Ekspresjon av immunoglobulin G i humane proksimale tubulære epitelceller

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

ZHENLING DENG et al

Abstrakt. Proksimaltrørformetepitelceller (PTEC-er) har medfødte immunegenskaper og produserer proinflammatoriske faktorer, kjemokiner og komplementkomponenter som driver epitel-mesenkymal overgang (EMT). Våre tidligere studier avslørte at humane mesangiale celler og podocytter var i stand til å syntetisere og utskille henholdsvis immunglobulin (Ig)A og IgG. Målet med denne studien var å evaluere uttrykket av Igs i PTEC. For det første ble IgG påvist i cytoplasmaet, cellemembranen og lumenet tilPTEC-eri normal nyrebark vedimmunhistokjemi. For det andre ble Ig-gentranskripsjon og V(D)J-rekombinasjon påvist i enkle PTEC-er ved nestet PCR og Sanger-sekvensering. For det tredje ble Ig , Igκ og Igλ tydelig påvist i en udødeliggjort PTEC-linje (HK-2) ved immunfarging og western blotting, der RP215 (et antistoff som hovedsakelig binder seg til ikke-B-celle-avledet IgG) ble brukt. I tillegg ble Ig-, Igκ- og Igλ-gentranskripter, konservativ V(D)J-rekombinasjon i den variable Ig-regionen, rekombinasjonsaktiverende gen 1/2 og aktiveringsindusert cytidindeaminase alle påvist i HK-2-celler. Disse dataene antydet at PTEC-er kan uttrykke IgG på en lignende måte som B-celler. Videre ble IgG-ekspresjon oppregulert av TGF-1 og kan være involvert i EMT.

Nøkkelord:proksimaltrørformetepitelceller, enkeltcelle, HK-2, IgG, epitel-mesenkymal overgang

Cistanche tubulosa forhindrer nyresykdom, klikk her for å få prøven

Introduksjon

Proksimaltrørformetepitelceller (PTEC-er) er den mest tallrike celletypen inyreog har en viktig rolle i nyrereparasjon og/eller progresjon av kroniske nyresykdommer. PTEC-er utøver immunologiske funksjoner ved å uttrykke flere Toll-lignende reseptorer (TLR), slik som TLR 1, 2, 3, 4 og 9 (1,2), og molekyler assosiert med antigenpresenterende cellefunksjon, inkludert MHCII, CD74, CD80 , og CD86 (3). Disse medfødte immunegenskapene til PTEC-er gjør dem i stand til å fungere som immunresponderer på et bredt spekter av stimuli, med påfølgende produksjon og frigjøring av bioaktive mediatorer, inkludert proinflammatoriske cytokiner, kjemokiner og komplementkomponenter, som driver interstitiell betennelse og fibrose (4). PTEC-er uttrykker også neonatale Fc-reseptorer og bevarer kapasiteten til spesifikk pH-avhengig binding og transcytose av immunglobulin (Ig)G (5). Så vidt vi vet er det imidlertid ukjent om PTEC-er uttrykker Igs.

Det ble tidligere antatt at Igs produseres utelukkende av modne B-celler og plasmaceller, og at Igs fungerer som antistoffer for å gjenkjenne og nøytralisere forskjellige patogener. Imidlertid har denne teorien blitt utfordret de siste tiårene, ettersom økende bevis har rapportert at Ig, inkludert IgA, IgG og IgM, kan produseres og skilles ut av ikke-B-celler, som humane epitelkreftceller (6,7) og normale ikke-B-celler (8,9), så vel som på immunprivilegerte steder, som øynene (10), sentrale nevroner (11,12), placenta (13) og testiklene og bitestiklene (14)

I likhet med B-celle-avledede Ig'er (B-Ig'er), er ikke-B-Ig også produktene av Ig-gentranskripsjon og -omorganisering og viser klassiske V(D)J-rekombinasjonsmønstre med nukleotidaddisjon ved overgangene og somatiske hypermutasjoner (7, 11,14). I motsetning til B-Ig, viser ikke-B-Ig begrensede V(D)J-rekombinasjonsmønstre og mindre mangfold (7). Funksjonelt utøver ikke-B-Ig ikke bare naturlig antistoffaktivitet i huden og slimhinnen (8), men kan også fungere som vekstfaktorer for å fremme celleproliferasjon og adhesjon, og kan forsterke initiering og metastasering av kreft ved å binde seg til integriner ( 15–17). For eksempel utfører RP215-gjenkjent kreft-IgG sin onkogene funksjon ved å samhandle med integrin-6 4-komplekset og aktivere FAK- og Src-banene (15).

