Del 1: Verbascoside beskytter bukspyttkjertelceller mot ER-stress
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, pluss , Paola Marciani 1, pluss , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 og Carla Perego 1,*
Abstrakt:
Betydelige epidemiologiske bevis tyder på at en diett rik på polyfenoler beskytter mot utvikling av type 2 diabetes. Fenyletanoidet glykosidverbascoside/acteosid, en utbredt polyfenolisk planteforbindelse, har flere biologiske egenskaper, inkludert sterke antioksidanter, anti-inflammatoriske og nevrobeskyttende aktiviteter. Målet med denne forskningen var å teste mulige effekter avverbascosidepå pankreasceller, et mål som aldri er testet før. Muse- og menneskeceller ble inkubert medverbascoside(0.8–16 uM) i opptil fem dager, og en kombinasjon av biokjemiske teknikker og avbildningsteknikker ble brukt for å vurdere -celleoverlevelse og funksjon under normal eller endoplasmatisk retikulum (ER)-stressinduserende forhold. Vi fant en doseavhengig beskyttende effekt avverbascosidemot oksidativt stress i klonale og menneskelige celler. Mekanistiske studier avslørte at polyfenolen beskytter -celler mot ER-stressmedierte dysfunksjoner, modulerer aktiveringen av proteinkinase RNA-lignende endoplasmatisk retikulumkinase (PERK) gren av den utfoldede proteinresponsen og fremmer mitokondriell dynamikk. Som et resultat ble økt levedyktighet, mitokondriell funksjon og insulininnhold påvist i disse cellene. Disse studiene gir bevis for detverbascosideøker evnen til -celler til å takle ER-stress, en viktig bidragsyter til -celledysfunksjon og svikt ved diabetiske tilstander og støtter det terapeutiske potensialet til verbascoside ved diabetes.
Nøkkelord:
verbascoside; polyfenoler; insulinproduserende celler; diabetes; UPR; oksidativt stress; ER-stress; EKSTRA FORDEL; anti-inflammatorisk; mitokondrier
1. Introduksjon
Diabetes er en kronisk lidelse som rammer hundrevis av millioner mennesker [1]. Ulik etiologi kjennetegner type 1 (T1D) og type 2 diabetes (T2D), begge med mangel på insulin [2]. Insulin regulerer plasmaglukosekonsentrasjonen stimulerer glukoseopptaket i muskel- og fettceller og modulerer leverens glukosemetabolisme. Tilgjengelighet av næringsstoffer, hormoner og nevrale input regulerer insulinsekresjonen i bukspyttkjertelen og opprettholder blodsukkerkonsentrasjoner innenfor et fysiologisk område [3–5]. Derfor fører -celledysfunksjon til diabetes preget av fastende hyperglykemi.
T2D er en progressiv tilstand der insulinresistens og -cellefeil er koblet sammen og nyere bevis økte interessen for den kritiske primære rollen til -celler for den hyperglykemiske statusen [6,7]. Hos ikke-diabetiske overvektige individer -celler kompenserer insulinresistens med økt utskillelse av hormonet. Men hos noen forsøkspersoner, ettersom tilstandene forverres, synker insulinemi og glukosenivået stiger til hyperglykemi [8,9].
