Effekt av Runing II på veksten og metastaseringen av transplantert svulst i brystkreftbærende mus og dens mekanisme

Objektiv:

For å studere effekten av Runing II (et kinesisk urtepreparat for brystkreft) på vekst og metastasering av transplanterte svulster av brystkreft MA-891-bærende TA2-mus og dens mekanisme. Metoder: Modellen for brystkreft MA-891 cellestamme transplantert tumor av TA2-mus med lungemetastase ble utviklet for å observere effekten av Runing II på veksten og metastasen til den transplanterte tumoren. Den immunhistokjemiske metoden og bildeanalysen ble tatt i bruk for å oppdage nivåene av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), vaskulær endotelial vekstfaktorreseptor (VEGFR), antall mikrokar (MVC) og mikrokarareal (MVA).

Resultater: I Running II-gruppen var hemmingsraten for tumorvekt og lungemetastasehemmingen henholdsvis 37,3 prosent og 65,4 prosent, tumorveksten og lungemetastasen var åpenbart hemmet; Og nivåene av VEGF og VEGFR, MVC og MVA ble betydelig redusert sammenlignet med de i den tumorbærende kontrollgruppen (P<0.05). Conclusion: The Chinese herbal preparation Running II can inhibit the metastasis of tumors by inhibiting angiogenesis, and the mechanism is possibly related to the down-regulation of VEGF and VEGFR expression.

I tillegg, samtidig med forskning, fant vi at echinacea i Cistanche har en anti-tumor effekt. For anvendelse av echinacosid i antitumormedisiner tilsetter den foreliggende oppfinnelse først MTH1, uorganisk pyrofosfatase og dGTP til reaksjonsløsningen (100mM pH8.0 Tris-eddiksyre, 40mM NaCl, 10mM magnesiumacetat, 0,005 prosent Tween20 og 1 mMDTT) I metoden ble enzymet og substratet inkubert ved romtemperatur i 1 time og deretter ble 25 ul av den malakittgrønne løsningen tilsatt for å avslutte reaksjonen. Absorbansen ble detektert ved 630 nm med en BIO-RAD iMark mikroplateleser. Resultatene viste at echinakosid hadde en signifikant hemmende effekt på enzymaktiviteten til MTH1; For det andre ble effekten av echinacosid på tumorceller på cellenivå oppdaget ved MTT-analyse, og resultatene viste at echinacosid kunne hemme veksten av SW480 tykktarmskreftceller og U2OS humane osteosarkomceller betydelig, og den foreliggende oppfinnelsen hemmet veksten av echinacosid MTH1, et spesifikt enzym som opprettholder overlevelse i tumorceller, fører til inkorporering av oksiderte nukleotider i DNA, noe som forårsaker dødelige DNA-dobbeltstrengsbrudd i kreftceller, og gir dermed antitumoreffekter. Den nye medisinske applikasjonen vil legge grunnlaget for utviklingen av nye antitumormedisiner i fremtiden.

Klikk cistanche effekter produkt

Nøkkelord:

brystsvulst; angiogenese; vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF); Running II (et kinesisk urtepreparat for brystkreft)

Brystkreft er en ondartet svulst som alvorlig truer kvinnelig helse, og sykdomsforekomsten rangerer først blant kvinnelige ondartede svulster, med en tendens til å øke år for år. Selv om dens terapeutiske metoder har gjort noen fremskritt, har den langsiktige overlevelsesraten for pasienten med brystkreft ikke blitt hevet på grunn av invasiv vekst og metastasering av svulster. Angiogenese av svulster er en grunnleggende betingelse for vekst, invasjon og metastasering av svulster.

Derfor er hemming av angiogenese av svulster en effektiv måte for å forhindre produksjon og utvikling av svulster og forlenge pasientens levetid.1 I denne studien er mekanismen til det kinesiske stoffet Running II med funksjoner som supplement til qi og nærende yin, regulering av gjennomfartsvei og unnfangelseskar, oppløsing av masse og avgiftning ved inhibering av tumor og anti-metastase ble studert fra angiogenese og dens regulatoriske faktorer i den transplanterte svulsten til brystkreft MA-891 av TA2-mus med lungemetastase.

