Evaluering av tarmtransporten av et fenyletanoid-glykosidrikt ekstrakt fra Cistanche Deserticola over Caco-2-cellemonolagsmodellen

Introduksjon

Caco-2-cellelinjen, som ble avledet fra humane kolonadenokarsinomer, viser enterocyttlignende egenskaper. Under normale forhold skiller Caco-2-celler seg spontant fra modne celler og danner intakte monolag. De tilstøtende cellene fester seg via tette koblinger dannet på den apikale siden av monolaget, som kan diskriminere passivtog aktivt transporterte medikamenter over epitellaget. På grunn av den morfologiske og biokjemiske likheten med normale enterocytter, fungerer Caco-2-cellemonolag som en godt akseptert in vitro-modell for studiet av det intestinale absorpsjonspotensialet og transportegenskapene til legemidler.

I motsetning til kjemikalier er planteekstrakter (PE) blandinger hvis biologiske aktivitet og aktive bestanddeler ofte ikke er godt identifisert. Dessuten er tarmtransportegenskapene til PE, i motsetning til egenskapene til dets bestanddeler, nært knyttet til klinisk bruk. Fluksmålinger for en testprøve på tvers av et Caco-2-cellemonolag involverer vanligvis kjemiske metoder, som HPLC, LC/MS, osv. Selv om disse metodene er kraftige verktøy, er de komplekse, tidkrevende, dyre og noen ganger krever sofistikert utstyr. Enda viktigere, verken en enkelt eller en minoritetskomponent kan reflektere PE som helhet. En ny tilnærming uavhengig av bestemmelsen av bestanddeler må derfor etableres for å identifisere og evaluere transportegenskapene til PE.

Cistanche deserticola YC Ma (CD), en holoparasitisk plante, er en vanlig tradisjonell kinesisk medisin som hovedsakelig brukes til å behandle nyremangel, kroppssvakhet og forstoppelse, og disse bruksområdene er offisielt registrert i den kinesiske farmakopéen.Fenyletanoidglykosider (PhGs), inkludert echinacosid (EC), acteosid (AC) og isoacteosid (IS), etc., er en klasse av polyfenoliske forbindelser. De regnes som en av de viktigste bioaktive bestanddelene i Cistanche-arter. Farmakologiske studier har vist at bioaktiviteten til PhG er mangfoldig og inkluderer antioksidative, anti-tretthets-, leverbeskyttende, immunmodulerende, anti-inflammatoriske og nevrobeskyttende effekter. Imidlertid har ikke tarmtransportegenskapene til PhG-er blitt undersøkt. I denne studien utforsket vi tarmpermeabiliteten til et PhG-rikt ekstrakt (PRE) fra CD som et integrert system og permeabiliteten til tre hoved PhG (AC, IS og EC) i differensierte Caco-2-celler. Resultatene våre indikerte at PRE primært transporteres via dårlig absorbert passiv diffusjon ned en konsentrasjonsgradient uten utstrømning, noe som gir det farmakokinetiske grunnlaget for den kliniske anvendelsen av PhGs i CD.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materialer og metoder

Materialer

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS, and EC (>98 %) ble kjøpt fra Must Biotechnology Co. (Chengdu, Kina). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS) og ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) ble produsert av Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). 6-brønn TranswellTM-plater (innsettingsmembranvekstareal 4,67 cm2) ble oppnådd fra Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Rottehale-kollagen ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle reagenser og kjemikalier for HPLC-analysen var av analytisk kvalitet.

Utarbeidelse av PRE fra CD

Det lufttørkede CD-materialet ble pulverisert og ekstrahert ved perkolering med 70 % etanol. Den PhG-rike fraksjonen ble fremstilt som tidligere beskrevet og ekstrahert med vannmettet n-butylalkohol. Ekstraktvæsken ble konsentrert og tørket under redusert trykk. Makroporøs harpiks-UV-spektrofotometri målte et PhG-innhold på 78,4 %. Den endelige prøven representerte et utbytte på 1,75 % av råstoffet i tørrvekt. Den oppnådde prøven ble lagret ved -20 grader inntil videre bruk.

