Forbedring av fenyletanoid glykosider biosyntese i cellekulturer av Cistanche Deserticola ved osmotisk stress

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

AbstraktEffekten av osmotisk stress på cellevekst og fenyletanoidglykosider (PeGs) biosyntese ble undersøkt i cellesuspensjonskulturer avCistanche deserticolaYC Ma, en ørkenmedisinplante dyrket i den vestlige delen av Kina. Ulike initiale sukrosekonsentrasjoner påvirket celleveksten og PeGs-biosyntesen i suspensjonskulturene betydelig, og den høyeste tørrvekten og PeGs-akkumuleringen nådde henholdsvis 15,9 gl–1-DW og 20,7 mg g–1-DW ved den innledende osmotiske stress på 300 mOsm kg–1 hvor sukrosekonsentrasjonen var 175,3 mM. Støkiometrisk analyse med forskjellige kombinasjoner av sukrose og ikke-metabolsk sukker (mannitol) eller ikke-sukker osmotiske midler (PEG og NaCl) viste at osmotisk stress i seg selv var en viktig faktor for å forbedre PeGs-biosyntesen i cellesuspensjonskulturer avCistanche deserticola. Maksimalt PeG-innhold på 26,9 og 23,8 mg g–1-DW ble oppnådd etter 21 dager ved kombinasjonene av 87,6 mM sukrose med 164,7 mM mannitol (henholdsvis 303 mOsm kg–1) eller 20 mM PEG, som var høyere enn den av C. deserticola-cellekulturer dyrket under en initial sukrosekonsentrasjon på 175,3 mM etter 30 dager. Den stimulerte PeGs-akkumuleringen i cellesuspensjonskulturene var korrelert til økningen av fenylalanin ammoniumlyase (PAL) aktivitet indusert av osmotisk stress.

Nøkkelord Cistanche deserticola, Ørkenmedisinplante, Fenyletanoidglykosider, Osmotisk stress, Fenylalanin ammoniakklyase

Cistanchetubulosahar mange effekter, klikk her for å vite mer

Introduksjon

Cistanche deserticolaYC Ma, en dyrebar kinesisk urt, parasitterer røttene til Haloxylon ammodendrun og vokser i ørkenområder i det vestlige Kina. Fenyletanoidglykosider (PeGs), de viktigste bioaktive komponentene isolert fra C. deserticola, har markerte aktiviteter for å fjerne frie radikaler, forbedre immunitet, forbedre seksuell funksjon, etc. (Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). På grunn av ukontrollert utnyttelse og utnyttelse avCistanche deserticola, naturressursen tilCistanche deserticola var på kanten av utmattelse. I lys av disse problemene har PeG-produksjon av cellesuspensjonskulturer av C. deserticola blitt ansett som et lovende alternativ for å løse mangelen påCistanche deserticolaplantematerialer (Lu og Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).

Osmotisk stress er en viktig faktor som påvirker plantevekst, utvikling, morfogenese og dannelsen av sekundære metabolitter. Økt produksjon av sekundære metabolitter fra in vitro vevskulturer under optimalt osmotisk stress er rapportert i noen få medisinske plantearter (Kim et al. 2001; Wang et al. 1999; Wu et al. 2005). Sukrose er et vanlig osmotisk stressmiddel som brukes i disse tilfellene, og fungerer også som en viktig karbon- og energikilde. Derfor er det svært vanskelig å skille effekten av osmotisk stress og den ernæringsmessige rollen til sukker som karbonkilder. En økning av initial osmotisk stress med ikke-metabolsk mannitol, sorbitol og PEG forbedret også paklitaksel-akkumulering i Taxus Chinensis-cellekulturer, saponin- og polysakkaridakkumulering i Panax notoginseng-cellekulturer, og eleutheroside-akkumulering i Eleutherococcus sessili et al. et al. 2001; Shohael et al. 2006). Resultatene deres indikerte at effekten av karbohydratkonsentrasjon og osmotisk stress var forskjellige i henhold til plantearter og sekundære metabolitter.

Målet med denne studien er fokusert på de osmotiske effektene av sukrose, mannitol, PEG og NaCl på cellevekst og PeGs biosyntese iCistanche deserticolacellesuspensjonskulturer. PAL-aktivitet i suspensjonskulturene ble undersøkt under forskjellige kombinasjoner av innledende osmotiske midler, og den mulige mekanismen for forbedret PeGs-akkumulering ved å øke osmotisk stress diskuteres.