Vår forrige studie viste at mesangiale celler (18) og podocytter (19) kan syntetisere og utskille IgA og IgG, og delta i cellevekst og celleadhesjon in vitro. Denne studien hadde som mål å evaluere ekspresjonsnivåene av Igs i PTEC-er og undersøke dens potensielle rolle i epitel-mesenkymal overgang (EMT).

Effekter av cistanche: fordel nyre

Materialer og metoder

Cellekultur og behandling.En udødeliggjort PTEC-linje HK-2 ble kjøpt fra American Type Culture Collection. HK‑2-celler ble dyrket i DMEM/F12 supplert med 100 U/ml penicillin, 0,1 mg/ml streptomycin (alle Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), og 10 prosent føtalt bovint serum (FBS; Australsk opprinnelse; Biological Industries USA, Inc.) ved 37˚C i en atmosfære som inneholder 95 prosent luft og 5 prosent CO2. For å unngå interferens av Ig i FBS, ble mediet erstattet med et serumfritt medium 24-48 timer før cellehøsting. HK‑2-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (2, 5 og 10 ng/ml) av TGF‑1 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA).

Enkel PTEC-isolasjon og cDNA-syntese.En human nyreprøve av makroskopisk normalt kortikalt vev ble tatt fra en pasient (mann, 31 år) som gjennomgikk nefrektomi som et resultat av nyrekarsinom uten åpenbar nyredysfunksjon. En enkeltcellesuspensjon ble fremstilt ved å fordøye nyrebarken med 1 mg/ml kollagenase I (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ved 37˚C i 20 min. PTEC-er ble sortert ved bruk av phycoerythrin (PE)-konjugert anti-CD10 (kat.nr. 312203) og allofycocyanin (APC)-konjugert anti-CD13 (kat.nr. 301705; begge BioLegend, Inc.) ved sortering av fluorescensceller BD FACSAria II Special Order System) som tidligere beskrevet (20). De tilsvarende isotypekontrollantistoffene (kat. nr. 400111 og 400119; begge BioLegend, Inc.) ble brukt for å utelukke ikke-spesifikk farging. Dobbelt positivt merkede levende celler ble isolert som PTEC-er. En enkelt PTEC ble manuelt valgt under et invertert lysmikroskop ved bruk av en kapillærpipette og ble deretter overført til et 0,2 ml tynnvegget PCR-rør som inneholdt lyseringsbuffer (21). Enkel PTEC RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese ble utført i henhold til tidligere beskrevne metoder(21). Totalt fem enkle PTEC-er ble brukt til å oppdage Ig-gentranskripsjon og omorganisering.

PCR-amplifikasjon.Totalt RNA ble ekstrahert fra HK-2-celler, mononukleære celler fra perifert blod [PBMC-er, isolert fra en 31 år gammel kvinnelig sunn donor ved bruk av Ficoll (kat.nr. 7111011; Dakewe Biotech., Ltd.) ] og nyrebark (fra samme pasient brukt i enkelt PTEC-isolasjon) ved bruk av TRIzol®-reagens (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), og RNA-konsentrasjonen ble vurdert ved bruk av et NanoDrop-spektrofotometer (NanoDrop; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . Deretter ble 2 µg totalt RNA reverstranskribert til cDNA ved hjelp av RevertAid First Strand cDNA Synthesis-settet (kat.nr. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). PCR ble utført ved bruk av primere rettet mot de konstante områdene av Ig, Igκ, Igλ og aktiveringsindusert cytidindeaminase (AID). Nested PCR ble utført for å amplifisere den variable regionen av Ig, lavdensitets lipoproteinreseptor-relatert protein 2 (LRP2), og rekombinasjonsaktiverende gen (RAG)1 og RAG2. PCR-produktene ble separert ved elektroforese på en 1,0 prosent agarosegel og ble visualisert ved bruk av GelRed (kat. nr. 41003; Biotium, Inc.). Primerne til AID, RAG1/2, og de konstante områdene av Ig, Igκ, Igλ brukt i denne studien refererer til primere brukt av Jing et al (19). Primerne til den variable Ig-regionen refererer til primere brukt av van Dongen et al (22). De andre primerne brukt for PCR er oppført i tabell SI. Termosykleringsbetingelsene er oppført i tabell SII.

Sanger-sekvensering og analyser av sekvenseringsdata.PCR-produkter av den variable Ig-regionen oppnådd fra enkeltstående PTEC-er, HK-2-celler og PBMC-er ble henholdsvis klonet inn i et pGEM-T Easy Vector System I (kat.nr. A1360; Promega Corporation), som ble transformert inn i TOP10-kompetente celler (CB104; Tiangen Biotech Co., Ltd.). Kort fortalt ble 5 ul ligeringsprodukter tilsatt til 30 ul TOP10 kompetente celler, inkubert på is i 30 minutter, varmesjokkert ved 42˚C i 90 sekunder og inkubert på is i 5 minutter. Deretter ble 500 µl LB tilsatt og lot stå ved 37˚C i 40 minutter før en del av bakterievæsken ble inokulert på petriskåler belagt med 0,1 mmol/l IPTG og 20 µg/ml X-Gal. Rettene ble snudd ved 37˚C over natten. I alt ble 5-16 hvite kolonier per prøve valgt tilfeldig og sekvensert ved bruk av en ABI 3730XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). De omorganiserte V(D)J-sekvensene ble sammenlignet med de i det grunnleggende søkeverktøyet for lokal justering (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) for å identifisere de best matchende kimlinjegensegmentene og -forbindelsene etter primertrimning .