Bestemmelse av AC, IS og EC ved HPLC

Et Shimadzu HPLC-system utstyrt med LC-løsningsprogramvare ble brukt til å analysere innholdet av AC, IS og EC i PRE. En omvendt fase Intersil C18-kolonne (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) ble brukt og holdt ved romtemperatur. De mobile fasene var acetonitril og vann inneholdende 0,1 % fosforsyre (v/v) med gradienteluering (tabell 1) ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min. UV-spektrofotometerdetektoren ble satt til 334 nm. For nøyaktig å bestemme fluksen av AC og IS, utviklet vi en ny HPLC-fluorescensdeteksjonsmetode (HPLC-FLD). Etter en strukturell analyse og fluorescensbølgelengdeskanning (data ikke vist), oppnådde vi de optimale fluorescensdeteksjonsforholdene for AC (eks: 338 nm, Em: 448 nm) og IS (eks: 320 nm, Em: 434 nm).

HPLC-analysemetoden ble validert ved å bruke følgende ytelsesegenskaper: stabilitet, linearitet, sensitivitet, presisjon (intra- og mellomdagers variasjon) og nøyaktighet. Analyttene i transportbufferen ble lagret ved 25 grader i mørket i 24 timer, og deres stabilitet ble målt. Analyttene var svært stabile i nærvær av vitamin C (0,4 %) fordi de relative standardavviksverdiene (RSD) i toppområdene var < 3,5 %. Den lineære regresjonsligningen, korrelasjonskoeffisienten, linearitetsområde, LOD og LOQ for AC, IS og EC er vist i tabell 2. LOD-ene (18–30 nM) og LOQ-ene (60–100 nM) verdier illustrerer at HPLC-FLD- og HPLC-UV-metodene er svært sensitive. RSD-verdiene som uttrykker nøyaktigheten til metoden var alle < 2 % for intra- og inter-dag variabilitet, noe som indikerer god presisjon. For utvinningsevaluering ble AC, IS og EC tilsatt til transportbufferen for å gi tre (høye, middels og lave) konsentrasjonsnivåer. Gjenvinningsverdiene for metoden for analyttene er oppsummert i tabell 3. Gjennomsnittlig gjenvinning varierte fra 90,0 % til 96,4 %, noe som indikerer god nøyaktighet. Konklusjonen er at de etablerte HPLC-metodene er tilfredsstillende når det gjelder linearitet, følsomhet, presisjon og nøyaktighet for kvantifisering av AC, IS og EC i transportbuffer.

Bestemmelse av PRE ved bioassaysystem

Bioanalysen (total antioksidativ kapasitet) var basert på FRAP-analysen (ferric reducing/antioxidant power) som vi tidligere har beskrevet [16] og validert når det gjelder linearitet og presisjon (intra- og inter-dagers variasjon). Lineariteten til bioanalysemetoden ble bestemt basert på kalibreringskurvene. Konsentrasjonsområdet for linearitet var 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x+0.0968, R2=0.996). Presisjonen til den etablerte bioassaymetoden ble bestemt i form av intra- og inter-dag-variabiliteten for en analyse av PRE (10,0 ug/ml). Metodens repeterbarhet i løpet av dagen ble bestemt basert på fem påfølgende bestemmelser på samme dag. Repeterbarheten mellom dager ble målt basert på fem påfølgende bestemmelser på tre forskjellige dager. RSD-verdiene for presisjonen til metoden var 1,014 % og 4,72 % for henholdsvis intra- og mellomdagsvariabilitet, noe som indikerer god presisjon. Dermed er den etablerte bioanalysemetoden tilfredsstillende med hensyn til linearitet, presisjon og nøyaktighet for kvantifisering av PRE i en transportbuffer.

