Antioksidative effekter av fenyletanoider fra Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Quanbo Xiong/ Shigetoshi Kadota," Tadato Tani,6 og Tsuneo Namba"

Aceton-H2O (9:1) ekstraktet fra stammen til Cistanche deserticola viste en sterk frie radikalfjernende aktivitet. Ni hovedfenyletanoidforbindelser ble isolert fra dette ekstraktet. De ble identifisert ved NMR som acteosid, isoacteosid, l^acetylacteosid, tubulosid B, echinacosid, tubulosid A, syringalid A 3z-a-rhamnopyranosid, cistanosid A og cistanosid F. Alle disse forbindelsene viste sterkere frie radikaler-fjernende aktiviteter enn en -tokoferol på 1,1 -diphenyI-2-picrylhydrazy 1 (DPPH) radikal og xantin/xantinoksidase (XOD) generert superoksidanionradikal (Oj). Blant de ni forbindelsene, viste isoacteosid og tubulosid B, hvis caffeoyl-del er i d'-posisjon av glukosen, en hemmende effekt på XOD. Vi studerte videre effekten av disse fenyletanoidene på lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer indusert av enzymatiske og ikke-enzymatiske metoder. Som forventet viste hver av dem betydelig hemming på både askorbinsyre/Fe2 pluss og ADP/NADPH/Fe3 pluss indusert lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer, som var mer potente enn a-tokoferol eller koffeinsyre. Den antioksidative effekten ble funnet å bli forsterket av en økning i antall fenoliske hydroksylgrupper i molekylet.

Nøkkelord: Cistanche deserticola; fenyletanoider;antioksidant; DPPH (1,1 -difenyl-2-picrylhydrazyl) radikal; superoksidanionradikal; lipidperoksidasjon

stamme av Cistanche deserticola

Stammen til Cistanche spp. (Cistanche Herba, familie Orobanchaceae) er et styrkende middel i tradisjonell kinesisk medisin som brukes mot nyremangel, preget av impotens, kald følelse i lender og knær, kvinnelig sterilitet og forstoppelse på grunn av tørr tarm i senilen.En rekke bestanddeler inkludert fenyletmoider (noen ganger kalt fenylpropanoider),2) ir-idoider3* og polysakkarider4) er blitt isolert fra disse plantene. Sato et al5} rapporterte at noen fenyletanoider fra dette råstoffet viste en beskyttende effekt mot reduksjon av både seksuell og læringsmessig atferd hos hengende stressbelastede mus. Fenyletanoider er hovedbestanddelene i disse plantene og anses å bidra til de ulike virkningene til dette stoffet.6)

Fenyletanoider er vidt distribuert i planteriket, og noen har vist seg å ha aktivitet av anti-anoksi,7) anti-neoplasma,8) enzymhemming,9* anti-inflammasjon,10) antinefritt,1 n anti-mikroorganisme, og immunmodulering.12) Studier på den antioksidative aktiviteten til noen fenyletanoider fra Pedicularis ble også rapportert,13 -15), men det ble ikke funnet noen rapport som omhandler den antioksidative aktiviteten til fenyletanoider fra Cistanche-arter.

Det er velkjent at frie radikaler er kritisk involvert i ulike patogeneser som kreft, kardiovaskulær lidelse, leddgikt, betennelse, så vel som i degenerative prosesser forbundet med aldring.16™18) I vår screening for antialdringsmidler fra naturressurser , fant vi at hver av CHC13 (C), EtOAc (E), aceton (A), aceton-H2O (9:1) (AH) og vann (H) ekstrakt av stammen til Cistanche deserticola viste en potent DPPH radikalfjernende aktivitet (fig. 1), blant hvilke den sterkeste ble utvist av aceton-H?.(9:1) ekstrakt (AH). Aceton-H2O (9:1)-ekstraktet inneholdt et høyt forhold av fenyletanoider, som sannsynligvis var aktive bestanddeler av frie radikal-fjernende effekter. Vi isolerte de viktigste fenyletanoidene fra dette ekstraktet og studerte de antioksidative effektene ved å rense dem på DPPH-radikal og xantin/XOD-generert superoksidanionradikal, og deres hemming av askorbinsyre/Fe2 pluss og ADP/NADPH/Fe3 pluss indusert lipidperoksidasjon i rottelever mikrosomer.

