Effekt av Cistanche Tubulosa-ekstrakter på mannlig reproduksjonsfunksjon hos streptozotocin-nikotinamid-induserte diabetiske rotter-Ⅱ

3.2. In vivo analyse

3.2.1. Effekter av CTE på kroppsvekt og kaloriinntak

Etter 6 ukers eksperimentering viste diabetikergruppen (HFD-DM) høyere kroppsvekt enn kontrollgruppen. HFD-DME4-gruppen viste lavere kroppsvekt enn HFD-DM- og HFD-DMER-gruppene (Figur 7a). Kaloriinntaket til kontrollgruppen var signifikant lavere enn i de andre gruppene. Det var ingen signifikant forskjell mellom kaloriinntaket til de andre fem gruppene (Figur 7b).

3.2.2. Oral glukosetoleransetest (OGTT) for å bestemme vellykket induksjon av diabetes

Den orale glukosetoleransetesten (OGTT) brukes som et lovende verktøy for å oppdage diabetisk mellitus. Økte nivåer av glukose i blodet indikerer diabetisk tilstand. Som vist i figur 8a var plasmaglukosenivået lavere i CTE-gruppene enn i DM-gruppen ved 0, 30, 90 og 120 min. Videre viste arealet under kurven (AUC) for plasmaglukosekonsentrasjon at i CTE- og RSG-gruppene ble blodsukkeropptakshastigheten økt (Figur 8b).

3.2.3. Totalt innhold av plasmaglukose, kolesterol og triglyserid

Det fastende blodsukkernivået i plasma var høyere i DM-gruppen og lavere i DME2-gruppen (unntatt kontroll) enn i andre. Det var ingen signifikant forskjell i totalkolesterol mellom gruppene bortsett fra DME4-gruppen. I DME4-gruppen var kolesterolnivået lavere enn de andre. Nivået av triglyserider var høyere i DM-gruppen og lavere i DME4-gruppen, og triglyseridinnholdet ble redusert med en økning i konsentrasjonen av CTE (tabell 2). Resultatene viser at nivået av plasmaglukose, kolesterol og triglyserider var høyere i DM-gruppen og nivået ble signifikant redusert ved behandling med CTE.

3.2.4. Plasmainsulinnivåer, plasmaleptinnivåer og homeostasemodellvurdering – insulinresistens (HOMA-IR) verdier

Nivåene av plasmainsulin, leptin og HOMA-IR-verdier er vist i tabell 3. DM-gruppen hadde høyere plasmainsulin- og plasmaleptinnivåer enn kontrollgruppen. HOMA-IR-indeksen var også signifikant høyere i DM-gruppen. Plasmainsulin-, leptin- og HOMA-IR-verdiene ble redusert med en økning i konsentrasjonen av CTE. Plasmaleptin ble signifikant redusert i CTE-gruppene, men RSG-medisingruppen (DMR) viste ingen signifikant forskjell fra DM-gruppen.

3.2.5. Effekt av CTE på plasma LH og testosteronnivåer hos diabetiske rotter

Som vist i tabell 4 var konsentrasjonene av testosteron hos diabetiske rotter (DM) signifikant redusert, menskonsentrasjonene av testosteron ble betydelig øktved ulike doser av CTE. Videre viste resultatene en liten reduksjon i nivået av LH i DM-gruppen sammenlignet med DMR, DME1, DME2 og DME4. LH-produksjonen var høyere i DME4-gruppen.

3.2.6. Effekt av CTE på spermparametrene til diabetiske rotter

De eksperimentelle resultatene viste at DM-gruppen hadde en signifikant reduksjon i spermantall og bevegelighet enn kontrollgruppen, mens spermavviksraten var signifikant økt i DM-gruppen. Interessant nok forbedret spermnummeret, spermmotiliteten og spermaunormalitetsraten til DMR-gruppen, men spermmotiliteten når ikke et signifikant nivå sammenlignet med DME4. DME2 viste bedre spermatall enn alle av dem, og motilitetsraten ble betydelig økt i DME4-gruppen. Det var ingen signifikant forskjell mellom antall unormale sædceller mellom RSG- og CTE-behandlede grupper (tabell 5).