MATERIALER

Seksti SPF TA2-hunnmus, som veide (20±2) g, i alderen 6-8 uker, ble kjøpt fra Institutt for forsøksdyr, Tianjin University of Medical Sciences. Mammakreft MA-891-cellestammen til musen ble levert av prof. Luo Liqin, det patologiske laboratoriet, Institute of Tumor, Chinese Academy of Medical Sciences.

Runing II er sammensatt av Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), Tai Zi Shen (Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Yi Yi Ren ( Semen Coicis), Yin Yang Huo (Herba Epimedii), Dang Gui (Radix Angelicae Sinensis), etc., med doseforhold på 1,67: 1,67: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1,33: 1, som ble tilberedt et avkok av Seksjon for farmasi, Longhua Hospital, i henhold til en tradisjonell teknikk, og holdt ved 4ć for bruk; Cyklofosfamid (CTX, 200 mg/ampull, grennummer: 981104) og tamoxifen (TAM) ble produsert av Shanghai Hualian Pharmaceutical Co. Ltd.; Normal saltvann ble produsert av Shanghai Fumin Pharmaceutical Co.

Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) polyklonalt antistoff (arbeidsfortynninger 1:25–1:50), vaskulær endotelial vekstfaktorreseptor (VEGFR, arbeidsfortynninger 1:30–1:50) og FVIIIAg polyklonalt antistoff (arbeidsfortynning 1:50 ) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc; EnVision andre antistoff, kanin anti-rotte VEGF antistoff, geit anti-kanin FVIII Ag antistoff og geit anti-kanin VEGFR antistoff, og EnVision Kit ble kjøpt fra Dako Co., Danmark; 3,3- Diaminobenzidin (DAB) ble kjøpt fra Shanghai Huamei Bioengineering Factory.

METODER

Utvikling av dyremodell

Dyremodellen ble utviklet med slutning til metodene til Luo og Gao, et al.2,3. In vitro-dyrket brystkreft MA-891-celler fra mus i en logaritmisk overlevelsesfase ble valgt og konsentrasjonen av celler ble regulert til 1x107/ml. Under de aseptiske forholdene ble pattedyrkreftcellene inokulert i TA2-musens subkutane del av høyre aksill (0,2 ml/mus, dvs. 2X106 celler/mus).

Gruppering av dyr og administrasjonsmåter

To dager etter inokulering ble musene tilfeldig delt inn i 4 grupper, 15 mus i hver gruppe. 1) Tumorbærende kontrollgruppe: 0,4 ml normalt saltvann ble administrert intragastrisk, en gang hver dag, fem ganger hver uke. 2) Running II-gruppe: Running II ble fortynnet med vanlig saltvann og 0.4 ml av denne fortynningen tilsvarende 48 g·kg{{10}}·d-1 som var beregnet i henhold til den vedlagte tabellen "Konverteringstabell mellom menneskelig og dyrs kroppsoverflate" i "Methodology of Studies on pharmacology of Chinese Drugs"4 ble gitt intragastrisk, en gang daglig, fem ganger hver uke. 3) CTX-kontrollgruppe: Omtrent doseringen brukt av Jiang Bo, 5 CTX ble fortynnet med vanlig saltvann, og 0,4 ml tilsvarende 50 mg·kg-1·d-1 var gitt intragastrisk, en gang annenhver dag, tre ganger hver uke. 4) TAM-kontrollgruppe: TAM ble fortynnet med vanlig saltvann og 0,4 ml tilsvarende 2,7 mg·kg-1·d-1 ble administrert intragastrisk, en gang daglig, fem ganger hver uke. Legemidlene ble gitt i 3 uker i alle fire gruppene.

Prøvetaking

På den 22. dagen etter administrering ble musene avlivet ved dislokasjon av cervikale ryggvirvler og veid. Deretter ble svulstmassen og lungen tatt og veid henholdsvis. Den virkelige kroppsvekten til musen=vektet kroppsvekt – svulstvekten. Grå noder på lungeoverflaten, dvs. metastasefokus, ble talt med det blotte øye. Svulstmassen ble plassert i en 10 prosent nøytral formaldehydløsning for fiksering, etterfulgt av parafininnstøping, ultratynne seksjoner, immunhistokjemisk Envision to-trinns straining og bestemmelse av VEGF, VEGFR, antall mikrokar (MVC) og mikrokarareal (MVA).