Cistanche deserticola

MATERIALER OG METODER

Reagenser Polyamid C-200 (75一150/zm) og silikagel (Wakogel C-200, 75—150^m) pulver for kolonnekromatografi, DPPH (1,1 -difenyl{{ 8}} pikrylhydrazyl), xanthin, XOD (xanthine oxidase), NBT (nitroblått tetrazolium), ADP, g-NADPH, koffeinsyre og a-tokoferol ble kjøpt fra Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan. Malonaldehyd bis(dimetylacetal) var fra Tokyo Kasei, Tokyo, Japan. BSA (bovint serumalbumin) og allopurinol var fra sigma, St. Louis, USA Andre kjemikalier var av analytisk kvalitet.

Instrumenters UV-absorbans ble målt på enShimadzu UV-2200-registreringsspektrofotometer, NMR-spektre ble båret på et JEOL GX-400 eller et JEOL JNM-LA 400WB FT NMR-system.

Plantematerialer Et kommersielt råstoff (produsert i Nei Monggol, kjøpt i Bozhou Crude Drug Market, Anhui-provinsen, Kina, 1995; kupongprøven, TMPW nr. 15479 deponert i Museum of Materia Medica, Analytical Research Center for Ethnomedicine, Research Institute for Wakan-Yaku, Toyama Medical and Pharmaceutical University) ble identifisert som stammer av Cistanche deserticola YC Ma ved å sammenligne dens morfologiske og anatomiske karakterer med en autentisk prøve levert av professor Dawen Shi, Department of Pharmacognosy, Shanghai Medical University, Kina.

Ekstraksjon og isolering Det pulveriserte rålegemidlet (5,87 kg) ble ekstrahert fortløpende med CHC13 (12, 9 1x2) og EtOAc (9 1 x 3) ved romtemperatur og refluksert med aceton (9 1 x 3), aceton-玦0 (9:1,91x3) og H2O (7.5 1x4) for å gi ekstraktene av CHC13 (C) (28,7 g), EtOAc (E) ( 13,4 g), aceton (A) (95 g), aceton-H2O (9:1) (AH) (175 g) og H2O (H) (2,51 kg). En del av lOOg av aceton-H2O (9:1)-ekstraktet ble utsatt for en polyamid C-200 (4{{50}}0 g) kolonne og eluert med H2O ({{41 }}) og deretter MeOH (5 1). MeOH-elueringsmidlet (20 g) ble fylt på en silikagel (600 g) kolonne og eluert med CHCl3-MeOH-H2O (8:3:0,3) (5 1) for å gi 10 fraksjoner. Hver fraksjon ble utsatt for Sephadex LH-20-kolonne og eluert med forskjellige forhold av MeOH-H2O (0×50 prosent); ni hovedfenyletanoider 1 (607 mg), 2 (286 mg), 3 (43 mg), 4 (187 mg), 5 (1,1 g), 6 (100 mg), 7 (208 mg), 8 (168 mg) 9 (75 mg) ble oppnådd.

Dyr Hann Std: Wistar-rotter (8 uker gamle, 230 x 250 g) ble brukt. Dyrene ble kjøpt fra Shizuoka Laboratory Animal Center og ble fôret med en laboratoriepelletmat (Clea Japan) og gitt vann ad libitum.

Fremstilling av mikrosomal suspensjon av rottelever Mikrosomal fraksjon av rottelever ble fremstilt ved metoden til Kiso et al.19), men uten forbehandling av fenobarbital. Etter at dyrene hadde fastet i 24 timer, ble leverene perfusert med en iskald 0,9 prosent NaCl-løsning in situ, deretter kuttet i tynne biter og homogenisert i kald 1,15 prosent KC1-løsning (1.{{9} } ml/g våt levervekt). Homogenatet ble fortynnet fire ganger med 1,15 prosent KC1-løsning og sentrifugert ved 8000 g i 20 minutter ved 4 grader. Supernatantfraksjonen ble deretter samlet og ultrasentrifugert ved 105 000 g i 60 minutter. Den oppnådde pelleten ble resuspendert i det samme volum av 1,15% KCl-løsning. Proteininnholdet ble bestemt ved metoden til Lowry et ved bruk av albumin som standard.

Prøveforberedelse De testede prøvene ble oppløst i vann eller etanol og fortynnet med vann til forskjellige konsentrasjoner. De endelige konsentrasjonene av etanol var under 1 prosent i alle analysesystemene bortsett fra DPPH-radikalfjerningsanalysen. Etanol ved en sluttkonsentrasjon under 1 prosent viste ingen effekt på disse analysesystemene.