3.2.7. Effekt av CTE på morfologien til seminiferøse tubuli hos diabetiske rotter

Figur 9 viser H&E-farging av testikkelseksjonen. Den svarte pilen angir Leydig-cellen og den hvite pilen angir Sertoli-cellen. Både Leydig-cellen og Sertoli-cellen i DM-gruppen viste betydelig atrofi og et hulrom ble sett i lumen. Strukturen til Leydig-celler og Sertoli ble gjenopprettet i CTE- og RSG-behandlede grupper. Tykkelsen på sædrøret var høyere i CTE- og RSG-gruppene enn i DM-gruppen.

3.2.8. Effekt av CTE på KiSS1, GPR54, SOCS-3 og SIRT1 MRNA i hypothalamus hos diabetiske rotter

Ekspresjonen av KiSS1 (Figur 10a), GPR54 (Figur 10b), SOCS-3 (Figur 10d) og SIRT1 (Figur 10c) ble vist i Figur 10. mRNA-ekspresjonen av KiSS1 og reseptor GPR54 hos diabetiske rotter var betydelig lavere enn i kontrollgruppen. KiSS1 og GPR 54 mRNA-ekspresjonsnivåene i DMR, DME1, DME2 og DME4 ble betydelig økt. Spesielt var GPR54 mRNA-ekspresjonen betydelig økt i DME4 og var nesten lik kontrollgruppen.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR BESKYTTELSE AV PRODUKSJONEN AV TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Dette eksperimentet undersøkte ytterligere mengden SOCS-3 og SIRT1-mRNA i hypothalamus hos rotter. Ekspresjonen av SOCS-3 mRNA hos diabetiske rotter ble betydelig økt, noe som indikerer at leptinimpedansen var mer alvorlig. DMR-, DME1-, DME2- og DME4-gruppene viste betydelige forbedringer sammenlignet med diabetikergruppen. SIRT1-mRNA-ekspresjonen i DM-gruppen ble betydelig redusert og ble betydelig økt i DME1- og DME4-gruppene.

3.2.9. Effekt av CTE på antioksidantenzymer i plasma og testis hos diabetiske rotter

Tabell 6 viser at plasma SOD-aktiviteten, GPx-aktiviteten og katalaseaktiviteten til diabetiske rotter ble betydelig redusert og aktivitetene ble økt i CTE- og RSG-behandlede grupper. I tillegg til dette viste DME4 betydelige forbedringer i GPx-aktivitet enn andre. Resultatene viste at SOD- og katalaseaktivitetene hos diabetiske rotter ble signifikant redusert etter seks uker. SOD- og katalaseaktiviteten til DMR-gruppen når ikke et betydelig nivå. De CTE-behandlede gruppene viste betydelige forbedringer i SOD- og katalaseaktiviteten. De økte aktivitetene til katalase og SOD i CTE-grupper ble også sett i testis (tabell 7). Den høyeste aktiviteten til SOD og katalase ble observert i henholdsvis DME1-gruppen og DME2-gruppene.

3.2.10. Effekter av CTE på oksidativt stress og betennelse i plasma og testikler hos diabetiske rotter

Nitrogenoksid (NO) produksjon i plasma (Figur 11a) og testis (Figur 11b) ble vist i Figur 11. Produksjonen av NO i DM-gruppen var signifikant økt både i testis og plasma sammenlignet med kontrollgruppen. En gradvis reduksjon av NO-produksjonen ble observert i DME1-, DME2- og DME4-gruppene (i plasma). DMR-gruppen viste også en betydelig reduksjon i NO-produksjonen. Når det gjelder testis, var det en liten reduksjon av NO-produksjonen ble observert i CTE-grupper, mens DMR-gruppen ikke reduserte NO-produksjonen signifikant.

Som vist i figur 12 og 13 var nivåene av TNF- og IL-6 signifikant økt hos diabetiske rotter (både i plasma og testikkel), noe som indikerer at betennelsen er mer alvorlig. I plasma er nivået av TNF- likt i de CTE- og RSG-behandlede gruppene (Figur 12a). CTE-gruppene reduserte nivået av TNF- i testiklene betydelig (spesielt DME2) (Figur 12b). Nivået av IL-6 ble betydelig redusert i plasmaet til CTE- og RSG-gruppene (Figur 13a). I testis var det en trend til en reduksjon i nivået av IL-6, men dette nådde ikke et signifikant nivå (Figur 13b).

3.2.1.1. Effekter av CTE på oksidativt stress og betennelse i spermatozoer fra diabetiske rotter indusert av fettrik diett

Figur 14 viser superoksidanioninnholdet i rottesæd. Resultatene viste at superoksidanionproduksjonen i sædcellene til diabetiske rotter økte betydelig, og det ble ikke observert noen signifikant forbedring i DMR-gruppen. DME1- og DME4-gruppene viste betydelig redusert produksjon av superoksidanion.