Inhiberingshastigheten for tumorvekt

Tumorhemmingsraten=(gjennomsnittlig tumorvekt for kontrollgruppen etter behandling – gjennomsnittlig tumorvekt for medikamentgruppen etter behandling)/gjennomsnittlig tumorvekt for kontrollgruppen etter behandling × 100 prosent.

Inhiberingshastigheten for lungemetastase

Hemmingsraten for lungemetastase=(gjennomsnittlig lungemetastaseknutenummer for kontrollgruppen – gjennomsnittlig lungemetastaseknutenummer for medikamentgruppen)/gjennomsnittlig lungemetastaseknutenummer for kontrollgruppen x 100 prosent .

Immunhistokjemisk Envision to-trinns farging

Parafinsnittet på 4 μm ble tatt, etterfulgt av rutinemessig deparafin med xylen, gradientdehydrering og vasking med PBS, 5 min x 3 ganger; seksjonen ble nedsenket i 0.01 mol/L, pH 6,0 sitratbuffer, satt i en mikrobølgeovn på 98ć i 10 minutter for antigen reparasjon og naturlig avkjølt ved romtemperatur etter uttak fra mikrobølgeovn; drypp det første antistoffet (henholdsvis ovennevnte antistoff og fortynning av tilsvarende antistoff), 37ć, 90 min, vask med PBS, 5 min x 3 ganger; drypping av Envasion andre antistoff, ved romtemperatur i 60 minutter, vasking med PBS, 5 minutter x 3 ganger; drypp nypreparert DAB-fargefremkallende løsning, kontroll av fremkallende farge i 3–10 minutter under mikroskop, motfarging i 45 s med campeachy, skylling med vann fra springen, tørking med blåser, montering med nøytral tyggegummi. Cellen med cytoplasma av brun-gul eller svart-brun granuler ble sett på som positiv. Den kjente positive delen av brystkreft ble brukt som en positiv kontroll, og den hvor PBS-buffer erstattet det første antistoffet ble brukt som en negativ kontroll.

Bildeanalyse

ACE videokamera (oppløsningskraft 930 linjer) og LEICAQ500W bildeanalysator og LEICA helautomatisk bildeanalysesystem ble brukt. Under et mikroskop x 200 ble 2 synsfelt i hver seksjon tilfeldig valgt for bestemmelse av VEGF eller 3 synsfelt for bestemmelse av VEGFR og MVA, og prosentandelen positivt område til hele synsfeltområdet ble beregnet i alle gruppene . For bestemmelse av MVC ble 5 regioner med de rikeste blodårene valgt i hver seksjon under et mikroskop x 100, og deretter under x 400 ble mikrokarene i hvert synsfelt med 5 ikke-overlappende regioner talt, og gjennomsnittet ble brukt. som en gjennomsnittlig mikrokarteller (MVC) av svulsten.

Statistisk metode

Programvare SPSS8.0 ble brukt og kjikvadrattesten ble brukt for sammenligningen mellom frekvensene, og en t-test eller enveis ANOVA ble brukt for sammenligning av gjennomsnitt.

RESULTATER

Tumorhemmende og antimetastaseeffekter av Running II på den transplanterte svulsten i brystkreft MA-891-bærende TA2-mus med lungemetastase

It was shown in Table 1 that the tumor weight inhibition rate was 37.3% in the Runing II group and 86.2% in the CTX control group, both tumor inhibition rates being >30 prosent, med betydelig forskjell (begge P<0.05) as compared with both tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor-inhibiting effect. And there was a significant difference (P<0.05) between the Runing II group and the CTX control group in the tumor inhibition rate, indicating that the tumor-inhibiting effect of Runing II was lower than that of CTX. The lung metastasis inhibition rate was 65.4% in the Runing II group and 43.9% in the CTX control group, with significant difference (both P<0.05) as compared with a tumor-bearing control group and TAM control group, indicating that both Runing II and CTX have a certain tumor metastasis-inhibiting action. And there was a significant difference between the Runing II group and the CTX control group (P<0.05) in the lung metastasis inhibition rate, suggesting that the anti-metastasis action of Runing II is superior to that of CTX.