DPPH Radical Scavenging Effect Den rensende effekten tilsvarte intensiteten av quenching av DPPH radikal, som beskrevet av Hatano et al. 30 minutter ved romtemperatur, deretter ble den optiske tettheten målt ved 520 nm. For blindprøve ble EtOH brukt i stedet for DPPH-løsning, og for kontroll ble H2O brukt i stedet for prøveløsning. IC50-verdiene ble beregnet fra regresjonslinjer hvor abscissen representerte konsentrasjonen av testet forbindelse og ordinaten den gjennomsnittlige prosentvise reduksjonen av DPPH-radikal fra fire separate tester.

Effekter på generering av superoksidanionradikaler Produksjonen av superoksidanioner i xanthin/XOD-systemet ble bestemt ved å bruke en halv størrelse av metoden til Imanari et al.22) En blanding sammensatt av 900/zl av 0,05m Na2CO3 (pH 10,2), 50/il hver av 3mM xanthin, 3mM EDTA, 1,5mg/ml BSA, 0,75 mM NBT og testet prøve ble tilsatt 50 av 0,1 mg/ml XOD for å starte reaksjon. Etter inkubering i 30 minutter ble reaksjonen stoppet med 50/il 6 mM CuCl2 og absorbansen ble målt ved 560 nm. Kontrollløsningen ble fremstilt på samme måte, men 50 /il H2O ble brukt i stedet for prøveløsningen. I blindløsning ble det brukt 50 µl H2O i stedet for XOD-løsning. IC50-verdier ble beregnet fra regresjonslinjer hvor abscissen representerte log-konsentrasjonen av testet forbindelse og ordinaten gjennomsnittlig prosent hemming av NBT-reduksjon på fire i avhengige tester.

Inhiberende effekter på aktiviteten til XOD Hemmende effekter på aktiviteten til XOD ble estimert ved metoden til Hatano et al.* med noen modifikasjoner. En blanding bestående av 600/11 av en buffer (0,1 m fosfatløsning, pH 7,5), 50 以 XOD-løsning (0,068 U/ml i buffer) og 50 卩 1 prøveløsning ble pre-inkubert i 10 minutter ved 25 grader. Deretter ble 300 pl xantinløsning (0,1 mM i buffer) tilsatt til blandingen, og den resulterende løsningen ble inkubert i 30 minutter ved 25 grader. Enzymreaksjonen ble avsluttet ved å tilsette 1 n HC1 (100/zl), og absorbansen til reaksjonsblandingen ble målt ved 295 nm. Konsentrasjonen av urinsyre som ble dannet i blandingen ble beregnet fra absorbansen, etter å ha trukket fra absorbansen til blindløsningen som ble fremstilt som beskrevet ovenfor, bortsett fra at XOD-løsningen ble erstattet med 50 µl av bufferen. De hemmende effektene på XOD ble uttrykt ved prosent hemming (prosent) av dannelsen av urinsyre vs. den i kontroll, hvor vann ble brukt i stedet for prøveløsning. Den velkjente XOD-hemmeren, allopurinol, ble brukt som en positiv kontroll.

Hemmende effekter på lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer Lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer ikke-enzymatisk indusert av askorbinsyre/Fe2 pluss og enzym indusert av ADP/NADPH/Fe3 pluss ble målt ved metoden til Kiso et al.l9) med noen modifikasjoner .

a) Askorbinsyre/Fe2 pluss indusert lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer: Reaksjonsblandingen var sammensatt av 390/11 av 100mM KC1/45 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 pl av mikrosomal fraksjon i 1,15 prosent KC1 (20 mg protein/ml) og 50 以 av en prøveløsning. Etter tilsetning av 10/11 av 10 mM askorbinsyre/0,5 mM FeSO4 og deretter inkubering ved 37 grader i 20 minutter, ble reaksjonsblandingen avkjølt i is for å stoppe reaksjonen. Lipidperoksidasjonen ble målt ved tiobarbitursyremetoden24) og uttrykt som MDA (malondialdehyd) produksjon. At

b) ADP/NADPH/Fe3 pluss indusert lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer: Reaksjonsblandingen inneholdt 290贝 100mM KC1/45him Tris-HCl (pH 8,0), 50/il mikrosomal suspensjon i 1,15 prosent KC1 (20 mg protein/ml) og 50 以 prøve i vann. Femti ferskt tilberedt 20 mM ADP, 50//I av 1 mM NADPH og 10 av 2 mM FeCl3 ble tilsatt og deretter inkubert ved 37 grader i 30 minutter. Lipidperoksidasjon ble målt og IC50 ble beregnet ved metoden ovenfor.