Cellekultur

Caco{{0}}-celler ble dyrket ved 37 grader og 95 % relativ fuktighet i en atmosfære som inneholdt 5 % CO2 og et medium bestående av DMEM, 10 % FBS, 1 % NEAA, 1 % L-glutamin, penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 ug/ml). Mediet ble skiftet annenhver dag under cellevekst og differensiering. Cellene ble dyrket i 75-cm2 plastflasker og høstet hver 3.–5. dag med 0,05 % EDTA-trypsin. For transporteksperimentene ble cellene sådd med en tetthet på 1×105 celler/cm2 på Transwell-innlegg belagt med kollagen. Omtrent 21 dager etter såing ble monolagene brukt til transportforsøkene. Deres integritet ble bestemt ved å måle den transepiteliale elektriske motstanden (TEER) over monolagene med en EVOM utstyrt med ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). TEER-verdiene til Caco-2-cellemonolaget måtte overstige 500 O∙cm2.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR BEREGENDE OG AVFØRENDE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Transportforsøk

Monolaget ble vasket med transportbuffer (P-buffer inneholdende 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM glukose, 3 mM CaCl2 og 145 mM NaCl, pH 7,4) og deretter pre-inkubert i 20 min. ved 37 grader. Etter fjerning av transportbufferen ble frisk transportbuffer inneholdende testprøver tilsatt til det apikale (AP) kammeret (1,5 ml) i AP til basolaterale (BL) retningsstudier eller BL-kammeret (2,5 ml) i BL til AP retningsstudier. For AC-, IS- og EC-analyser ved bruk av HPLC ble en alikvot (300 ul) fjernet fra hvert mottakerkammer ved forskjellige tidsintervaller (30, 60, 90 og 120 minutter). Mottakerkammeret ble etterfylt med samme volum av fersk forvarmet (37 grader) transportbuffer etter hver prøvetaking. De innsamlede prøvene ble lagret ved -20 grader for videre bruk. For PRE-bestemmelse ved bruk av bioassay ble bare prøvene tatt etter 120 min. På grunn av ustabiliteten til PRE, AC, IS og EC, ble 0,4 % (vekt/volum) vitamin C tilsatt for å stabilisere prøvene for å bestemme AC-, IS- og EC-innhold ved HPLC, og prøvene for PRE-bioanalysen ble analysert umiddelbart etter prøvetaking. Den tilsynelatende permeabilitetskoeffisienten (Papp eller 'Papp) verdi for hver prøve ble beregnet.

Dataanalyse

Papp-verdiene i AP BL- eller BLAP-retningene til AC, IS og EC ble beregnet basert på følgende ligning: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0), hvor Papp er den tilsynelatende permeabilitetskoeffisienten (cm/s) bestemt ved HPLC. (4Q/4t) er hastigheten for utseendet til testforbindelsen (AC, IS eller EC) på mottakersiden (μmol/s); A er overflatearealet til innsatsen (cm2); C0 er den initiale testforbindelseskonsentrasjonen på donorsiden (μmol/ml). Nærmere bestemt ble masseenheten "ug" brukt i stedet for "μmol" når 'Papp-verdiene ble beregnet. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.

Resultater

Sammensetning av AC, IS og EC i PRE fra CD

Fordi AC, IS og EC regnes som de viktigste bioaktivePhGs av Cistanche-arter, analyserte vi innholdet i PRE via HPLC-UV. Det representative kromatogrammet er vist i fig. 1. Identifikasjonen av disse bestanddelene var basert på å sammenligne retensjonstidene og UV-spekteret med de for autentiske standarder ved en bølgelengde på 334 nm. Innholdet av AC, IS og EC i PRE var henholdsvis 26,60 %, 1,84 % og 32,83 %. Disse tre forbindelsene utgjør således 61,27 % av PRE; videre indikerer resultatene ovenfor at PhG-innholdet i PRE er 78,4 %. Derfor står AC, IS og EC for omtrent 80% av PhGs i PRE.