Western blot-analyse.HK-2-celler ble lysert i TSD-lysebuffer [1 prosent SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM DTT] som inneholdt en proteasehemmercocktail (Applygen Technologies Inc.), sonikert ved isvann i 1 min ( arbeider 5 sekunder og hviler 15 sekunder; 3 ganger) og lyseres i 30 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering ved 12,000 xg i 10 minutter ved 4˚C, ble proteinkonsentrasjonen til cellelysatet bestemt ved bruk av et BCA-sett (Applygen Technologies Inc.). Deretter ble 5X reduserende belastningsbuffer tilsatt til lysatet, kokt ved 100˚C i 10 minutter, og prøvene ble umiddelbart brukt til western blot-analyse. Serum, brukt som en positiv kontroll for Ig, ble isolert fra en frisk donor (samme donor som ble brukt i PBMC) ved sentrifugering ved 2103 xg i 10 minutter ved romtemperatur.

Effekter av cistanche: fordel nyre

Western blotting ble utført i henhold til standardprosedyrer. Kort fortalt ble 3{{40}} µg proteiner separert med SDS-PAGE på 10 prosent geler og ble overført til en nitrocellulosemembran. Deretter ble membranen blokkert i 5 prosent skummet melk ved romtemperatur i 1 time og ble inkubert med primære antistoffer ved 4˚C over natten, inkludert kanin anti-humant Ig (kat.nr. ab109489; 1:1,{{8} }), kanin anti-human Ig 4 (kat.nr. ab109493; 1:1,000), anti-Igκ (kat.nr. ab124727; 1:10,000), anti-Igκ Igλ (kat.nr. ab124719; 1:20,000), kanin-anti-menneskelig aktin (kat.nr. ab8227; 1:2,000) (alle fra Abcam), og RP215 monoklonalt antistoff (mAb) (donert av professor Xiaoyan Qiu, Peking University, Beijing, Kina; 1:1,000), som spesifikt identifiserte en karbohydratassosiert epitop på ikke-B-Ig. Membranen ble deretter inkubert med geit-anti-kanin (kat. nr. 926-32211) eller anti-mus (kat. nr. 926-32210) IgG-IRDyeTM680CW sekundære antistoffer (begge 1:10,{{37}; LI-COR Biosciences) ved romtemperatur i 1 time. Signalet ble oppdaget ved hjelp av Odyssey Imaging-systemet og Odyssey V3.0-programvaren (begge LI-COR Biosciences). ImageJ-programvare (versjon 1.8.0; National Institutes of Health) ble brukt til semi-kvantifisering.

IgG-rensing og massespektrometri.Etter at HK‑2-celler hadde blitt dyrket i DMEM/F12 uten FBS i 48 timer, ble kultursupernatanten samlet etter sentrifugering ved 2,103 xg i 10 minutter ved 4˚C. Cellesupernatanten ble renset ved affinitetskromatografi ved bruk av protein G Sepharose, i henhold til produsentens instruksjoner (kat.nr. 17-0618-02; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Eluenten ble ultrafiltrert for å erstatte elueringsbufferen (0,1 M glycin; pH 2,4) med PBS. De rensede proteinene ble separert med SDS-PAGE på 10 prosent geler, påvist ved western blotting, og videre analysert ved massespektrometri, utført av Beijing Protein Innovation Co., Ltd.

Immunfluorescens.HK-2-celler ble dyrket på dekkglass, som ble fikset i kald ufortynnet aceton i 5 minutter ved romtemperatur. Deretter ble objektglassene vasket to ganger i PBS og blokkert med 5 prosent FBS/PBS ved romtemperatur i 20 minutter, hvoretter de ble inkubert med primære antistoffer ved 4˚C over natten. Antistoffene var de samme som ble brukt i western blotting: Kanin anti-human Ig (1:150), anti-human Igκ (1:250), anti-human Igλ (1:250) og RP215 mAb (1:200) ); PBS ble brukt som en negativ kontroll. Etter vask i PBS ble objektglassene inkubert med fluorescein-isotiocyanat-merket geit-anti-kanin (kat.nr. A11008) eller geit-anti-mus (kat.nr. A11001) IgG-antistoffer (1:1,000; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) ved romtemperatur i 1 time. Kjerner ble farget med DAPI. Bildene ble tatt under et Leica DFC300 FX fluorescensmikroskop (Leica Microsystems GmbH).