cistanche fordeler: beskytter leveren

RESULTATER

Strukturbestemmelse Ved direkte sammenligning av deres ^H-NMR- og 13C-NMR-data med litteraturen,2* ble de ni fenyletanoidene identifisert som 2,-acetylakteosid (1), cistanosid A (2), tubulosid A (3), echinacosid ( 4), akteosid (5), henholdsvis syringalid A 3'-a-rhamnopyranosid (6), tubulosid B (7), isoakteosid (8) og cistanosid F (9) (fig. 2). Imidlertid, for akteosid, en representativ forbindelse av fenyletanoider, tilordninger av 13C-NMR-signalene til C-3 og C-4 i aglykondelen, C-3, C-4 , C-5 og C-6 i koffeindelen i tidligere rapporter25) var forvirrende. Ved hjelp av 2D-NMR-metoden slik som HMBC og HMQC, tildelte vi entydig 13C-NMR-dataene til akteosid som aglykondel Cl: 131,49, C-2: 117,14, C-3: 146,07, C{ {41}}: 144,62, C-5: 116,34, C-6: 121,29, Ca: 72,33, C# 36,54; koffeoyldel Cl: 127,63, C-2: 115,26, C-3: 146,79, C-4: 149,78, C-5: 116,55, C-6: 123,24 , Ca: 168,33, Cg: 114,68, Cy: 148,04; glukosedel C-l': 104,16, C-2': 75,97, C-3': 81,66, C4: 70,39, C-5': 76,16, C-6' : 62,35; og rhamnosedel: Cl: 102,99, C-2: 72,22, C-3: 72,05, C-4: 73,79, C-5: 70,58, C-6 : 18,46.

Struktur-aktivitetsforholdene ble studert for disse ni fenyletanoidene ved deres DPPH-radikal og xantin/XOD-genererte superoksidanion-radikalfjernende aktiviteter, askorbinsyre/Fe2 pluss og ADP/NADPH/Fe3 pluss indusert lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer. Koffeinsyre og a-tokoferol som er velkjente frie radikaler og antioksidanter ble brukt som positive kontrollstoffer.

DPPH Radical Scavenging Activity All of the nine phenylethanoids showed stronger DPPH radical scav-enging activity than either a-tocopherol or caffeic acid, except that cistanoside A (2), syringalide A 3'-a-rhamno- pyranoside (6) and cistanoside F (9) showed weaker activity than caffeic acid (Fig. 3). The activity order was tubuloside B ⑺(IC50 = 2.99 ^m) > echinacoside ⑷ (IC50 = 3.29 fiM)M 2z-acetylacteoside ⑴(IC50 = 3.30 /im) M tubuloside A (3) (IC50 = 3.34/im) acteoside (5) (IC50 = 3.36 〃m)> isoacteoside (8) (IC50 = 3.49 ^m) >caffeic acid (IC50 = 4.79 /2M)> cistanoside A (2) (IC5O = 4.87 /im)>syringalid A S'-a-rhamnopyranosid (6) (IC5O=5.52 /zm) > cistanosid F (9) (IC50=6.29 /im) > a-tokoferol (IC{{10 }}.2//m). Tubulosid B ⑺,echinacosid (4), 2/-acetylacetosid (1), tubulosid A (3), acteosid (5) og isoacteosid (8) (IC5O=2.99一3.49 /im), som hver har fire fenoliske hydroksylgrupper i molekylet viste på samme måte sterkere aktivitet enn cistanoside A (2) hvis 3-OH av aglykondelen var metylert. Syringalid A 3z-a-rhamnopyranosid (6) som kun har én OH-gruppe i aglykondelen viste relativt svak aktivitet. Cistanoside F (9), som bare har to hydroksylgrupper lokalisert ved caffeoyl-delen, men ikke har fenyletanolaglykon, viste den svakeste aktiviteten.

