesten fullstendig både nedbrytningen og aktiveringen av IkBa i BMMer (fig. 5B). For ytterligere å bekrefte at NF-kB-aktivering er involvert i virkningen av akteosid, ble kB-promotor-luciferase-konstruksjoner forbigående transfektert inn i RAW264.7-celler. Cellene inkubert med 100 ng/ml RANKL hadde 3- ganger høyere kB-promoteraktivitet, som ble signifikant svekket av 10 mM acteosid (fig. 5D).

AkteosidUndertrykker produksjonen av inflammatoriske cytokiner og uttrykket av TNF-a, c-Fos og NFATc1 i RANKL-stimulerte makrofager TNF-a, IL-1b og IL-6 er viktige i osteoklastdannelse og funksjon, som er mediert av NF-kB-signalering i RANKL-stimulerte makrofager. RANKL stimulerte produksjonen av disse cytokinene, og denne produksjonen ble markant redusert med 10 mM akteosid-forbehandling i BMM (fig. 6A). Tilsvarende svekket acteosid den RANKL-induserte produksjonen av cytokiner, bortsett fra IL-6, i RAW264.7-makrofager (fig. S3). For å forstå de molekylære mekanismene for akteosidvirkning i osteoklastogenese, undersøkte vi videre effekten av akteosid på TNF-a, c-Fos og NFATc1-ekspresjon. RANKL oppregulerte mRNA-ekspresjonen av disse faktorene i BMM-er og RAW264.7-celler (fig. 6B og C). Forbehandling med 10 mM akteosid hemmet signifikant det RANKL-induserte uttrykket av disse faktorene i begge

BMM-er og RAW264.7-celler. Acteosid forbehandling reduserte også sterkt proteinnivåene av c-Fos og NFATc1 i RANKL-stimulerte BMMer (fig. 6D). Disse resultatene tyder på at acteosid nedregulerer RANKL-induserende mediatorer av osteoklastdannelse på gen- og proteinnivå.

CISTANCHE EKSTRAKT: ACTEOSIDE

Acteosid reduserer intracellulær ROS-generering i BMM-er på en doseavhengig måte

Siden det er kjent at intracellulær ROS-produksjon er korrelert med RANKL-stimulert osteoklastogenese, undersøkte vi om acteosid hemmer ROS-produksjon under RANKL-mediert osteoklastdifferensiering ved bruk av et cellegjennomtrengelig, oksidasjonsfølsomt fargestoff, DCFH-DA. Flowcytometrianalyse viste at det gjennomsnittlige fluorescenssignalet spesifikt for DCF i BMM-er tilsynelatende ble høyreforskjøvet etter stimulering med RANKL, sammenlignet med de ubehandlede kontrollcellene (fig. 7A). Dette skiftet var likt tilfellet at RAW264.7-makrofager ble observert etter RANKL-stimulering (data ikke vist). Behandling av BMM med akteosid reduserte signalintensiteten til DCF på en doseavhengig måte. Forbehandling med 10 mM acteosid reduserte nesten fullstendig nivåene av intracellulær ROS produsert under osteoklastdifferensiering til de ubehandlede kontrollnivåene (fig. 7B).

Oral akteosidadministrasjon hemmer endring av osteoporotiske biokjemiske markører og bentap hos ovariektomierte mus