Materialer og metoder

Plantematerialer og kallusinduksjon

Frø avCistanche deserticolaYC Ma ble samlet inn fra ørkenområder i Xinjiang-provinsen i Kina og lagret i 4C før bruk. Botanisk identitet ble bekreftet ved sammenligning med referansestandarder ved Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, PR China. Frø ble overflatesterilisert ved å dyppe i 70 prosent etanol i 30 s, deretter nedsenket i en 20 prosent vandig løsning av 5,4 prosent natriumhypokloritt i vann i 20 minutter, etterfulgt av tre skyllinger med sterilt destillert vann. Calli ble indusert fra overflatesteriliserte frø avCistanche deserticolapå MS (Murashige og Skoog 1962) medium supplert med 1.0 mg l–1 naftaleneddiksyre (NAA), 2.0 mg l–1 6-benzyladenin ({{7} }BA), 0.25 mg l–1 2, 4-diklorfenoksyeddiksyre (2, 4-D), 6 gl–1 agar (PhytoTechnology LaboratoriesTM, produkt-ID: A181) og 30 gl-1 sukrose i 60 dager i et vekstskap i mørke ved 25C. Kalluskulturene indusert fra frøeksplantatene ble deretter subkulturert til ovennevnte faste medium med et intervall på 30 dager (Cheng et al. 2005a).

Etablering og vedlikehold av cellesuspensjonskulturer

Suspensjonskalluskulturene (3,0 g frisk vekt) som ble filtrert gjennom en 1,000 lm mesh sikt og holdt tilbake på en 200 lm mesh sikt, ble subkulturert til en 500-ml Erlenmeyer kolbe inneholdende 100 ml av det ovennevnte flytende mediet på en roterende rister ved 110 rpm ved 25C i mørke med et subkulturintervall på 18 dager. Mediets pH ble justert til 5,8 med 1 M NaOH eller 1 M HCl før autoklavering. Suspensjonscalluskulturene subkulturert etter ti ganger ble brukt som inokulum for den følgende eksperimentelle kolbekulturen. Alle kolbeeksperimenter ble utført i 250 ml Erlenmeyer-kolber inneholdende 50 ml flytende medium med 30 gl-1 sukrose og inokulert med 1,5 g ferskvekt av 18-daggamle cellesuspensjonskulturer. Disse Erlenmeyer-kolbene ble inkubert på en roterende rister (110 rpm) ved 25°C i mørke.

Eksperiment med osmotisk stress

For å undersøke effekten av initial sukrosekonsentrasjon påcellevekst og PeGs-akkumulering,Cistanche deserticolasuspensjonskulturer ble dyrket i MS-medium med 87,6,175,3 og 262,9 mM sukrose. For osmotiske stresstilstander,Cistanche deserticolasuspensjonskulturer ble inkubert i MSmedium inneholdende 87,6 mM sukrose kombinert med164,7 mM mannitol. Andre osmotiske midler (PEG 4,000 ogNaCl) ble tilsatt i ekvivalenten til osmolariteten av87,6 mM sukrose. De osmotiske ekvivalentkonsentrasjoneneav osmotiske midler ble eksperimentelt bestemt som PEG4,000 på henholdsvis 20 mM og NaCl på 50 mM. Trippelkolber ble brukt i alle eksperimenter og alle verdiervar middelene for tredobbelte kolber ± SD.

Analyse

Cistanche deserticoladyrkede celler under forskjellige osmotisk stress ble observert med Nikon AFX-DX lysmikroskop (Nikon, Japan) under 400· forstørrelser. Osmolariteten til kulturmediet ble målt med et damptrykkosmometer (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA). For fastsettelse av fersk vekt (FW) erCistanche deserticolacellene ble forsiktig presset på filterpapir for å fjerne overflødig vann og veid. Deretter ble cellene tørket i en ovn ved 60C i 24 timer og tørrvekten (DW) ble registrert. Restsukkerkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av fenol og konsentrert svovelsyre, ved bruk av glukose som standard (Dubois et al. 1956).

PeGs ble ekstrahert fra de tørkede cellene med metanol i 15 minutter ved 60C i et ultralydvannbad (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, Kina) med en frekvens på 40 kHz og en effekt på 100 W. Filtratet ble konsentrert og resten oppløst i destillert vann og deretter ført gjennom en makroretikulær harpikskolonne (AB-8, kjemisk produkt fra Nankai University, Tianjin, Kina). Metanoleluatet ble samlet og det totale PeGs-innholdet ble analysert ved 333 nm ved å bruke echinacosid som standard (Du og Liu 1993a; Du et al. 1993b).