Effects on Superoxide Anion Radical Generation All the tested compounds exhibited a stronger inhibitory activity than a-tocopherol but weaker than caffeic acid on the generation of superoxide anion radical (Fig. 4). The activity order was caffeic acid (IC5()= 1.82jUM)>2'- acetylacteoside (1) (IC50 = 2.25 /im) tubuloside B ⑺ (IC50 = 2.34jUM) >echinacoside (4) (IC50 = 2.74juM)^ isoacteoside (8) (IC50 = 2.88 /zm) acteoside (5) (IC50 = 2.89 f/M) >cistanoside F (9) (IC5o = 3.13 rm) tubuloside A (3) (IC50 = 3.17 jUM)syringalide A 3'-a-rhamnopyrano- side (6) (IC50 = 3.20^m)>cistanosid A (2) (IC5O=3.69 jUm) > a-tokoferol (IC50 > 10 〃m).

Inhiberende effekter på XOD-aktivitet Bare isoacteosid (8) og tubulosid B (7), hvis caffeoyl-del er i 6z-posisjon av glukosen, hadde hemmende effekter på aktiviteten til XOD og andre fenyletanoider, som har caffeoyl-delen ved ^- posisjonen til glukosen, viste ingen effekter ved de testede konsentrasjonene (25×200 m) (tabell 1). isolerte ni hovedfenyletanoidforbindelser fra dette ekstraktet og bestemte deres strukturer ved NMR. system som tubulosid B (7)M2'-acetylakteosid (1) iso-acteosid (8) echinacosid (4) tubulosid A (3) M acteo side (5) > syringalid A 3'-a-rhamnopyranosid (6) > cistanosid A (2) > cistanosid F (9); i ADP/NADPH/Fe3 pluss system som tubulosid B (7)2,-acetylakteosid (^^iso akteosid (8) akteosid (5) > tubulosid A (3) > echinaco side (4) > syringalid A 3z-a-rhamnopyranosid (6) > cistanosid A (2) > cistanosid F (9). Begge disse rekkefølgen var lik den i de ovennevnte frie radikal-fjernende testene, spesielt i DPPH-radikalfangende testen. Likevel er antallet fenoliske hydroksylgrupper i molekylet spilte den viktigste rollen i hemming av lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer.

effekter av cistanche

DISKUSJON

Vi testet de frie radikal-fjernende aktivitetene til de forskjellige løsemiddelekstraktene av stammen til Cistanche deserticola på DPPH-radikal og fant at aceton-H2O (9:1)-ekstraktet viste den sterkeste aktiviteten. For å finne de aktive komponentene i frie radikal-fjernende aktivitet, isolerte vi ni hovedfenyletanoidforbindelser fra dette ekstraktet og bestemte deres strukturer ved NMR.

De antioksidative effektene av disse fenyletanoidene ble evaluert ved deres frie radikalfjernende aktivitet og antilipidperoksidasjonsaktivitet. Det allment kjente a-tokoferolet ble brukt som et positivt kontrollstoff. Somlipofilisitet av a-tokoferol kan påvirke dets aktiviteter i de nåværende analysesystemene bortsett fra i DPPH-radikalfjerningsanalysen, vi tok koffeinsyre som et annet positivt kontrollstoff.

Først utførte vi tester på frie radikaler som renser ut. Alle de 9 testede fenyletanoidene viste utvilsomt sterkere DPPH-radikal- og superoksydanion-radikalfjernende aktiviteter enn a-tokoferol, men noen var sterkere og andre var svakere enn koffeinsyre. Den radikalfjernende aktiviteten økte med en økning i antall fenoliske hydroksylgrupper. Den ufullstendige parallelliteten til DPPH-radikal- og superoksidanionfangende aktiviteter ble antatt å skyldes de forskjellige karakterene mellom radikalartene og noen andre faktorer involvert i disse to reaksjonssystemene, 21,26) for DPPH-radikalet er et kjemisk indusert radikal som reagerer med radikalfjernere på en enkel kjemisk måte, mens superoksidanionradikalet genereres av xanthin/XOD, en enzymreaksjon.