Glukose er den viktigste modulatoren av -cellefunksjoner. Glukosestimulering påvirker regulering av gener og ekspresjon av proteiner involvert i mange cellefunksjoner som glykolyse, insulinsyntese og sekresjon [10]. Glukose-indusert insulinsekresjon er avhengig av oksidativ metabolisme for å produsere adenosintrifosfat (ATP) og et lavt nivå av reaktive oksygenarter (ROS) produseres fysiologisk. Imidlertid er -celler ikke veldig godt utstyrt med rensende enzymer og denne svakheten gjør dem svært utsatt for oksidativt stress [11,12]. Etter hvert som oksidativt stress stiger - avtar insulinproduksjonen, og -celler produserer cytokiner som antenner celleskade gjennom betennelse og apoptose [13]. Interessant nok, selv om den reduserte cellemassen tidligere har blitt tilskrevet celledød, tyder nyere studier på en viktig rolle for celledeifferensiering [14,15]. Det har blitt klart at flere etapper kjører til T2D. Metabolske og oksidative fornærmelser forårsaker endoplasmatisk retikulum (ER) stress som fører til reduksjon av insulinsyntese og -sekresjon, betennelsesprosesser følger frigjøringen av cytokiner og celletap kan oppstå gjennom apoptose og dedifferensiering. Denne kunnskapen er grunnleggende for å utvikle hensiktsmessige behandlingsstrategier, siden oksidativt stress og betennelse kan motvirkes, og plastisiteten til bukspyttkjertelceller tillater muligheten for å revertere stamceller til -celler som bevist hos mus [16].
Nylig har sårbarheten til -celler for oksidativt stress med suksess ført til bruk av diettantioksidanter for å forhindre diabetes [17]. Blant de mest interessante antioksidantmatene er olivenolje kjent for sine gunstige egenskaper siden de gamle grekerne. Olivenolje inneholder en god mengde monoumettede fettsyrer (MUFA) og flere polyfenoler som tyrosol, hydroksytyrosol, oleuropein og verbascoside.
Verbascoside, også kjent som acteosid, er et fenyletanoidglykosid ekstrahert fra Olea europea, planter av Verbascum-arten og 23 andre plantefamilier [18–20]. Den kan også fås fra biprodukter fra olivenolje (den er beriket i avløpsvann fra olivenmøller fra olivenfruktbearbeiding) eller produseres ved hjelp av metabolsk teknikk og syntetisk biologi tilnærminger [21].
Det er ennå ikke rapportert data om verbascosides biotilgjengelighet hos mennesker. Studier utført på mus, SKBR3 og Caco-2-celler tyder på at det kan være mulig for ikke-metabolisert verbascoside å krysse tarmbarrieren, sirkulere i blodplasma og utøve antioksidanteffekter [20,22,23]. I motsetning til de fleste plantepolyfenoler, virker verbascoside hovedsakelig på celler gjennom modulering av gentranskripsjon av en rekke enzymer og regulatoriske faktorer, med antioksidanter og anti-inflammatoriske effekter [24–30].
Selv om mange gunstige effekter av verbascoside for menneskers helse er kjent, er det ingen data om dens effekt på bukspyttkjertelceller. Siden oksidativt stress og betennelse er grunnlaget for T2D-patogenesen, undersøkte vi om verbascoside-behandling kan forbedre cellenes levedyktighet og
funksjon i ER-stressinduserende forhold, og vi karakteriserte de molekylære mekanismene for dens virkning. Våre data avslører at verbascoside forhindrer oksidativt stress og betennelse i celler som modulerer aktiveringen av den utfoldede proteinresponsen og fremmer mitokondriell dynamikk, noe som resulterer i økt levedyktighet og insulininnhold.
2. Materialer og metoder
2.1. Cellekultur og materialer
Muse-tc3-celler (vennligst levert av Prof. Hanahan – Institutt for biokjemi og biofysikk, University of California, San Francisco, CA [31]) ble dyrket i RPMI 1640-medium (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Italia) supplert med 10 prosent (v/v) varmeinaktivert føtalt kalveserum (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italia), 1 prosent (v/v) penicillin-streptomycin (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italia) og 1 prosent (v/v) L-glutamin (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italia). Menneskelige holmer i Langerhans ble isolert i Milano (Niguarda Ca' Granda) fra kadaveriske multiorgandonorer i henhold til prosedyren beskrevet av Ricordi et al. [32]; de ble dyrket i RPMI kulturmedium inneholdende 5,5 mmol/l glukose, 10 prosent varmeinaktivert føtalt bovint serum, 0,7 mM glutamin, 50 enheter/ml penicillin og 50 ug/ml streptomycin (EuroClone, SpA, Pero MI, Italia). Fire forskjellige holmepreparat ble brukt, holmenes renhet var 80 ± 10 prosent. Øyisolasjon og holmestudier ble godkjent av den etiske komiteen ved sykehuset Niguarda Ca' Granda i Milano (11.12.2009). tc3-celler ble behandlet med 0,8, 1,6 og 16 uM verbascoside (Carbosynth, OV08034, Compton, Storbritannia), kafésyre og hydroksytyrosol (vennlig gave fra prof. Dell'Agli, Institutt for farmakologiske og biomolekylære vitenskaper, Universita degli Studi di Milano, Milan, Italia) i komplett RPMI-medium i 5 dager, mens menneskelige øyer med 16 uM verbascoside. Metanol/etanol-behandlede celler ble brukt som kontroller. For å indusere oksidativt stress ble cellene behandlet med H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM i komplett RPMI-medium i 20 minutter før analyse, mens det ble behandlet med tunicamycin 2 ug/ml (T7765, Sigma Aldrich) ) i 7 timer ble utført for å indusere ER-stress.