Immunhistokjemisk farging.Paracancerøse nyrebark ble samlet inn fra fire mannlige pasienter (alder, 38-49 år) med nyrekarsinom. Normale paracancerøse nyrebarker etter nefrektomi ble fiksert med 10 prosent formalin i 48 timer ved romtemperatur og deretter innebygd i parafin. Parafininnstøpte humane nyreprøver ble kuttet i 3 µm seksjoner og avparafinisert og rehydrert gjennom en serie graderte etanolkonsentrasjoner. Antigeninnhenting ble utført ved å koke inn 0.05 M Tris-EDTA (pH 9,0) i en trykkoker i 3 min. Seksjonene ble deretter inkubert med 3 prosent H2O2-løsning i 10 minutter ved romtemperatur for å eliminere endogen peroksidase og inkubert med normalt geiteserum (kat.nr. ZLI-9022, ZSGB-BIO, Kina) i 30 minutter ved romtemperatur for å blokkere uspesifikke antistoffbindingssteder ved romtemperatur. Deretter ble indirekte immunhistokjemisk farging utført med primære antistoffer ved 4˚C over natten, inkludert RP215 mAb (1:200; 5 µg/ml), kanin anti-humant Ig (1:2,000), anti-humant Igκ (1:1,000), anti-human Igλ (1:1,000) (de samme antistoffene som brukes i western blotting). Seksjoner uten primære antistoffer ble brukt som negative kontroller. Objektglassene ble deretter inkubert med ufortynnede pepperrotperoksidase-merkede sekundære antistoffer (kat. nr. PV-6001 og PV-6002; begge OriGene Technologies, Inc.) ved romtemperatur i 30 minutter. Bunne antistoffer ble påvist ved bruk av diaminobenzidin. Til slutt ble objektglassene motfarget med hematoksylin. Bildene ble tatt med et lysmikroskop (x200 forstørrelse). Statistisk analyse. Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik og ble analysert med SPSS 20.0 for Windows (IBM Corp.). Alle forsøk ble gjentatt 3 ganger. Forskjellene mellom flere grupper ble analysert ved å bruke enveis ANOVA og Tukeys posthoc-test. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Effekter av cistanche: fordel nyre

Resultater

IgG-ekspresjon i renale tubulære epitelceller i nyrebarken.Normale nyrebarker, som ble samlet inn fra donorer som gjennomgikk nefrektomi som et resultat av nyrecellekarsinom, ble brukt til å bestemme IgG-ekspresjonen i renale tubulære epitelceller ved immunhistokjemi ved bruk av antistoffer mot humant Ig , Igκ, Igλ og RP215 (et antistoff som dominerer binder seg til ikke-B-IgG). Positiv farging av tunge og lette IgG-kjeder ble ikke bare påvist i PTEC-ene, men også i distale viklede tubuli-epitelceller, enten i cytoplasma, cellemembran eller tubulær lumen (fig. 1).

Transkripsjon og V(D)J-rekombinasjon av IgG i enkle PTEC-er. For å unngå interferens av gjenværende blod, binding og transcytose av IgG av PTEC-er i nyrebarken, og for å få direkte bevis på IgG-ekspresjon i PTEC-er, ble enkelt-PTEC-er sortert fra den humane nyrebarken ved bruk av CD10- og CD13-sammerking ved flyt. cytometri (20). Som vist i fig. 2A, utgjorde CD10/CD13 dobbeltpositive PTEC-er 4,1 prosent av levedyktige celler i prøven. De isolerte PTEC-ene ble ytterligere bekreftet ved å bruke det spesifikke markørgenet LRP2, og B-cellekontaminering ble eliminert av CD19. Ig-transkripsjoner av variabel region ble amplifisert i fem enkle PTEC-er ved nestet PCR (fig. 2B og C). Sanger-sekvenseringsresultater avslørte at PTEC-er viste funksjonell og konservativ VDJ-rekombinasjon av IgG-tungkjede (tabell I), noe som indikerer at IgG-ekspresjon kan forekomme i PTEC-er.

IgG tung og lett kjede uttrykk i HK-2 celler. Siden det var vanskelig å oppdage IgG-proteinekspresjon i en enkelt PTEC og å oppnå nok PTEC-er for western blotting, ble HK-2-cellelinjen, som består av udødeliggjorte PTEC-er, valgt for ytterligere å bekrefte IgG-proteinekspresjon. Immunfluorescensanalyse viste positiv farging av Ig, Igκ og Igλ i cytoplasmaet, og sterkere positiv farging av RP215 hovedsakelig i cytoplasma og cellemembran (fig. 3A).