For å utforske effekten av akteosid på bentap, utarbeidet vi en osteoporotisk dyremodell ved ovariektomi. Det var ingen signifikant forskjell i kroppsvekt mellom OVX- og Sham-mus i løpet av forsøksperioden (data ikke vist). OVX-gruppen hadde signifikant høyere serumnivåer av IL-1b og IL-6 enn Sham-gruppen (fig. 8). Ovariektomi-induserte økninger i disse inflammatoriske cytokinene ble dempet ved oral akteosidadministrasjon (AC-gruppe). Serumnivåene av beinomsetningsmarkører som ALP, kalsium, TRAP5b og OC var signifikant økt i OVX-gruppen. Av disse osteoporotiske markørene ble de økte nivåene av kalsium, TRAP5b og OC i OVX-mus tilsynelatende hemmet av akteosidbehandling, mens serumnivået av ALP ikke ble endret av behandlingen. Gjennomsnittlig maksimal bruddbelastning til midten av høyre lårbensskaft var signifikant lavere i OVX-gruppen enn i Sham-gruppen (fig. 9A). Acteosid-behandling hevet det maksimale bruddet tilbake til det for Sham-gruppen. Da det kortikale beinet i lårbenet ble dissekert og observert ved optisk mikroskopi, hadde de osteoporotiske trekkene vist i OVX-gruppen nesten fullstendig forsvunnet i AC-mus (fig. 9B). For å verifisere effekten av akteosid på OVX-indusert osteoporosemodell, ble BMD og benmorfologiske parametere i trabekulært av den lette proksimale femur analysert med mikro-CT. Som vist i fig. 9C ble en endring av den femorale trabekulære arkitekturen funnet i OVX-mus, mens denne endringen ble redusert ved behandling med akteosid. Resultatene fra mikro-CT-analysen viste at BMD, et mål på beinstyrke, ble dramatisk redusert i OVX-mus (fig. 9D). Sammenlignet med Sham-gruppen, viste OVX-mus også betydelige endringer i BV/TV, Tb. Sp og Tb. N, men ikke i Tb.Th. Oral akteosidbehandling av OVX-mus forhindret signifikant endringen i BMD samt BV/TV og Tb.N.

Acteosid påvirker ikke osteoblastogenese i benmargsceller

Akteosids rolle på osteoblastisk differensiering ble videre undersøkt ved bruk av benmargsceller. Som vist i fig. 10A, økte DAG-behandling antallet rødfargede alizarin-celler, og dette ble ikke endret ved 10 mM akteosid-forbehandling. Mengden av tilstedeværende fargestoff indikerte at det kombinerte akteosid ogDAG-behandling endret ikke mineralisering (Fig. 10B). Tilsvarende ble DAG-induserte økninger i det intracellulære kalsiuminnholdet (fig. 10C) og mRNA-nivåer (fig. 10D) av benspesifikke markører, slik som Runx2, osterix, BSP og OC, ikke påvirket av forbehandling med acteosid.

effekt av cistanche akteosid

Diskusjon

Benremodellering er tett regulert av balansen mellom bendannelse av osteoblaster og benresorpsjon av osteoklaster. Langvarig og overdreven benresorpsjon forårsaker ubalanse i skjelettomsetningen, noe som resulterer i benresorptive sykdommer. For å utforske effekten av akteosid på osteoklastogenese, brukte vi to makrofager, primære dyrkede BMM-er og RAW264.7-celler.

Disse cellene ble stimulert med RANKL for å differensiere til osteoklaster i nærvær og fravær av acteosid. Vi viste for første gang at acteosid hemmer osteoklastdifferensiering og -dannelse. Acteosid i seg selv ved de undersøkte konsentrasjonene forårsaket ikke en reduksjon av levedyktigheten til de primære dyrkede makrofagene under både vekst- og differensieringsbetingelser.

Akteosidbehandling reduserte også resorpsjonsaktiviteten til modne osteoklaster. Disse resultatene tyder på at acteosid undertrykker osteoklastisk dannelse fra makrofager og osteoklastresorpsjonsaktivitet. Resultatene fra kultursystemet vårt, som ikke inkluderte osteoblaster eller stromaceller, tyder også på at acteosid forhindrer osteoklastdannelse ved å virke direkte på osteoklastforløpere.

RANKL aktiverer MAPK-er inkludert p38, ERK og JNK. Disse tre kinasene er involvert i tidlig osteoklastisk differensiering og dermed deres hemming farmakologisk eller med en dominant-negativ JNK-transfeksjon undertrykker RANKL-indusert osteoklastogenese [29]. Resultatene våre avslørte at akteosid-forbehandling hemmet alle disse kinasene, noe som indikerer en ikke-spesifikk nedregulering av MAPK-er. Dette resultatet skilte seg delvis fra den forrige rapporten om at EGCG, den viktigste antiinflammatoriske forbindelsen i grønn tee, spesifikt svekket JNK-aktivering uten å påvirke ERK- eller p38-aktivering i RANKL-stimulerte BMMer [7]. Paeonol, en anti-inflammatorisk forbindelse avledet fra en kinesisk urt, har også blitt rapportert å hemme ERK og p38, men ikke JNK, fosforylering i RANKL-stimulerte RAW264.7-celler [30]. Derimot svekket silibinin, en ny hemmer i bein, RANKL-indusert aktivering av p38, ERK og JNK [31]. Disse funnene tyder på at effekten av anti-resorptive forbindelser på MAPK-aktivering av RANKL avhenger av forbindelsen, selv om alle tre MAPK-ene er involvert i tidlig osteoklastogenese.