Hvis fenyletanoidene hemmer det xantin/XOD-genererte superoksydanionradikalet, kan hemmingen betraktes som et resultat av deres superoksydanionradikalfjernende aktivitet eller (og) deres hemming av enzymet XOD,23, så vi utførte en test av deres hemmende effekter av xanthinoksidase. Det er interessant at selektivt viste bare isoacteosid (8) og tubulosid B (7), hvis caffeoyl-del er i 6/-posisjon av glukosen, inhibering. De viste en effekt ved konsentrasjonen 25—200 jtiM på 3,4xlO^3U/ml (10jug/ml) XOD, selv om aktiviteten var svakere enn allopurinol; andre forbindelser, hvis caffeoyl-del er i posisjonen til glukosen, viste ingen hemmende effekt. Dette resultatet ga den første rapporten om den hemmende effekten av fenyletanoider på XOD-enzymet. Chan et al21) rapporterte at koffeinsyre og noen av dens analoger hadde hemmende effekter på XOD-aktivitet, men vi fant ingen slik effekt av koffeinsyre under de nåværende reaksjonsforholdene. I denne testen var XOD-konsentrasjonen lik den i testen for effekt på generering av superoksydanionradikaler (4,3 /zg/ml), men konsentrasjonen av forbindelser var mye høyere enn i sistnevnte. Derfor skyldes inhibering av Oj-generasjonen av disse fenyletanoidene deres radikalfjernende aktivitet, men ikke deres hemmende aktivitet av XOD-enzymet.

At frie radikalkjedereaksjoner til slutt fører til lipidperoksidasjon er velkjent.28,29) Vi studerte derfor disse fenyletanoidforbindelsene for deres effekter på lipidperoksidasjonen i rottelevermikrosomer indusert av det enzymatiske systemet ADP/NADPH/Fe3 plus og det indusert av det ikke-enzymatiske systemet askorbinsyre/Fe2 pluss . Alle disse forbindelsene viste sterkere antilipidperoksidasjonseffekter enn koffeinsyre og a-tokoferol i begge systemene. Det er generelt akseptert at begge systemene er katalysert av jernioner, enten Fe2 pluss eller Fe3 pluss, involvert med lipidperoksylradikaler,30,31) og at hydroksylradikal OH spiller den viktigste rollen i lipidperoksidasjon,32 _34) selv om initieringen av OH har blitt stilt spørsmål ved i noen rapporter.35祁6) På den annen side er superoksidanionradikal OJ, som er det primære produktet av e_ angrep på O2 i radikalkjeden, en ganske dårlig reaktiv radikal og resulterer ikke i lipidperoksidasjon i seg selv. Selv om disse fenyletanoidene viste svakere renseaktivitet på superoksidanionradikal enn koffeinsyre, viste de mye sterkere antilipidperoksidasjonsvirkning enn sistnevnte. Derfor tror vi at de, som noen andre aromatiske, kjedebrytende polyfenoler, kan hemme ovennevnte lipidperoksidasjon i rottelevermikrosomer ved å chelatere Fe2 pluss eller Fe3 pluss ioner, og også ved å rense superoksidradikal Oj for å bryte ned radikal kjedereaksjon .37,38) Dessuten kan de også fange ut mer giftige radikaler som hydroksylradikal og lipidperoksylradikaler for å direkte avbryte lipidperoksidasjon med høyere styrke enn koffeinsyre.38,39)

Li et al. studerte noen fenyletanoidglykosider, inkludert acteosid (verbascoside) (5), isoacteosid (isoverbascoside) (1) og echinacoside (4) fra Pedicularis for deres hemming av autooksidasjonen av linolsyre i miceller, et ikke-biologisk system,13) for deres beskyttelse mot oksidativ hemolyse in vitro,14''1 og også for deres rensende effekter på NBT/PMS/NADH generert superoksid og inhibering av lipidperoksidasjon indusert av askorbinsyre/Fe2 pluss i muselevermikrosomer.15) En lignende aktivitet -strukturforhold ble observert i rapportene til Li et al. og våre resultater. Det vil si at aktivitetene til fenyletanoider for å hemme lipidperoksidasjon avhenger hovedsakelig av antallet og steriske posisjonen til fenoliske hydroksylgrupper.15) På grunnlag av deres stereokjemi er de fenoliske hydroksylgruppene i caffeoyldelen på akteosid (5), tubulosid A ( 3), og echinacoside (4), som har caffeoyl i 4z-posisjon av glukosen, ville lettere danne en hydrogenbinding med hydroksylgruppene til rhamnosyl enn de på isoacteosid (8) og tubulosid B (7), som ha koffeoylen i 6'-posisjonen til glukosen. Dermed reserverte sistnevnte flere frie fenoliske hydroksylgrupper enn førstnevnte og viste derfor sterkere antilipidperoksidasjonsaktivitet. Vi la også merke til at 2z-acetylering av disse fenyletanoidene, selv om de er litt, forbedret deres antioksidative effekter. For eksempel viste akteosid (5) og isoakteosid (8), når 2'- acetylert til henholdsvis 2/-acetylakteosid (1) og tubulosid B (7), sterkere aktiviteter i alle fire analysesystemene. På grunn av stereokjemiens overlegenhet og 2'-acetylering, viste tubulosid B (7) den sterkeste antioksidative aktiviteten blant de testede prøvene. Kanskje på grunn av substitusjonen av en tredje sukkerdel i 6'-posisjon, passet ikke denne korrelasjonen godt i tilfellet med tubulosid A (3) eller echinakosid (4); i ADP/NADPH/Fe3 pluss-systemet viste imidlertid tubulosid A ⑶ fortsatt sterkere antilipidperoksidasjonsaktivitet enn echinakosid (4).