Effekter av Running II på VEGF- og VEGFR-uttrykk i den transplanterte svulsten til MA-891--bærende TA2-mus

Som vist i tabell 2, var uttrykkene av VEGF og VEGFR i både Running II-gruppen og CTX-kontrollgruppen signifikant lavere enn de i den tumorbærende kontrollgruppen (P<0.05), with a significant difference between the two. In the Running II group, the VEGF and VEGFR expressions were not significantly different from those in the CTX control group (P>0.05), var VEGF-uttrykket betydelig lavere enn det i TAM-kontrollgruppen (P<0.05), and the VEGFR expression was similar to that in the TAM control group (P>0.05). In the CTX control group, the VEGF and VEGFR expression was lower than those in the TAM control group. In the TAM control group, the VEGF expressions were similar to that in the tumor-bearing control group (P>0.05), og VEGFR-uttrykket var lavere enn det i den tumorbærende kontrollgruppen (P<0.05).

Effekt av kjøring II på MVA og MVC av den transplanterte svulsten i MA-891-bærende TA2-mus

Som vist i tabell 3, var nivåene av MVA og MVC i den transplanterte kreften i medikamentgruppene signifikant lavere enn i den tumorbærende kontrollgruppen (P<0.05); in the Running II group, the levels of MVA and MVC were significantly higher than those in the CTX control group (P<0.05), the level of MVC was lower than that in the TAM control group (P<0.05), and the MVA level was similar to that in the TAM control group (P>0.05).

DISKUSJON

Tradisjonell kinesisk medisin hevder at tilblivelsen og utviklingen av svulsten skyldes de omfattende effektene av idiopatiske og empatiske faktorer, men med stress på førstnevnte. I en tidligere klinisk studie mente professor Lu og Tang at vital-qi-mangel i det indre og disharmoni av gjennomfartsvei og unnfangelseskar er hovedårsakene til tumorgenese, og intern invasjon, flytting og spredning av kreftpatogener er hovedbetingelsene for vekst og metastasering av brystkreft.6 Derfor, i behandlingen, tar de til orde for næring av vital qi og fjerning av masser. Running II er en kinesisk urteformel som er oppsummert gjennom mange års klinisk praksis i henhold til behandlingsprinsippet om å styrke kroppens motstand først og eliminere patogene faktorer dernest. I formelen er Sheng Huang Qi (Radix Astragali Mongolici), Tai Zi Shen ( Radix Pseudostellariae), Gou Qi Zi (Fructus Lycii), Yin Yang Huo (Herba Epimedii) suverene ingredienser, med effekter av å supplere qi og nærende yin, regulerende gjennomfartsvei og unnfangelseskar, som samsvarer med vanlige kjennetegn ved brystkreft som både qi- og yin-mangel og disharmoni i gjennomfartsåre og unnfangelseskar. Klinisk oppnår denne formelen den åpenbare effekten av å forlenge overlevelsestiden, øke livskvaliteten, stabilisere tumorfokus og forhindre metastasering av kreft.

Denne studien etablerte modellen for brystkreft MA-891 cellestammetransplantert svulst fra TA2-mus med lungemetastase og observerte effekten av Running II på solid tumorvekst og lungemetastase, og fant at det var signifikante forskjeller i svulsten inhiberingshastighet og lungemetastasehemmingshastigheten mellom Running II-gruppen og den tumorbærende gruppen, og mellom Running II-gruppen og CTX-kontrollgruppen, som viser at Running II har åpenbare funksjoner for å hemme tumorvekst og antimetastase. I tillegg har ikke tamoxifen (TAM) den åpenbare funksjonen å hemme svulstvekst og anti-metastase i modellmusene, og ligner på resultatet at brystkreft MA-891 er ER-cellestamme og rapporten om direkte virkning av lav konsentrasjon av TAM i utlandet.7