Total antioksidativ kapasitet til PRE, AC, IS og EC

Studier avantioksidativ aktivitet av PhGsfra CD er rapportert, og AC, IS og EC står for omtrent 80 % av PhGs i PRE. Dermed ble den totale antioksidative kapasiteten til PRE, AC, IS og EC analysert og uttrykt ved å bruke FRAP-verdiene (× 10–6 mmol). Som vist i fig. 2, når FRAP-verdien var 8 × 10–6 mmol, var sluttkonsentrasjonene av PRE, AC, IS og EC 6,20 ug/ml, 3,14 ug/ml, 22,92 ug/ml og 4,89 ug /ml, henholdsvis, noe som indikerer at den totale antioksidative kapasiteten til disse fire prøvene rangerte som følger: AC > EC > PRE > IS. Bioaktiviteten til PRE tilskrives dens aktive ingrediensgrupper (AIG). For omtrent 60 % av PRE, viste AC og EC sterkere total antioksidativ aktivitet enn PRE og IS. Fordi IS (1,84 %) utgjør en svært liten brøkdel av PRE, er andre komponenter, som den svakt antioksidative IS, også tydelig aktive i PRE. Overraskende nok skilte den totale antioksidative aktiviteten seg nesten 7- ganger mellom AC og dens isomer IS, noe som indikerer at ikke bare antall fenoliske hydroksylgrupper, men også plasseringen av fenoliske hydroksylgrupper i molekylet påvirket den antioksidative effekten .

Validering av Caco-2 monolagene

For å validere Caco-2 celle monolagsystemet ble Papp-verdiene for propranolol (en godt transportert markør) og Lucifer gul (en dårlig transportert markør) fra AP til BL over Caco-2 monolagene. bestemt til henholdsvis 1,51 × 10–5 cm/s og 2,8 × 10–7 cm/s, og disse verdiene stemte overens med de som ble publisert i tidligere rapporter. Analysen av alkalisk fosfataseaktivitet bekreftet også at Caco-2-cellemonolagene var kvalitativt sammenlignbare med tynntarmsepitelet.

Permeabiliteten til AC, IS og EC

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 cm/s), mens de for dårlig absorberte legemidler var lave (< 1.0 × 10–6 cm/s) [3]. As shown in Table 4, the Papp values of AC, IS, and EC were nearly on the order of 10–7 cm/s, indicating that these compounds were poorly permeable. Furthermore, efflux or active transport was not observed because the ratios of Papp BL to AP / Papp AP to BL for AC, IS, and EC were between 0.90 ~ 1.55, and the criterion of net efflux proposed by the FDA Guidance is a ratio less than 2. Based on the kinetic curves presented in Fig. 3, the bidirectional transport percentages of AC, IS, and EC at 200 μM increased linearly with time. The transport rate (TR) values of the three compounds increased linearly in both directions between approximately 100 and 300 μM (Fig. 4). These results indicate that the main transport mechanism of AC, IS, and EC is also passive diffusion. 

Permeabiliteten til PRE

Resultatene ovenfor indikerer at den totale antioksidative kapasiteten til PRE i det minste skyldes 61,27 % av AIG fra PRE. Dermed evaluerte vi TR-en til PRE basert på dens konsentrasjon-effektkurve for total antioksidativ kapasitet og beregnet 'Papp-verdiene for å gjenspeile transportegenskapene til PRE. 'Papp-verdiene til PRE for AP!BL og BL!AP var (2,16 ± 0,26) × 10–7 cm/s og (3,13 ± 0,29) × 10–7 cm/ s, henholdsvis indikerer at denne forbindelsen var dårlig permeabel. Videre var utstrømning eller aktiv transport ikke tydelig fordi forholdet mellom 'Papp BL til AP / 'Papp AP til BL for PRE var 1,45. Dessuten økte den toveis TR av PRE lineært mellom ca. 300 og 900 ug/ml (fig. 5). Mangelen på retningspreferanser til resultatene antyder at passiv diffusjon er hovedtransportmekanismen til PRE.

NATURLIG CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV IMMUNITET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskusjon

Sammenlignet med høyt rensede legemiddelprodukter er PE generelt blandinger som består av hundrevis av bestanddeler med vidt forskjellige fysiokjemiske egenskaper. Derfor utøver PE systematisk, multitarget og flerkanals synergistisk handling på grunn av deres komplekse AIG [21], som hindrer analysen av transportegenskapene til PE. For å evaluere transportegenskapene til PE mer vitenskapelig, har noen forskere identifisert flere komponenter, i stedet for en enkelt komponent, i PE [22–24]. Likevel kan ikke et begrenset antall bestanddeler reflektere PE som helhet. Imidlertid er det umulig å bestemme alle komponenter i PE. Videre, hvis ulike komponenter i PE viser helt forskjellige transportegenskaper, vil de helhetlige transportegenskapene til PE være vanskelig å identifisere.