Cellelevedyktighet ble estimert ved reduksjon av 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) (Steponkus og Lanphear 1967). Levedyktighetsindeksen er definert som absorbansen målt per gram ferskt vev. Bestemmelsen av PAL-aktivitet var basert på metoden til Koukol og Conn (1961). Én enhet av PAL-aktiviteten (U) er definert som mengden absorbansvariasjon på 0.01.

Resultater og diskusjon

Effekt av initial sukrosekonsentrasjon på cellevekst og PeGs biosyntese i cellesuspensjonskulturer avCistanche deserticola.Responsen tilCistanche deserticolacellesuspensjonskulturer til initial sukrosekonsentrasjon mellom 87,6 og 262,9 mM ble testet. Som vist i fig. 1, vokste cellene og akkumulerte PeGs raskt ved en lav initial sukrosekonsentrasjon på 87,6 mm, og celleveksten og PeGs-akkumulering ble tydeligvis undertrykt ved en høy initial sukrosekonsentrasjon på 262,9 mM. Forholdet mellom ferskvekt og tørrvekt ble redusert når initial sukrosekonsentrasjon økte fra 87,6 fra 262,9 mM (data ikke vist). Maksimal tørrvekt på 15,9 gl–1 og PeGs-innhold på 20,7 mg g–1-DW ble oppnådd på dag 30 ved en initial sukrosekonsentrasjon på 175,3 mM, hvorav osmolariteten var omtrent 300 mOsm kg–1. Under mikroskopisk observasjon ble celleveggene separert fra deres cytoplasma ved det høyeste osmotiske stresset på 388 mOsm kg–1 der en initial sukrosekonsentrasjon var 262,9 mM (fig. 2), og det høyeste osmotiske stresset kan forstyrre metabolismen til cellene og resultere i alvorlig vekstundertrykkelse og nedgang i PeGs biosyntese. Et lignende fenomen ble også observert i suspensjonskulturer av T. Chinensis suspensjonscellekulturer, og den optimale sukrosekonsentrasjonen for paklitakselproduksjon var 175,3 mM (Kim et al. 2001). Imidlertid var en initial sukrosekonsentrasjon på 204,5 mM fordelaktig for veksten av cellekulturer av E. sessiliflorus. En høyere sukrosekonsentrasjon på 262,9 mM forbedret biosyntesen av eleutherosider, fenol og flavonoider i Eleutherococcus-kulturene (Shohael et al. 2006). Det er klart at den initiale sukrosekonsentrasjonen er viktig for veksten og sekundære metabolitters akkumulering av plantecellekulturer, og dens effekt er relatert til en spesifikk cellelinje.

Effekt av forskjellige osmotiske midler på cellevekst og PeGs-biosyntese i cellesuspensjonskulturer av C. deserticola

For å forstå den osmotiske rollen til metabolsk sukrose og andre ikke-metabolske kjemiske substrater på PeGs biosyntese i cellesuspensjonskulturer avCistanche deserticola, ble en serie eksperimenter utført ved bruk av sukrose kombinert med de ikke-metabolske osmotiske midlene (mannitol, PEG og NaCl). I disse eksperimentene ble 164,7 mM mannitol, 20 mM PEG og 50 mM NaCl tilsatt til mediet som inneholdt 87,6 mM sukrose og ga den innledende osmolariteten rundt 300 mOsm kg–1, som var en ekvivalent osmotisk tilstand som var sammenlignbar med mediet med 175,3 mM sukrose.