I tillegg viste rekkefølgen av DPPH-radikalfjernende aktivitet bedre parallellitet med antilipidperoksydasjon enn rekkefølgen av superoksydanionradikalfjernende aktivitet. Dette beviste igjen at DPPH-radikalfjerningsanalyse er en praktisk og pålitelig metode for antioksidantanalyse,26) selv om DPPH-radikal er en kjemisk indusert radikal mens superoksydanionradikal kan være en biologisk endogen radikal.

Som konklusjon viste alle de ni fenyletanoidene betydelige frie radikaler-fjernende aktiviteter og anti-lipidperoksidasjonseffekter i denne studien. Den antioksidative effekten ble forsterket av en økning i antall fenoliske hydroksylgrupper i molekylet. Som man kan forestille seg, kan de antioksidative effektene av disse fenyletanoidene som er påvist her spille en viktig rolle i virkningene til stoffet Cistanchis Herba og kan delvis forklare mekanismene for aktivitetene til noen fenyletanoider mot neoplasma,8* betennelse10) og nefritis, 1 n hvor frie radikaler er alvorlig involvert.

Cistsanche Echinacoside: Antioksidasjon

REFERANSER

1) Namba T., "The Encyclopedia of Wakan-Yaku (tradisjonelle kinesisk-japanske medisiner) med fargebilder, 5, bind II, Hoikusha, Tokyo, 1994, s. 16—17.

2) a) Kobayashi H., Karasawa H., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pham. Bull, 32, 3009-3014 (1984); b) Idem, ibid., 32, 3880-3885 (1984); c) Idem, ibid., 33, 1452-1457 (1985); d) Karasawa H., Kobayashi H., Takizawa N., Miyase T., Fukushima S., Yakugaku Zasshi, 106, 562-566 (1986); e) Idem, ibid., 106, 721-724 (1986); /) Kobayashi H., Oguchi H., Takizawa N., Miyase T., Ueno A., Usmanghani K., Ahmad M., Chem. Pharm. Bull., 35, 3309-3314 (1987); g) Yoshizawa F., Deyama T., Takizawa N., Usmanghani K., Ahmad M., ibid., 38, 1927—1930 (1990).

3) a) Kobayashi H, Komatsu J., Yakugaku Zasshi, 103, 508-511 (1983); b): Kobayashi H., Karasawa H., Miyase T., Fukushima S., Chem. Pharm. Bull., 32, 1729-1734 (1984); c) Idem, ibid., 33, 3645—3650 (1985).

4) Naran R., Ebringerova A., Hromadkova Z., Patoprsty V., Phytochemistry, 40, 709-715 (1995).

5) Sato T., Kozima S., Kobayashi K., Kobayashi H., Yakugaku Zasshi. 105, 1131-1144 (1985).

6) Jin XL, Zhang QR, China J. Chinese Materia Medica, 19, 695—697 (1994).

7) Yamahara J., Kitani T., Kobayashi H., Kawahara Y., Yakugaku Zasshi, 110, 932-935 (1990).

8) a) Pettit G. R., Numata A., Takemura T., Ode RH, Narula A, S., Schmidt JM, Cragg GM, Pase CP, J. Nat. Prod., 53, 456-58 (1990); b) Saracoglu I., Inoue M., Calis I., Ogihara Y., Biol. Pharm, Bull., 18, 1396-1400 (1995).

9) Andary C., '4Caffeic Acid Glycoside Esters and Pharmacology/red. av Scalbert A., Polyphenolic Phenomena, INRA Editions, Paris, 1993, s. 237—245.

10) Murai M., Tamayama Y., Nishibe S., Planta Med.. 61, 479-80 (1995).