2.2. Påvisning av cellelevedyktighet ved MTT-test
Celler ble sådd ut i 96 multi-brønns plater, og fem dager etter verbascoside-behandling ble de inkubert med 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetyltiazol{{7} }yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) i 4 timer i fuktet atmosfære inneholdende 5 prosent CO2 ved 37 oC. Etter inkubering ble cellene forsiktig resuspendert i 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italia) og absorbansen ved 540 nm ble detektert med en mikroplateleser (Benchmark, mikroplateleser, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og data ble uttrykt som ganger økning i forhold til kontrollprøver.
2.3. Påvisning av celledød ved flytcytometri
Fem dager etter inkubering med 16 uM verbascoside ble -cellene løsnet ved 7 min inkubering med trypsin/EDTA, samlet og sentrifugert; pelleten ble forsiktig resuspendert i fosfatbufer saltvann lavsalter. Celler ble farget med MuseTM telling og levedyktighetsreagens (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) etter produsentens protokoll og analysert gjennom strømningscytometri. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og data ble uttrykt som prosentandel døde celler over totalen.
2.4. ROS generasjon
Intracellulær ROS ble evaluert med DCFDA (2/,7/-diklorfuoresceindiacetat) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), en membranpermeabel sonde som blir fluorescerende når den bindes til ROS [34]. tc3-celler ble forhåndslastet med 15 uM DCFDA i Krebs-Ringer-buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 og 2 mM CaCl2)
supplert med 11 mM glukose i 1 time ved 37 oC. ROS-innholdet ble detektert i 30 minutter både under basal- og stressforhold med en mikroplateleser (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Sveits). Gjennomsnittsverdier og standardavvik var basert på tre uavhengige eksperimenter.
2.5. Western Blotting
tc3-celler ble samlet og solubilisert i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 prosent TERGITOLw NP40, 0,5 prosent deoksycholat) tilsatt aprotinin (Sigma Aldrich, St.452, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) og Roche-hemmere (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) i 40 min ved 4 oC. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-analyse [35] ved bruk av Bradford-reagens (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug av proteiner ble løst opp med 10 prosent SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, Burlington) MA, USA). Primære antistoffer ble påført i 2 timer i blokkerende buffer med 5 prosent fettfri melk eller 5 prosent BSA-løsninger; følgende primære antistoffer ble brukt: muse-anti- -aktin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), muse-anti-akrolein (Abcam, ab48501, Cambridge, Storbritannia), muse-anti-BIP (vennlig gave fra prof. Borgese Nica, Institute of Neuroscience, CNR, Milano, Italia), kanin anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), mus anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), kanin-anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), muse-anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), kanin anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), kanin anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), sau anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), kanin anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), kanin anti-eIF2 (Cell Signaling Technology) Inc., 5324, Danvers, MA, USA) og kanin anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). De sekundære antistoffene HRP-konjugert (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) ble brukt ved 1:5000 fortynning. Proteiner ble detektert ved å bruke ECL-deteksjonssystemet (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italia) ved å bruke Odyssey Fc Image-systemet (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Tyskland) og båndtettheten ble kvantifisert av Image Studiow Lite-programvaren (LI) -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og data ble uttrykt som ganger økning i forhold til kontrollprøver.