3.2.12. Effekter av CTE på lipidperoksidasjon i spermatozoer hos diabetiske rotter indusert av fettrik diett

Studier har vist at lipidperoksidasjonen ble økt hos både type 1 og type 2 diabetespasienter [19]. Malondialdehyd-nivået (MDA) i plasma, sperm og testikler er vist i tabell 8. MDA-nivået i plasma, testikler og sperma i DM-gruppen var signifikant høyere og behandlingen med CTE og RSG reduserte produksjonen av MDA. En signifikant reduksjon ble observert i DME4- og DMEI-gruppene i plasma. Denne studien fant at diabetiske rotter ikke bare økte graden av lipidperoksidasjon i plasma, men økte også i testikler og sædceller. Signifikant forbedring ble observert ved ulike doser av CTE.

4. Diskusjon

Diabetes er en kronisk sykdom forbundet med høyt sukkernivå i blodet. Ubalansen mellom antioksidant- og ROS-nivåer vil føre til tilstanden som kalles oksidativt stress. Superoksid, hydroksylradikal, hydrogenperoksid, nitrogenoksid og singlett oksygen er noen av eksemplene på ROS som vil bidra til diabetestilstander via oksidativt stress [20].Cistanche tubulosaer en ørkenplante som inneholder aktive komponenter som f.ekspolysakkarider, oligosakkarider, fenyletanoidglykosider (echinacoside, verbascoside), palmitinsyre, linolsyre, iridoider, alditoler og lignaner. Denne planten er i stand til å produsere antiinflammatoriske, nevrobeskyttende, antibakterielle, antivirale, antioksidative, antitumor- og immunmodulerende effekter [21]. Litteraturstudier viser at fenyletanoidglykosidene fra Cistanche tubulosa er hovedårsaken til antioksidantaktiviteten [22]. Resveratrol (RES) og rosiglitazon (RSG) ble tatt som positiv kontroll for henholdsvis in vitro og in vivo studier. RSG er en kraftig insulinsensibilisator og har en affinitet til isoformen av peroxisome proliferator-activated receptor (PPARc). Den kontrollerer hyperglykemi hos diabetespasienter [23]. RES har naturlig antioksidantaktivitet og fungerer som en vasodilator, regulerer lipoproteinmetabolismen, hemmer blodplateaggregering og forebygger kreft [24,25]. Vår undersøkelse indikerte at ECH viser bedre radikal renseaktivitet enn CTE og RES (Figur 1). Det er også forstått at ECH ikke forårsaker noen signifikant toksisitet for LC-540 og TM3 Leydig-celler (figur 2).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR MANN SEXUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE-er ble brukt til å indusere stressforhold i Leydig-celler. Produksjonen av AGE, betennelse, oksidativt stress og diabetes henger sammen. Den hyperglykemiske tilstanden til diabetes fremmer celleskade gjennom produksjon av AGE og oksidativt stress. AGE induserer celletoksisitet, noe som ytterligere fremmer rekruttering av immunceller og celledød. Et forhøyet nivå av AGE fremmer uttrykket av to typer reseptorer kalt RAGE og AGER1 [26]. Dryppen og den påfølgende overføringen av et elektron fra mitokondriell respirasjonskjede til molekylært oksygen under oksidativt stress resulterer i dannelsen av et superoksidanion. Resultatene våre viser at produksjonen av superoksidanion indusert av AGE ble økt i kontrollgruppen og ytterligere forbedringer ble observert med både ECH- og RES-behandlinger. I følge vår studie ble det forstått at produksjonen av superoksid (Figur 3) og H2O2 (Figur 4) indusert av AGE ble redusert i nærvær av ECH og RES.

NF-KB er kjent som den viktige mediatoren for betennelse assosiert med diabetes [27]. Uttrykket av NF-KB fører til celledysfunksjon og celledød. Aktiveringen av NF-KB ved oksidativt stress stimulerer den pro-inflammatoriske responsen, oppregulering av endotelin og apoptose [28]. Ekspresjonen av RAGE og NF-KB ble økt i AGE-stimulerte grupper og den påfølgende reduksjonen ble observert i ECH- og RES-behandlede celler (Figur 5).