Deretter ble ekspresjonen av IgG tunge og lette kjeder i HK-2-celler påvist ved western blotting under reduserende forhold. For å eliminere FBS-interferens i kulturmediet ble mediet som inneholdt FBS blottet med tilsvarende antistoffer og farget negativt. Et kommersielt IgG-antistoff var i stand til å oppdage serum-avledet IgG, men ikke HK-2-avledet IgG. Derimot kunne RP215 oppdage HK-2-avledet IgG, men ikke serum-IgG. Både kommersielt IgG-antistoff og RP215 var i stand til å påvise Ig ved 55 kDa. Et Ig 4-bånd (36 kDa) ble påvist i HK-2-celler, i samsvar med den forutsagte molekylvekten. Videre ble Igκ (25 kDa) og Igλ (50 kDa, dimer) uttrykk observert i cellelysatene (fig. 3B). Deretter ble IgG i cellesupernatanten renset med protein G, bekreftet ved western blotting og sekvensert ved massespektrometri, som viste at 55-kDa-båndet inneholdt fragmenter av Igκ-kjeden og Ig-tungkjeden variable region, ifølge National Center for Database for bioteknologiinformasjon (NCBI) (fig. 3C-E). Disse dataene antydet at HK-2-celler produserte og utskilte IgG-protein.

Transkripsjon og V(D)J-rekombinasjon av IgG tunge og lette kjeder i HK-2-celler. Ig-gentranskripsjon og funksjonell V(D)J-rekombinasjon er en forutsetning for Ig-ekspresjon. For å bekrefte ekspresjonen av IgG i HK-2-celler, ble Ig-, Igκ- og Igλ-transkripter vurdert ved å amplifisere de konstante og variable områdene i HK-2-celler (fig. 4A og B). Sekvensering av de konstante PCR-produktene viste høy homologi med den publiserte sekvensen i NCBI-databasen. T-A-kloning og Sanger-sekvensering viste at Ig i HK-2-celler viste konservativ V(D)J-rekombinasjon med VH4-4/D2-8/JH5. Derimot ble mangfoldet av V(D)J-rekombinasjon observert i PBMC-er, som eliminerte primerbias (tabell II). I likhet med B-celler, viste HK-2-avledet IgG typisk produktiv V(D)J-rekombinasjon med V-D- og D-J-krysset (fig. 4C). Dessuten ble de somatiske hypermutasjonene oppdaget i HK-2-avledet Ig (område, 6,8-8,4 prosent) med 7 av 15 hotspot-motiver (RGYW/WRCY, W=A/T, R= A/G, Y=C/T) med mutasjoner.

I tillegg ble AID-transkripter (et essensielt element for somatisk hypermutasjon og klassesvitsjrekombinasjon i B-celler), og RAG1 og RAG2 [nødvendig for V(D)J-rekombinasjon] påvist i HK-2-celler (fig. 4B), noe som indikerer at Mekanismen som ligger til grunn for Ig-syntese i HK-2-celler kan være lik den i B-celler.

TGF‑1 oppregulerer IgG-ekspresjon i HK‑2-celler. HK‑2-celler ble stimulert med forskjellige konsentrasjoner av TGF‑1 i 48 timer. Immunofluorescensfarging viste at cytoplasmatisk IgG viste forbedret positiv farging sammenlignet med kontrollgruppen (fig. 5A). Western blotting bekreftet at IgG ble betydelig oppregulert av TGF-1 (P<0.05; fig.="" 5b="" and="">

Effekter av cistanche: fordel nyre

Diskusjon

Denne studien viste at PTEC-er uttrykte IgG med gentranskripsjon og funksjonell konservativ V(D)J-rekombinasjon, som var lik ikke-B-IgG. TGF-1 oppregulerte IgG-ekspresjon i HK2-celler.

For å undersøke om PTEC-er uttrykte IgG, ble IgG først påvist i cytoplasma, cellemembran og lumen til PTEC-er i den normale humane nyrebarken ved immunhistokjemi; resultatene indikerte at PTEC produserte og utskilte IgG. Dette er i motsetning til vår rutinemessige patologiske undersøkelse, hvor det ikke ble påvist noe tydelig IgG i PTEC. Dette kan skyldes svært svak PTEC-farging, som var for lav til å bli oppdaget, spesielt ved immunrelaterte glomerulære sykdommer der Igs er sterkt positive i glomeruli og PTEC-farging kan gå utilsiktet, men kunstig tapt. IgG-transcytose fra sirkulasjonen av PTEC-er via Fc-reseptoren ble delvis utelukket, da tydelig farging av IgG av RP215 ble observert i cellemembranen og cytoplasmaet. Disse funnene antydet at PTEC-avledet IgG var lik andre ikke-B-IgG og kan ha unike glykosylerte epitoper, som spesifikt kan gjenkjennes av RP215 i stedet for et kommersielt anti-IgG-antistoff (15). Funnet om at bare deler av tubulære epitelceller uttrykker IgG kan forklares med dynamisk uttrykk ved forskjellige cellesykluser, som var lik ekspresjonsmønsteret til mesangialcelle-avledet IgA (18). Co-farging av IgG med rørformede markører (som aquaporin 1 og aquaporin 3) vil være nyttig for videre studier for å forbedre funnene i denne studien.