2.6. Mitokondriell membranpotensial
tc3-celler og menneskelige øyer i Langerhans ble inkubert med 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Italia) eller 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, 30 min, Italia) for Campoverde Srl, 30, Italia oC; Fluorescensintensiteter ble detektert med mikroplateleseren TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em for MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em for MitoSpyw Green) (TECAN Inﬧnite Ltd, Männe). Celler ble inkubert med 500 uM H2O2 i 20 minutter og fluorescensintensiteten ble påvist som tidligere beskrevet. Gjennomsnittsverdier og standardavvik var basert på tre forskjellige eksperimenter.
2.7. Mitokondriell morfologi og dynamikk
tc3-celler ble forhåndslastet med 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milano, Italia) i 11 mM glukose Krebs-Ringer-buffer ved 37 oC i 30 min. Prøver ble plassert i et bildekammer og tilfeldige felt ble avbildet ved å bruke rhodan-filteret til Axio Observer Z1-mikroskopet (Zeiss, Oberkochen Tyskland). For å evaluere mitokondriell morfologi ble følgende parametere analysert ved å bruke ImageJ partikkelanalysatorprogramvaren: areal (um2), sirkularitet (4mArea2/Perimeter2) og Ferets maksimale diameter (um) [37].
For time-lapse-eksperimenter ble enkeltcelleavbildning utført med 1 bilde per sekund i 30 s under kontroll eller oksidativt stressforhold. For å måle den mitokondrielle kumulative avstanden (um2), ble bildene først korrigert for fotobleking, deretter ble videoene analysert ved å bruke en eksisterende Image-Pro Plus Plug-in (objektsporing) (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Opp til tolv
celler ble avbildet i tre uavhengige eksperimenter og data ble presentert som gjennomsnittsverdier og standardavvik.
2.8. Insulinsekresjon
Humane isolerte holmer av Langerhans ble sådd i 96-brønnplate med en tetthet på 20 holmer per brønn, og etter 5 dagers behandling ble insulininnhold og sekresjon målt i basal (3,3 mM glukose) og stimulert (16,7 mM glukose) ) tilstander ved hjelp av en ELISA-immunoanalyse (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Sverige).
2.9. Statistiske analyser
Alle statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 8.0 på uavhengige biologiske replikater. Gjennomsnitt mellom to grupper ble evaluert ved å bruke den to-halede studentens t-test, og en p-verdi < 0.05="" ble="" tatt="" som="" bevis="" på="" statistisk="" signifikans.="" gjennomsnitt="" blant="" tre="" eller="" flere="" grupper="" ble="" sammenlignet="" med="" variansanalyse="" (anova),="" etterfulgt="" av="" flere="" post-hoc="" (tukeys)="" sammenligningstest.="" den="" statistiske="" testen="" som="" er="" brukt,="" nøyaktige="" p-verdier="" og="" antall="" replika="" (n)="" er="" angitt="" i="" de="" individuelle="" figurforklaringene.="" feilstreker="" i="" figurene="" viser="" gjennomsnittet="" ±="" sd="" eller="" gjennomsnittet="" ±="" se,="" som="">
3. Resultater
3.1. Verbascoside forbedrer cellenes levedyktighet
Siden det ikke var data om verbascoside-effekt på -celler, utførte vi MTT-test for å evaluere cellelevedyktighet, og som vist i figur 1A, ble en positiv doseavhengig trend observert. For videre studier valgte vi derfor konsentrasjonen på 16 uM som statistisk var bevist effektiv for å øke levedyktigheten til -celler. Ved hjelp av strømningscytometri studerte vi virkningen av fem dagers inkubasjon av verbascoside på -celleoverlevelse under basale forhold og etter 2{{21} } min forbehandling med 500 uM H2O2. I den basale tilstanden påvirket ikke verbascoside celleoverlevelse, noe som tyder på at den økte cellelevedyktigheten observert i MTT-analysen kan skyldes forbedret mitokondriell aktivitet. Mens, etter H2O2-eksponering, reduserte 16 uM verbascoside-forbehandling signifikant oksidativt stress-indusert celledød (Figur 1B,C). Verbascoside er et komplekst molekyl som kan modifiseres ved å hydrolysere enzymer [18]. For å teste om verbascoside-metabolitter kunne være ansvarlige for den observerte beskyttende effekten, ble tc3-celler behandlet med hydroksytyrosol og kafesyre (0,8 og 16 uM) i 5 dager. Begge metabolittene forbedret ikke cellelevedyktigheten, tvert imot ble det oppdaget en cytotoksisk effekt, mer relevant etter H2O2-eksponering, for 16 uM-konsentrasjonen (figur S1). Dette funnet beviser at verbascoside og ikke dets metabolitter utøver den beskyttende effekten på H2O2-behandling.