På 1990-tallet ble bioassaysystemer brukt for å evaluere TR av antimikrobielle midler [25]. I 2005 hadde Eguchi og hans kolleger [26] evaluert den antioksidative aktiviteten til gulrotekstrakt ved å bruke BL-medier fra differensierte Caco-2-celler; denne tilnærmingen er mer passende for å reflektere in vivo-situasjoner.

Basert på en tidligere rapport om aktiviteten til PhG og våre resultater (fig. 2), kan TR av AIG i PRE evalueres ved å bestemme den totale antioksidative kapasiteten til mediet i mottakerkammeret. Etter transporteksperimentene fant vi at TR for PRE var lik i begge retninger, og denne transporten var umettet og dårlig absorbert ('Papp < ​​1.0 × 10–6 cm/s), og det gjorde den ikke indikerer efflux, noe som tyder på at passiv diffusjon ned en konsentrasjonsgradient er hovedtransportmekanismen til PRE (fig. 5). Videre er transportkarakteristikkene til PRE konsistente med de til AC, IS og EC, de effektive komponentene som viser antioksidativ aktivitet i PRE (fig. 4 og tabell 4). Dette resultatet var forventet og indikerte at det nåværende bioanalysesystemet er passende og pålitelig for evaluering av transportegenskapene til AIG i PRE i differensierte Caco{10}}-celler.

I motsetning til den kanoniske Papp-verdien, som vanligvis brukes for å reflektere transporten av en enkelt forbindelse, kan 'Papp-verdien oppnådd fra TR basert på konsentrasjon-effektkurven ikke bare gjenspeile komponentene som penetrerer monolag med en intakt struktur, men involverer også andre faktorer relatert til målaktiviteten, slik som komponentenes metabolitter, kjemisk nedbrutt produkter, og til og med noen cytokiner som skilles ut fra Caco-2-celler som respons på stimulering som kan påvirke målbioaktiviteten. Multifaktoren nevnt ovenfor, i stedet for bare de transporterte intakte komponentene, bestemmer dermed 'Papp-verdien. Derfor kan 'Papp korrelere sterkere med in vivo-situasjoner enn den kanoniske Papp-verdien. I denne studien klargjorde vi den passivt diffuse og dårlig absorberte naturen til PRE basert på dens 'Papp-verdi, og denne arten kan være relatert til den høye dosen og den lange kliniske behandlingsperioden av CD. Ikke desto mindre vil disse funnene gi mer systematisk veiledning for klinikere i bruken av CD når bare transportkarakteristikkene til de fleste AIG i CD, ikke bare PhGs, er identifisert.

Imidlertid må det valgte bioaktivitetselementet være tilstrekkelig følsomt til å bli oppdaget i mediet til mottakerkammeret, noe som utgjør en utfordring for etableringen av et bioassaysystem for å evaluere transportegenskapene til PE. Videre bør bioaktiviteten også avhenge av så mange komponenter som mulig. I vår studie var den totale antioksidative kapasitetsanalysen mer passende enn flere andre metoder (S1 Fig.). Men likevel kan vår analyse bare oppdage TR av PRE ved 120 min.

Samlet etablerte denne studien et nytt bioassaysystem for å evaluere tarmpermeabiliteten til PRE i differensierte Caco-2-celler. De oppnådde resultatene viste at en dårlig absorbert passiv diffusjon ned en konsentrasjonsgradient uten utstrømning er hovedtransportmekanismen til PRE (fig. 5), som gir det farmakokinetiske grunnlaget for den kliniske anvendelsen av PhGs i CD. Det er mulig å bruke et nytt bioassay-system for å evaluere TR og dermed beregne 'Papp-verdiene for å vurdere tarmtransportegenskapene til AIG i PE. Denne tilnærmingen kan også være egnet for annen PE gitt passende bioaktivitet.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR FORBEDRING AV SEKSUELL FUNKSJON PHGS75% ECH 30% ACT 12%