Encellet RNA-sekvensering kan tydelig vise transkripsjonen av et spesifikt gen i en gitt celle. Transkripsjoner av Ig-kjeden og V(D)J-rekombinasjon ble påvist i enkeltstående PTEC-er. Selv om bare fem enkelt-PTEC-er ble brukt, var prosessen streng da nyrebarken ble samlet langt fra svulsten, og hver enkelt celle ble sortert ved flowcytometri med to PTEC-spesifikke markørgener, bekreftet på nytt ved bruk av et tredje spesifikt markørgen (LRP2) og B-celleforurensning ble eliminert. Resultatene avslørte at PTEC-er ikke bare presenterer med IgG-gentranskripter, men også den klassiske V(D)J-rekombinasjonen i den variable regionen som B-celler, slik som den produktive V(D)J-rekombinasjonen med V-D og D-J veikryss (fig. 4), noe som indikerer at PTEC-er har potensial til å produsere IgG. I tillegg illustrerte den mer konservative V(D)J-rekombinasjonen at PTEC-er presenteres med IgG-gentranskripsjoner og V(D)J-rekombinasjon som ligner på andre ikke-B-celler.

HK-2, en udødeliggjort PTEC-linje, er lett å dyrke i store mengder. Denne studien bekreftet IgG-proteinekspresjon i dyrkede HK-2-celler; IgG ble påvist i HK-2-celler ved både immunfluorescens og western blotting. Ig4, en underklasse av Ig, ble også detektert ved en båndstørrelse i samsvar med den forutsagte molekylvekten. Massespektrometri avslørte at proteinet renset fra cellesupernatant ved bruk av protein G inneholdt fragmenter av den variable regionen av den tunge kjeden og Igκ-kjeden, noe som ga bevis for IgG-sekresjon av PTEC-er. IgG-transkripsjon i HK‑2-celler støttet ytterligere IgG-ekspresjon i PTEC-er, og den konservative V(D)J-rekombinasjonen med IGHV4‑4/IGHD2‑8/IGHJ5 i HK‑2-celler støttet ytterligere tilstedeværelsen av IgG i HK‑2-celler lignende til andre ikke-B-celler.

Denne studien undersøkte også den underliggende mekanismen for IgG-produksjon i PTEC-er ved å undersøke transkripsjonen av RAG1, RAG2 og AID i HK-2-celler. Det ble avslørt at RAG1, RAG2 og AID ble transkribert i HK-2-celler. I tillegg har RAG1-, RAG2- eller AID-transkripsjoner tidligere blitt påvist i en rekke andre ikke-B-celler, slik som podocytter (19) og flere kreftcellelinjer (23). Disse resultatene antydet at ikke-B-celler, inkludert PTEC-er, kan ha lignende mekanismer for Ig-syntese som B-celler. Hvorvidt AID og/eller RAG1/2 er nødvendige gener for PTEC-avledet IgG krever imidlertid ytterligere undersøkelser. I tillegg er follikulære hjelper CD4-T-celler viktige for å regulere bakteriesenter B-celledifferensiering til plasmaceller og støtte produksjonen av Igs (24). Våre upubliserte data avslørte at ikke-B-Ig fortsatt ble oppdaget i T- og B-celle-mangelfulle NOD-SCID-mus, noe som indikerer at ikke-B-Ig ikke var helt avhengig av T-hjelpeceller. Hvorvidt T-hjelpeceller kreves for at PTEC skal uttrykke IgG krever videre forskning.

TGF-1 har en sentral immunmodulerende rolle i Ig-produksjon. For eksempel induserte TGF-1 IgA-klassebytte og sekresjon i stimulerte B-celler i musemilt (25) og humane tonsil B-celler (26). McIntyre et al (27) demonstrerte at TGF-1 selektivt stimulerte IgG2b-sekresjon av lipopolysakkaridaktiverte B-celler mest sannsynlig ved å indusere en IgM til IgG2b-klassebytte. Duan et al (28) demonstrerte at TGF-1 økte IgA-ekspresjon ved å oppregulere transkripsjonsfaktoren Ets-1 i epitelkreftceller. Denne studien viste at TGF-1 oppregulerte IgG-ekspresjon i HK-2-celler. Gitt at bare IgG ble påvist i HK-2-celler, ble det antatt at TGF-1 induserte IgG-ekspresjon uavhengig av Ig-klassebytte. Den regulatoriske mekanismen for IgG-produksjon av TGF-1 krever ytterligere undersøkelser.