11) Hayashi K., Nagamatsu T., Ito M., Hattori T., Suzuki Y., Jpn. J. Pharmacol., 66, 47:52 (1994).

12) a) Molnar J., Gunics G., Mucsi I., Koltai M., Petri L, Shoyama Y., Matsumoto M., Nishioka L, Acta Microbiol. Hung.. 36, 425-32 (1989); b) Sasaki H., Nishimura T., Morota T., Chin M., Mitsuhashi H" Komatsu Y., Maruyama H., Tu GR, He W., Xiong YL, Planta Med., 55, 4582462 (1989).

13) Li J., Wang PF, Zheng RL, Liu ZM, Jia 乙 J., Planta Med., 59, 315-317 (1993).

14) Zheng RL, Wang PF, Li J., Liu Z.M., Jia ZJ, Chem. Phys. Lipider. 65, 151-154 (1993).

15) Li J., Zheng RL, Liu 乙 M., Jia 乙 J., Acta Pharmacol. Sinica, 13, 427T30 (1992).

16) Barber DA, Harris SR, American Pharmacy. 34, 26-35 (1993).

17) Elstner EF, Klin Wochenschr, 69, 949—956 (1991).

18) Martin GR, Danner DB, Holbrook NJ, Ann. Rev. Med., 44, 419-29 (1993).

19) Kiso Y., Tohkino H., Hattori M., Sakamoto T., Namba T., Planta Med.. 50, 298—302 (1984).

20) Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ, J. Biol. Chem.. 193, 265-275 (1951).

21) Hatano T., Edamatsu R., Hiramatsu M., Mori A., Fujita Y., Yasuhara T" Okuda T., Chem. Pharm. Bull., 37, 2016-2021 (1989).

22) Imanari T., Hirota M., Miyazaki M., Igaku No Ayumi, 101, 496—497 (1977).

23) Hatano T., Yasuhara T., Yoshihara R., Agata L, Noro T., Okuda T., Chem. Pharm. Bull., 38, 1224-1229 (1990).

24) Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K., Anal. Biochem., 95, 351-358 (1979).

25) a) Lahloub M, F., Zaghloul AM, El-Khayat SA, Afifi MS, Sticher O., Planta Med.. 57, 481-85 (1991); b) Nishimura H., Sasaki H., Inagaki N., Chin M. (Zhen 乙 X.), Mitsuhashi H., Phytochemistry. 30, 965-969 (1991); c) Budzianowski J., Skrzypczak L., ibid,, 38, 997—1001 (1995),

26) Marsden SB, Nature (London), 181, 1199—1200 (1958).

27) Chan WS, Wen PC, Chiang HC, Anticancer Res., 15, 703 一 708, (1995).

28) Janero DR, Burghardt B., Biochem, Pharmacol.. 37, 3335-3342 (1988).

29) Buettner GR, Arch. Biochem. Biophys., 300, 535-543 (1993).

30) Herbert V., Shaw S., Jayatilleke E., Stopler-Kasdan T., Stem Cells, 12, 289-303 (1994).

31) Aust SD, Miller DM, Samokyszyn VM, Methods Enzymol., 186, 457—463 (1990).

32) Kubota S., Ikegami Y., Kurokawa T., Sasaki R., Sugioka K., Nakano M., Biochem. Biofys. Res, Commun., 108, 1025-1031 (1982).

33) Yagi K., Ishida N., Komura S., Ohishi N., Kusai M., Kohno M., Biochem. Biofys. Res. Commun., 183, 945一951 (1992).

34) Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, Milliman CL, Korsmeyer SJ, Cell. 75, 241-251 (1993).

35) Bucher JR, Tien M., Aust AD, Biochem. Biofys. Res, Commun., Ill, 777—784 (1983).

36) Yoshida T., Otake H., Aramaki Y., Hara T., Tsuchiya S., Hamada A., Utsumi H., Biol. Pharm. Bull.. 19, 779-782 (1996).

37) Afanas5 EVIB, Dorozhko A.L, Brodskii AV, Kostyuk VA, Potapovitch L A., Biochem. Pharmacol., 38, 1763-1769 (1989).

38) Robak J., Gryglewski RJ, Biochem. Pharmacol.. 37, 837-841 (1988).

39) Chimi H., Morel I., Lescoat G., Pasdeloup N・, Cillard P., Cillard J., Toxicology in Vitro, 9, 695一702 (1995)