3.2. Verbascoside modulerer Redox-homeostasen og utøver en anti-inflammatorisk effekt i -celler
Vi bekreftet først i tc3-celler de anti-inflammatoriske og antioksidanteffektene av verbascoside observert i andre celletyper [24,29,34]. Verbascoside ROS-fjerningsaktiviteten ble evaluert med tc3-celler merket med den ROS-spesifikke DCFDA (2/,7/-diklorfuoresceindiacetat) cellulær permeable probe. Som vist i figur 2A ble en signifikant reduksjon av ROS-innhold oppdaget etter verbascoside-forbehandling, både under basale og oksidative stressforhold.
Western blot-analyser avslørte en signifikant reduksjon av oksidative stressmarkører akrolein og 4-hydroksynonenal (HNE) uttrykk i verbascoside-behandlede celler. I tillegg fant vi en økning i ekspresjon av superoksiddismutase (SOD1), noe som tyder på at verbascoside utøver sin antioksidantaktivitet sannsynligvis med to forskjellige mekanismer, direkte som en ROS-oppfanger og indirekte ved å indusere ekspresjonen av antioksidantenzymer (Figur 2B, C).
Den anti-inflammatoriske effekten av verbascoside på -celler ble vurdert ved å evaluere aktiveringen av NFKB-banen, den viktigste pro-inflammatoriske veien i disse cellene [38]. Ved western blot-analyse fant vi et redusert uttrykk for inhibitor av kjernefaktor kappa B (IKB) og kjernefaktor kappa-lettkjedeforsterker (NFKB), og en signifikant reduksjon av NFKB-fosforylering i forhåndsbehandlede celler, som støtter hypotesen om verbascoside-effektiviteten for å redusere cellulær betennelse (figur 2D,E).
3.3. Verbascoside modulerer den utfoldede proteinresponsen til -celler
Vi analyserte deretter i dybden den molekylære mekanismen som verbascoside utøver antioksidant- og anti-inflammatoriske roller med, med fokus på det endoplasmatiske retikulumet som dukker opp som en nøkkelsensor for metabolske og stresssignaler i -celler. Under stressforhold monterer organellen en homeostatisk respons, kjent som den utfoldede proteinresponsen (UPR), rettet mot å gjenopprette ER-funksjonen; imidlertid resulterer den overdrevne aktiveringen av denne banen i apoptose [39,40].
Markører for økt ER-stress er oppregulering av chaperones-proteiner og aktivering av UPR-responsen. Western blotting-analyse av celler behandlet med verbascoside viste reduserte nivåer av de to chaperoninene varmesjokkprotein 70 (HSP70) og bindende immunoglobulinprotein (BIP) (figur 3A,B). Videre ble en signifikant reduksjon av proteinkinase RNA-lignende ER kinase (PERK) uttrykk og redusert fosforylering av dens nedstrøms effekt, den eukaryote translasjonsinitieringsfaktor 2 (eIF2), oppdaget.