PTEC-er tjener en viktig rolle i tubulær interstitiell fibrose gjennom EMT og TGF-1 fungerer som en masterprofibrotisk mediator. I denne studien økte tilsetning av TGF-1 til dyrkede HK-2-celler IgG-ekspresjon, noe som indikerer at HK-2-avledet IgG kan være positivt assosiert med EMT. Tidligere studier har rapportert at cancer-IgG var assosiert med metastaser og fremmet EMT ved å redusere E-cadherin i spytt adenoid cystisk karsinom (29) og lungekreft (30). Det er verdt å undersøke om PTEC-avledet IgG kan tjene en rolle i renal tubulær EMT og interstitiell fibrose under sykdomstilstander, som iskemi/reperfusjonsskade ellerKronisk nyre sykdom.

Som konklusjon, så vidt vi vet, var denne studien den første som demonstrerte at PTEC-er kan uttrykke og utskille IgG, og TGF-1 kan oppregulere IgG-ekspresjon i HK-2-celler. Imidlertid krever den potensielle rollen til PTEC-avledet IgG i tubulointerstitiell fibrose ytterligere undersøkelser.

Effekter av cistanche: fordel nyre

Finansiering

Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (stipend nr. 82070736, 91642109 og 81870488), Hainan Natural Science Foundation (stipend nr. 819QN355), Hainan Medical University Scientific Research Cultivation Foundation (stipend nr. HYPY201926), og nøkkelstøtteprosjektene til National Natural Science Foundations store forskningsprogram (stipend nr. 91642206).

Tilgjengelighet av data og materialer

Datasettene som er brukt og/eller analysert i løpet av den nåværende studien er tilgjengelig fra den tilsvarende forfatteren på rimelig forespørsel.

Forfatteres bidrag

Som de tilsvarende forfatterne, unnfanget og designet YW og XQ studien. ZD deltok i forskningsdesignet, utførte histologiske og encellede eksperimenter, forberedte prøver for massespektrometri, analyserte data og skrev manuskriptet. ZJ deltok i forskningsdesignet, de fleste eksperimenter angående IgG-ekspresjon i HK-2-celler og relevant dataanalyse. YG, JM, HD og YL utførte partielle cellelinjeeksperimenter. ZC og YP valgte passende tilfeller for enkeltcelleeksperimenter i henhold til kliniske egenskaper. HY og ZS deltok i enkeltcelleeksperimenter. SW deltok i immunhistokjemisk farging, analyserte vevsfargingsdata og utarbeidet og reviderte manuskriptet. YW, ZD og ZJ bekreftet autentisiteten til alle rådataene. Alle forfattere gjennomgikk manuskriptet og reviderte dataene. Alle forfattere leste og godkjente det endelige manuskriptet.

Etikkgodkjenning og samtykke til å delta

Denne studien var i samsvar med prinsippene i Helsinki-erklæringen, og ble godkjent av den medisinske etiske komiteen ved Peking University Third Hospital (godkjenningsnr. S2020121) og utført i samsvar med protokollen. Alle givere donerte frivillig nyrecortex og ga skriftlig informert samtykke før de donerte nyrecortex til studien. Alle metoder ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter. Disse prøvene ble strengt anonymisert. Humant serum og PBMC, brukt som positive kontroller i western blotting eller revers transkripsjon-PCR i denne studien, ble hentet fra blodet til en frisk frivillig, som ga skriftlig informert samtykke for prøvetaking.

Effekter av cistanche: fordel nyre

Referanser

1. Schlondorff DO: Oversikt over faktorer som bidrar til patofysiologien til progressiv nyresykdom. Kidney Int 74: 860-866, 2008.

2. Donadio ME, Loiacono E, Peruzzi L, Amore A, Camilla R, Chile F, Vergano L, Boido A, Corrieri M, Bianciotto M,et al: Tolllignende reseptorer, immunproteasom og regulatoriske T-celler hos barn med Henoch-Schonlein purpura og primær IgA nefropati. Pediatr Nephrol 29: 1545-1551, 2014.

3. Breda PC, Wiech T, Meyer-Schwesinger C, Grahammer F, Huber T, Panzer U, Tiegs G og Neumann K: Renale proksimale tubulære epitelceller utøver immunmodulerende funksjon ved å drive inflammatorisk CD4 pluss T-cellerespons. Am J Physiol Renal Physiol 317: F77-F89, 2019.