Testosteroner et anabole steroid og primærtmannlig kjønnshormonsyntetisert fra kolesterol. Prosessen starter med oksidativ spaltning av kolesterols sidekjede av kolesterolsidekjedespaltingsgenet (CYP11A). Dette genet er lokalisert i mitokondriemembranen og omdanner kolesterolet til pregnenolon. Deretter fjerner CYP17A1-genet fra det endoplasmatiske retikulum to ekstra karbonatomer og produserer flere C19-steroider. I tillegg til dette oksideres pregnenolonet til androstenedion/progesteron av hydroksysteroiddehydrogenase (3- -HSD). Til slutt produseres testosteron ved reduksjon av ketogruppen i den 17. karbonposisjonen til androstenedion av 17-beta-hydroksysteroiddehydrogenase (17- -HSD). Leydig-celler er involvert i hovedproduksjonen av testosteron. Overføringen av kolesterol til den indre mitokondriemembranen krever virkningen av steroidogent akutt regulatorisk protein (StAR). Nåværende studier viser at ekspresjonen av StAR, CYP11A1, CYP17A1 og HSD17 3 ble redusert i AGE-behandlede celler (kontroll), og det ble vist en enorm økning i ECH- og RES-behandlede celler (Figur 6) . Dermed viser resultatene at produksjonen avtestosteron ble økt i de ECH- og RES-behandlede gruppene. 

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEX POWER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Under en diabetisk tilstand er transporten av glukose til organer begrenset og som et resultat øker glukosenivåene [29]. Derfor er den hyperglykemiske tilstanden en av de viktige markørene for diabetikerdeteksjon. Våre studier viser at plasmaglukosenivået ble økt i diabetikergrupper og AUC for DM-gruppen var signifikant høyere enn de andre gruppene (Figur 8). Sammen med plasmaglukose ble det totale kolesterol- og triglyseridinnholdet betydelig økt i DM-gruppen (tabell 2). Åreforkalkning lettes av et økt nivå av kolesterol og triglyserider [30]. Nivået av kolesterol og triglyserider ble imidlertid redusert i CTE- og RSG-behandlede grupper. Triglyseridinnholdet i DME4-gruppen nådde nesten tilsvarende verdier som kontrollgruppen.

Insulin er et hormon produsert av cellene i bukspyttkjertelen og funksjonalisert for å kontrollere blodsukkernivået i kroppen, mens leptin er et hormon produsert av adipocyttene som er i stand til å regulere matinntak og energiutnyttelse. Studier indikerte at leptin er involvert i patofysiologien til fedme og det er en positiv interaksjon mellom leptin og insulin [31]. Våre studier viser at nivået av plasmainulin og leptin var høyere i DM-gruppen og insulinnivået ble redusert med en økning i konsentrasjonen av CTE. RSG-gruppen viser ingen signifikant forskjell fra DM-gruppen. Insulinresistensen og cellefunksjonen ble vurdert ved HOMA-IR-metoden. HOMA-IR-verdien økte i DM-gruppen og var signifikant forskjellig fra andre grupper (tabell 3).

DM påvirker reproduksjonsfunksjonen via den hormonelle vekslingen i HPG-aksen og studier viste at insulinuttrykket i testiklene også påvirkes av diabetes. Det er preget av Sertoli-cellevakuolisering, økt DNA-fragmentering, svekket spermatogenese og økt kjønnscelleutarming. Oksidativt stress bidrar også til abnormiteter i reproduktiv funksjon [32]. Prosessen med dannelse av sædceller i det mannlige reproduksjonsorganet (testikler) kalles spermatogenese. Testis er sammensatt av tett kveilede tubuli kalt seminiferous tubuli. Sertoli-celler sees i veggene i sædrøret og gir næring til den umodne sædcellen. Undersøkelsen av spermparametere indikerte at antall sædceller og motilitet gikk ned og abnormitetene økte i DM-gruppen (tabell 5). En motsatt effekt ble observert i de CTE- og RSG-behandlede gruppene. Både Leydig-cellen og Sertoli-cellene i DM-gruppen viste betydelig atrofi og hulrommet ble sett i lumen. Tykkelsen på sædrøret ble også redusert i DM-gruppen. Et forbedret resultat ble observert i CTE- og RSG-behandlede grupper (Figur 9). I tillegg til dette sank nivået av LH og testosteron i DM-gruppen og nivåene økte i CTE-behandlede grupper (tabell 4). Hos menn var lavt serumtestosteron og lavere LH-pulsfrekvens ofte assosiert med fedme og diabetes mellitus type 2 [33].