Som vist i fig. 3a, b, hemmet tilsetning av mannitol (ikke-metabolsk sukkerosmotisk middel) og PEG (ikke-permeabelt osmotisk middel) celleveksthastigheten litt, men forbedret PeGs-biosyntesen betydelig iCistanche deserticolacellesuspensjonskulturer. Det maksimale PeGs-innholdet på henholdsvis 26,9 og 23,8 mg g–1-DW ble oppnådd på dag 21 da cellene ble dyrket i kombinasjoner av 87,6 mM sukrose med enten 164,7 mM mannitol (303 mOsm kg–1) eller 20 mM PEG (299 mOsm kg–1). PeGs-beløpene var høyere enn forCistanche deserticolacellekulturer dyrket i MS flytende medium med en initial sukrosekonsentrasjon på 175,3 mM på dag 30. Sukker ble konsumert gradvis i løpet avCistanche deserticolacellekultur, og deretter falt det sukkerinduserte osmotiske stresset tilsvarende (fig. 3c, d). Osmotisk stress av det flytende mediet med en initial sukrosekonsentrasjon på 175,3 mM falt fra 280 til 110 mOsm kg–1 da PeGs i cellekulturene begynte å samle seg på dag 9 og nådde sitt maksimum på dag 30 (data ikke vist). Ikke-metabolske osmotiske midler (mannitol og PEG) ble ikke konsumert i løpet av cellekulturen, noe som gjør at osmotisk stress av flytende medium kan opprettholdes mellom 200 og 280 mOsm kg–1, et osmotisk trykk som er gunstig for PeGs biosyntese. Disse resultatene viste at osmotisk stress i seg selv spilte en viktig rolle i forbedringen av PeGs biosyntese iCistanche deserticolacellekulturer.

Tilsetning av NaCl ble rapportert å forbedre henholdsvis indolalkaloider og saponinbiosyntese i cellekulturer av Catharanthus roseus og Panax ginseng (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), men behandlingen av NaCl undertrykte celleveksten til T. Chinensis mens den ikke viser noen forskjell i palitaksel-biosyntese (Kim et al. 2001). Derfor er det nødvendig med en detaljert undersøkelse for hver sak. Tilsetningen av en osmotisk ekvivalent av 50 mM NaCl undertrykte cellevekst og PeGs-biosyntese. Dette resultatet kan skyldes den permeable naturen til NaCl som ikke er gunstig for cellekulturene til denne ørkenplantearten som kan tolerere tørkestress veldig godt.

Fig. 3 Effekt av kombinasjonene av sukrose og andre ikke-metabolske osmotiske midler på cellevekst (a), PeGs-akkumulering (b), sukkerforbruk (c) og osmotisk stressendring (d) i løpet av C. deserticola-cellen kultur. Verdier er middel for triplikatflasker ± SD

Effekt av forskjellige osmotiske midler på cellelevedyktighet og PAL-aktivitet i cellesuspensjonskulturer av Cistanche deserticola

I våre tidligere studier (Cheng et al. 2005b, 2006) stimulerte elicitortilsetning dramatisk PeGs biosyntese iCistanche deserticolacellekulturer, og stimuleringen var korrelert med økt aktivitet av PAL, det første nøkkelenzymet i PeGs biosyntese (Hahlbrock og Grisebach 1979). Som vist i fig. 4, reduserte tilsetningen av ikke-metabolsk 164,7 mM mannitol eller 20 mM PEG i MS flytende medium inneholdende 87,6 mM sukrose cellelevedyktigheten noe, men betydelig forbedret PAL-aktiviteten som var høyere enn den som ble indusert av en initial sukrosekonsentrasjon på 175,3 mM. Den forbedrede PeG-akkumuleringen iCistanche deserticolacellesuspensjonskulturer var relatert til økningen av PAL-aktivitet stimulert av selve osmotisk stress. En initial sukrosekonsentrasjon på 175,3 mM i MS flytende medium forårsaket en reduksjon i cellelevedyktighet på 15 dager og hemmet PAL-aktivitet på 21 dager. Etter en periode med sukkerforbruk av voksendeCistanche deserticolacellekulturer, økte både cellelevedyktighet og PAL-aktivitet til de dyrkede cellene og nådde sitt maksimum på henholdsvis dag 24 og dag 30. Forbedret PAL-aktivitet ved osmotisk stress ble også observert for å forbedre saponinbiosyntesen i P. ginseng cellekulturer og alkaloidakkumulering i C. roseus dyrkede celler (Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). Imidlertid reduserte tilsetningen av permeabel NaCl i MS flytende medium inneholdende 87,6 mM sukrose cellelevedyktighet og hemmet PAL-aktivitet under hele kulturperioden. Som et resultat ble både cellevekst og PeGs biosyntese åpenbart undertrykt.