Svulsten er en typisk blodkaravhengig sykdom, og dens vekst, infiltrasjon og metastasering avhenger av angiogenese. Samtidig gir neovaskulariseringen igjen en metastasekanal for tumorceller, og skaper gunstige forhold for vekst, metastasering og diffusjon av tumoren. 8, 9 VEGF er en pro-angiogen faktor med den sterkeste, unike og spesifikke virkningen på vaskulære endotelceller, og mange tumorceller kan skille ut VEGF, som øker vaskulær permeabilitet og virker direkte på vaskulære endotelceller gjennom binding til VEGF-reseptoren, stimulerer dens deling og spredning, induserer angiogenese av tumor og påvirker antall mikrokar, for å fremme vekst og metastasering av tumor.10,11 De fleste tumorceller har høyt VEGF-uttrykk, mens det i det normale vevet kun er et lite antall organer som f.eks. nyrene, eggstokken, etc., har høyere VEGF-uttrykk. Derfor mener noen forskere at VEGF kan brukes som markører for tumormetabolisme og metastase12 og mer ideell måldel for å blokkere neoangiogenese i svulster,13 og forstyrre vaskulære regulatoriske faktorer av svulster og dens virkende kobling, regulere uttrykket av angiogenesefaktorer, og inhibering av angiogenese kontrollerer muligens vekst og metastasering av tumor.

Resultatene i denne studien indikerer at Runing II kan nedregulere uttrykk av VEGF og VEGFR for å muligens blokkere signalledning av VEGF-indusert migrasjon og proliferasjon av endotelceller, og ytterligere hemme angiogenese i svulster, og dermed utøve antineoplastiske og antimetastaserende effekter .

Tidligere studier har vist at i vekstforløpet til ondartede svulster, induserte overrask vekst av vevet uunngåelig alvorlig anoksi av lokalt vev, og anoksi kunne stimulere syntesen av VEGF mRNA og bremse nedbrytningen av VEGF mRNA for å indusere genesen av en stort antall lokale nye kapillærkar.14,15 Ved observasjon av immunhistokjemiske positive fargingsceller fant forfatterne åpenbart VEGF-ekspresjon i cytoplasmaet til døende nekrotiske tumorceller, tvert imot mindre eller ingen ekspresjon av VEGF i tumorceller med aktiv proliferasjon , som kan være relatert til et høyere nivå av anoksi-induserende faktor i tumorceller, i samsvar med rapporten til Talks KL, et al.16 Running II inneholder Dang Gui (ᔧᔦ Radix Angelicae Sinensis), E Zhu (Rhizoma Curcumae Phaeocaulis), Sheng Yi Yi Ren (Semen Coicis), Shan Ci Gu (Pseudobulbus Cremastrae), etc., som fungerer som aktiverer blodsirkulasjonen, løser slim og fjerner grumsete. De hemmer syntese og sekresjon av VEGF muligens gjennom å forbedre lokal mikrosirkulasjon av svulsten, øke oksygentilførselen til tumorceller, og dermed hemme veksten av svulsten for å utføre anti-metastase.

REFERANSER

1.Folkman J. Angiogenese og brystkreft. J Clin Oncol 1994; 12: 441-443.

2. Folkman J. Angiogeneseforskning: fra laboratorium til klinikk. Forum (Genova) 1999; 9: 59-62.

3. Potgens AJ. Ekspresjon av vaskulær permeabilitetsfaktor påvirker tumorangiogenese i humane melanomlinjer xenografert til nakne mus. Am J Pathol 1995; 5: 775-782.

4. Sauter ER, Nesbit M, Watson JC, et al. Den vaskulære endoteliale vekstfaktoren er et marked for tumorinvasjon og metastaser i plateepitelkarsinomer i hode og nakke. Clin Cancer Res 1999; 5: 775-782.

5. Warren RS, Yuan H, Matli MR, et al. Regulering av vaskulær endotelial vekstfaktor ved hypoksi. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

6. Levy AP, Levy NS, Goldberg MA. Post-transkripsjonell regulering av vaskulær endotelial vekstfaktor ved hypoksi. J Biol Chem 1996; 271: 2746-2753.

7. Samtaler KL, Turley H, Gatter KC, et al. Uttrykket og distribusjonen av de hypoksi-induserbare faktorene HIF-1 alfa og HIF-2 alfa i normalt humant vev, kreft og tumorassosierte makrofager. Am J Pathol 2000; 157: 411-421.

For more information:1950477648nn@gmail.com