Kisspeptiner kodet av KiSS1-genet er kjent som den potente stimulatoren til HPG-aksen, og enhver mutasjon i kisspeptingenet vil føre til lave nivåer av kjønnssteroider og gonadotropin. Studier viser at hos STZ-induserte diabetiske rotter ble Kiss1 mRNA-nivåene redusert [33]. Initiering og vedlikehold av pattedyrs infertilitet er forbundet med G-proteinkoblet reseptor 54 (GPR54). Mutasjonen i GPR 54 er preget av fravær av seksuell modning og lave nivåer av gonadotrope hormoner (LH og FSH). Pro-inflammatoriske cytokiner som IL-6 og TNF- oppregulerer uttrykket av suppressoren av cytokinsignalering 3 (SOCS3) involvert i betennelsesmediert insulinresistens i leveren og adipocyttene [34]. SIRT 1 er et gen assosiert med regulering av flere aldringssykdommer. Dette genet er fremtredende uttrykt i cellene i bukspyttkjertelen og regulerer insulinsekresjon og forhindrer apoptose. Gjeldende studier indikerte at uttrykket av KiSS1, GPR54 og SIRT1 sank i DM-gruppen, men uttrykket økte i CTE-behandlede grupper (Figur 10). En økning i SOCS-3-uttrykkene i DM-gruppen indikerer den inflammatoriske tilstanden. Den første molekylære koblingen identifisert mellom fedme og betennelse var TNF-. Derfor er et økt nivå av TNF- en indikator på betennelse. Det reduserte nivået av pro-inflammatoriske cytokiner som TNF- og IL-6 ble sett i CTE-behandlede grupper (figur 12 og 13).

Ubalansen mellom ROS og antioksidanter fører til diabetisk tilstand. Superoksiddismutase (SOD), katalase (CAT) og glutationperoksidase (GPX) er kjent som de primære antioksidantene som er ansvarlige for å opprettholde det optimale ROS-nivået [35]. Fra resultatene ble det funnet at aktiviteten til antioksidanter var betydelig lavere i DM-gruppen. CT-behandlede grupper viste forbedringer i produksjonen av antioksidanter. Den RSG-behandlede gruppen viste ingen signifikante forbedringer i antioksidantaktivitet (tabell 6 og 7).

Nitrogenoksid (NO) er kjent som en viktig ROS som bidrar til betennelse. Våre studier påpeker at nivået av NO ble redusert i CTE-behandlede grupper (figur 11). Resultatene viste at superoksidanioninnholdet i sædcellene til diabetiske rotter økte signifikant og det var ingen signifikant forbedring etter administrering av RSG. Produksjonen av superoksid ble redusert i CTE-grupper.

Bestemmelsen av MDA er svært nyttig for å evaluere lipidperoksidasjon. Lipidperoksidasjon er prosessen med oksidasjon i lipider og resulterer til slutt i celleskade. MDA produseres som et resultat av lipidperoksidasjon av flerumettede fettsyrer. Studier viser at MDA-nivå er korrelert med alder og fastende blodsukkernivå [36]. Den nåværende studien indikerte at CTE forbedrer lipidperoksidasjon i plasma, testikler og sædceller (tabell 8).

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Konklusjoner

Det oksidative stresset under diabetiske tilstander forstyrrer det mannlige reproduksjonssystemet gjennom svekkelse av sædceller og gonadedysfunksjon. Cistanche tubulosa er en ørkenplante som er allment akseptert i kinesisk medisin på grunn av dens farmakologiske effekter.Echinacoside (ECH)er hovedbestanddelen av CTE som er ansvarlig for dens antioksidant- og antiinflammatoriske aktiviteter. Våre in vitro-resultater indikerte at ECH gjenopprettet testosteronsynteseveien og senket nivået av NF-KB og RAGE-proteinekspresjon. ECH hemmet effektivt produksjonen av superoksidanion og H2O2 i Leydig-celler. In vivo-studiene viste at ECH reduserte nivåene av kolesterol, triglyserider, TNF- og IL-6. I tillegg til dette ble mRNA-uttrykkene i hypothalamus hos diabetiske rotter betydelig forbedret. Det er også å merke seg at ECH reduserte lipidperoksidasjon og forbedret insulinresistens hos diabetiske hannrotter. Antioksidantaktivitetene økte både i plasma og testikler. Derfor antydet studiene våre at ECH ga effektiv beskyttelse mot reproduktiv dysfunksjon hos STZ-induserte diabetiske hannrotter.