Fig. 4 Variasjon av cellelevedyktighet (a) og PAL-aktivitet (b) i C. deserticola-cellekulturer under ulikt osmotisk stress i løpet avCistanche deserticolacellekultur. Verdier er middel for triplikatflasker ± SD

Cistanche deserticolaer en ørkenart og undersøkelse av en ørkenart in vitro cellekulturer ga nye utfordringer og muligheter for å forstå plantefysiologi og økologiske tilpasninger. I denne studien utviklet vi et system med potensial til å studere en osmotisk stressmediert signaltransduksjonsbiosyntesevei, og systemet ga grunnlaget for storskala produksjon av PeGs ved hjelp avCistanche deserticolacellekulturer gjennom en ny osmotisk stressregulert strategi.

Anerkjennelser

Forfatterne anerkjenner den økonomiske støtten fra innovasjonsforskningsprogrammet til det kinesiske vitenskapsakademiet.

Fra: 'Forbedring av phenylethanoid glykosider biosyntese i cellekulturer av Cistanche deserticola ved osmotisk stress' av Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

---Plant Cell Rep (2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3

Referanser

Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolacellesuspensjonskulturer: Fenylethanoid glykosider biosyntese og antioksidantaktivitet. Process Biochem 40:3119-3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Gjentatt fremkalling øker akkumulering av fenyletanoidglykosider i cellesuspensjonskulturer avCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Forbedring av phenylethanoid glykosider biosyntese i Cistanche deserticola cellesuspensjon kulturer av kitosan elicitor. J Biotech 121:253-260
Du NS, Liu JL (1993a) Bestemmelse av fenyletanoidglykosider iCistanche deserticolaved makroretikulær harpiksspektrofotometri. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Isolering og identifikasjon av fenyletanoidglykosider fraCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Kolorimetriske metoder for bestemmelse av sukker og relaterte stoffer. Anal Chem 28:350-357

Godoy-Hernandez GC, Vazquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) Eksponeringen for transkanelsyre av osmotisk stressede Catharanthus roseus-celler dyrket i en 14-l bioreaktor øker alkaloidakkumulering. Biotechnol Lett 22:921–925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Enzymiske kontroller i biosyntesen av ligin og flavonoider. Ann Rev Plant Physiol 30:105–130
Kim SI, Choi HK, Kim JH (2001) Effekt av osmotisk trykk på paklitakselproduksjon i suspensjonscellekulturer av Taxus Chinensis. Enzyme Microb Tech 28:202–209
Koukol J, Conn EE (1961) Metabolismen av aromatiske og egenskapene til fenylalanindeaminasen til Hordeum vulgare. J Biol Chem. 236:2692-2698
Lu MC (1998) Studier om beroligende effekt avCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59:161–165

Lu CT, Mei XG (2003) Forbedring av produksjon av fenyletanoidglykosider av en soppfremkaller i cellesuspensjonskultur avCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437–1439
Murashige T, Skoog F (1962) Et revidert medium for rask vekst og bioassays med tobakksvevskulturer. Plant Physiol 15:473–497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Effekten av sjeldne jordartselementer på veksten avCistanche deserticolaceller og produksjon av fenyletanoidglykosider. J Biotechnol 102:129-134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Forbedring av eleutherosideproduksjon i embryogene kulturer av Eleutherococcus sessiliflorus som svar på sukroseindusert osmotisk stress. Process Biochem 41:512-518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Bruken av organiske og uorganiske forbindelser for å øke akkumuleringen av indolalkaloider i Catharanthus roseus (L.) Don cellesuspensjonskulturer. J Exp Bot 38:1507–1511
Steponkus PL, Lanphear FO (1967) Forfining av trifenyltetrazoliumkloridmetoden for å bestemme kuldeskade. Plant Physiol 42:1423–1426 Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Betydelig forbedring av taxanproduksjon i suspensjonskulturer av Taxus Chinensis ved sukrosematingsstrategi. Process Biochem 35:479-483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Rensende effekt av glykosider avCistanche deserticolapå frie radikaler og dets beskyttelse mot OH-indusert DNA-skade in vitro. Chin Pharm J 36:29–31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Forbedring av saponinproduksjon i Panax ginseng cellekultur ved osmotisk stress og næringsmating. Enzyme Microb Technol 36:133–138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Effekt av osmotisk trykk på cellevekst og produksjon av ginsengsaponin og polysakkarid i suspensjonskulturer av Panax Notoginseng. Biotechnol Lett 17:1347–1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) Sammenligninger mellomCistanche deserticolaYC Ma og Cistanche tubulosa (Scheak) har noen farmakologiske aktiviteter. Tradit Chin Med J 21:436–438