Tatt i betraktning observasjonen at akteosid svekket p-JNK

nivåer i RANKL-stimulerte BMM-er, selv ved 1 mM, så blokkeringen av JNK i stedet for av p38 MAPK eller ERK ut til å være mer spesifikk hendelse i akteosid-mediert anti-osteoklastogenese i cellene. Selv om akteosid ved samme konsentrasjon ikke reduserte antall osteoklaster i BMM, var det en signifikant reduksjon i gropdannelse ved akteosidbehandling. Vi fant også at forbehandling med SP600125, en farmakologisk hemmer spesifikk for JNK, dramatisk forhindret dannelsen av osteoklaster (data ikke vist). Samlet antyder disse funnene at JNK-mediert signalering er nært knyttet til akteosid-mediert undertrykkelse av osteoklastogenese stimulert av RANKL.

NF-kB-signalering regulerer cellulære hendelser, inkludert apoptose, cellesyklusprogresjon, celleadhesjon, cytokinproduksjon og overlevelse i makrofager [32]. NF-kB-signalering er også nødvendig for osteoklastutvikling, noe som har blitt demonstrert ved utseendet av osteopetrose hos NF-kB-knockout-mus [33,34]. Derfor foreslås hemming av NF-kB å være et effektivt mål for antiresorptive midler for å nedregulere osteoklastaktivitet og behandle osteoporose. Post-translasjonell modifikasjon av NF-kB-underfamilieproteiner er avgjørende for å modulere NF-kB-aktivitet. Spesielt er fosforylering av p65-underenheten og IkB-kinase kritisk for at NF-kB skal indusere osteoklastogenese [7]. Våre nåværende funn viste at RANKL-stimulering økte DNA-bindingsaktiviteten til NF-kB og fosforylering av p65-underenheten og IkBa i både BMM-er og RAW264.7-celler. Forbehandling med akteosid hemmet disse RANKL-induserte økningene, noe som resulterte i nedregulert NF-kB-aktivitet. Følgelig antyder disse resultatene at, i tillegg til MAPK-er, er NF-kB-signalering hovedmålet for acteosid for å hemme osteoklastdifferensiering og dannelse fra RANKL-stimulerte makrofager.

I tillegg til NF-kB-signalering, spiller c-Fos/c-Jun/NFATc1-banen nøkkelroller i osteoklastutvikling, og derfor kan mangelen på noen av disse proteinene stoppe osteoklastogenese [35,36]. I denne studien fant vi at acteosid forhindret RANKL-indusert c-Fos- og NFATc1-ekspresjon på mRNA- og proteinnivåer. JNK er en oppstrøms kinase av c-Jun, som er nødvendig for NFATc1-ekspresjon og osteoklastogenese som respons på RANKL [29].

Blokkering av theJNK/c-Jun-banen med en søppelinhibitor reduserte RANKL-indusert osteoklastdannelse og c-Fos- og NFATc1-ekspresjon [7]. Våre resultater og tidligere funn tyder på at hemming av JNK-mediert signalering av acteosid er nært assosiert med å forhindre RANKL-mediert c-Fos og NFATc1ekspresjon, som undertrykker osteoklastdifferensiering i makrofager. Forskjeller i effekten av akteosid på BMM-er og RAW264.7-celler skyldes i det minste delvis forskjeller i følsomheten for JNK-hemming.

TNF-a kan indusere osteoklastogenese uavhengig av RANKL-RANK-signalering [37]. IL-1 er en potent mediator av patologisk beinødeleggelse indusert av østrogenmangel eller betennelse [7]. Å forstyrre type I IL-1-reseptoren eller IL-1-signalering kan reversere bentap indusert av ovariektomi [38] eller revmatoid artritt [39]. Denne studien viste akteosids evne til å redusere produksjonen av inflammatoriske cytokiner som TNF-a, IL- 1b og IL-6 i makrofager. Akteosid antas å hemme inflammatorisk cytokinproduksjon ved å undertrykke p38-kinase og ERK-signalering, fordi aktivering av ERK1/2, p38 MAPK eller begge er nødvendig for lipopolysakkarid-indusert produksjon av disse cytokinene i makrofager [40,41]. Luteolin, en inflammatorisk forbindelse, hadde også blitt rapportert å undertrykke produksjonen av inflammatoriske mediatorer ved å hemme p38 MAPK-aktivering [42]. I denne studien fant vi også at akteosid svekket bentap hos ovariektomiserte mus, noe som fremgår av den gjenopprettede maksimale bruddkraften ved midtskaftet av høyre lårben og forsvinningen av osteoporotisk kortikalt bein. Oral akteosidadministrasjon nedregulerte de ovariektomiserte induserte økningene i serum IL-1b og IL-6 nivåer, men ikke ALP. De økte serumnivåene av kalsium, TRAP og OC i OVX ble også hemmet ved oral behandling med akteosid, noe som tyder på at akteosid demper endring av biomarkører spesifikke for bendannelse så vel som resorpsjon. Siden osteoporose er preget av redusert massetetthet og forverret trabekulær benmikroarkitektur, ble OVX-indusert trabekulært bentap og morfometriske parameterendring betydelig hemmet ved oral akteosidadministrasjon. Disse funnene tyder på at akteosid kan brukes som et anti-resorptivt middel for å behandle osteoporose ved å reversere ubalansert osteoklastaktivering. Imidlertid er osteoblaster den primære faktoren som er ansvarlig for ny beindannelse. Derfor er det nødvendig med et middel som er i stand til å øke osteoblastproliferasjon eller differensiering for å forbedre bendannelse [30]. Derimot fant vi at akteosid ikke påvirket osteoblastdifferensiering eller mineralisering i DAG-behandlede benmargsceller. Samlet tyder våre resultater på at akteosid har en anti-resorpsjonseffekt, men ikke direkte påvirker beindannelsen. Mer detaljerte eksperimenter som analyserer beinspesifikke parametere in vivo og in vitro er nødvendig for å avklare hvorvidt acteosid fordeler osteoblastogenese.

Denne studien fremhever den hemmende effekten av akteosid på osteoklastdifferensiering og benresorpsjon ved å undertrykke MAPK-er og flere transkripsjonelle faktorer som NF-kB, c-Fos og NFATc1. Dataene antyder to mulige mekanismer som acteosid har disse fordelene med.

CISTANCHE ECHINACOSIDE OG ACTEOSIDE KAN behandle osteoporose

Referanser

1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimmunologi: interaksjoner mellom immun- og skjelettsystemet. Molecules and Cells 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Ben og benmarg: samme organ. Archives of Biochemistry Biophysics 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporose: nå og fremtiden. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Benmetastase i prostatakreft: nye terapeutiske strategier. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.

5. Goltzman D (2002) Funn, narkotika og skjelettlidelser. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.

6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapeutiske tilnærminger til beinsykdommer. Science 289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H, et al. (2010) Epigallocatechin-3- gallat hemmer osteoklastogenese ved å nedregulere c-Fos-uttrykk og undertrykke kjernefaktor-kappaB-signalet. Molecular Pharmacology 77: 17– 25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, et al. (2012) MS-275, en benzamidhistondeacetylasehemmer, forhindrer osteoklastogenese ved å nedregulere c-Fos-uttrykk og undertrykker bentap hos mus. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Den anti-osteoporotiske effekten av Yijung-tang i en ovariektomisert rottemodell mediert av hemming av osteoklastdifferensiering. Journal of Ethnopharmacology 146: 83–89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Fiskeolje undertrykker benresorpsjon ved å hemme osteoklastogenese gjennom redusert ekspresjon av M-CSF, PU.1, MITF og RANK hos ovariektomiserte rotter. Molecular Medicine Reports 7: 1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklasten: en multinukleert, hematopoetisk opprinnelse, benresorberende osteoimmuncelle. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.

12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Reguleringsmekanisme for osteoklastogenese av RANKL- og Wnt-signaler. Frontiers in Bioscience 16: 21–30.