4. Liu BC, Tang TT, Lv LL og Lan HY: Nyretubuliskade: En drivkraft mot kronisk nyresykdom. Kidney Int 93: 568-579, 2018.

5. Kobayashi N, Suzuki Y, Tsuge T, Okumura K, Ra C og Tomino Y: FcRn-mediert transcytose av immunoglobulin G i humane proksimale tubulære epitelceller i nyrene. Am J Physiol Renal Physiol 282: F358-F365, 2002.

6. Qiu X, Zhu X, Zhang L, Mao Y, Zhang J, Hao P, Li G, Lv P, Li Z, Sun X,et al: Humane epitelkreft utskiller immunglobulin g med uidentifisert spesifisitet for å fremme vekst og overlevelse av tumorceller. Cancer Res 63: 6488-6495, 2003.

7. Zheng J, Huang J, Mao Y, Liu S, Sun X, Zhu X, Ma T, Zhang L, Ji J, Zhang Y,et al: Immunoglobulingentranskripsjoner har distinkte VHDJH-rekombinasjonsegenskaper i humane epitelkreftceller. J Biol Chem 284: 13610-13619, 2009.

8. Jiang D, Ge J, Liao Q, Ma J, Liu Y, Huang J, Wang C, Xu W, Zheng J, Shao W,et al: IgG og IgA med potensiell mikrobiell bindende aktivitet uttrykkes av normale humane hudepidermale celler. Int J Mol Sci 16: 2574-2590, 2015.

9. Zhu Z, Zhang M, Shao W, Wang P, Gong X, Ma J, Qiu X og Wang B: Immunoglobulin M, et nytt molekyl av myokardceller fra mus. Int J Biochem Cell Biol 88: 172-180, 2017.

10. Niu N, Zhang J, Sun Y, Wang S, Sun Y, Korteweg C, Gao W og Gu J: Ekspresjon og distribusjon av immunglobulin G og dets reseptorer i et immunprivilegert sted: Øyet. Cell Mol Life Sci 68: 2481-2492, 2011.

11. Huang J, Sun X, Mao Y, Zhu X, Zhang P, Zhang L, Du J og Qiu XY: Uttrykk av immunoglobulingenet med klassisk V-(D)-J-omorganisering i musehjerneneuroner. Int J Biochem Cell Biol 40: 1604-1615, 2008.

12. Niu N, Zhang J, Guo Y, Zhao Y, Korteweg C og Gu J: Ekspresjon og distribusjon av immunglobulin G og dets reseptorer i det menneskelige nervesystemet. Int J Biochem Cell Biol 43: 556-563, 2011.

13. Li J, Korteweg C, Qiu Y, Luo J, Chen Z, Huang G, Li W og Gu J: To ultrastrukturelle distribusjonsmønstre av immunoglobulin G i human placenta og funksjonelle implikasjoner. Biol Reprod 91: 128, 2014.

14. Huang J, Zhang L, Ma T, Zhang P og Qiu X: Ekspresjon av immunoglobulingenet med klassisk V-(D)-J-omorganisering i testikler og bitestikler hos mus. J Histochem Cytochem 57: 339-349, 2009.

15. Tang J, Zhang J, Liu Y, Liao Q, Huang J, Geng Z, Xu W, Sheng Z, Lee G, Zhang Y,et al: Lungeplateepitelkarsinomceller uttrykker ikke-kanonisk glykosylert IgG som aktiverer integrin-FAK-signalering. Cancer Lett 430: 148-159, 2018.

16. Cui M, You L, Zheng B, Huang X, Liu QF, Huang J, Pan B, Qiu X, Liao Q og Zhao Y: Høyt ekspresjon av kreftavledet glykosylert immunglobulin G forutsier dårlig prognose ved duktalt adenokarsinom i bukspyttkjertelen. J Cancer 11: 2213-2221, 2020

17. Cui M, Hu Y, Zheng B, Zhang S, Zhang X, Wang M, Qiu XY, Liao Q og Zhao YP: Kreftavledet immunglobulin G: En ny markør for differensialdiagnose og tilbakefallsprediksjon ved biskjoldbruskkarsinom. Clin Endocrinol (Oxf) 92: 461-467, 2020.

18. Deng H, Ma J, Jing Z, Deng Z, Liang Y, AL, Liu Y, Qiu X og Wang Y: Ekspresjon av immunglobulin A i humane mesangiale celler og dets effekter på celleapoptose og adhesjon. Mol Med Rep 17: 5272-5282, 2018.

19. Jing Z, Deng H, Ma J, Guo Y, Liang Y, Wu R, AL, Geng Z, Qiu X og Wang Y: Ekspresjon av immunglobulin G i humane podocytter, og dets rolle i cellelevedyktighet og adhesjon. Int J Mol Med 41: 3296-3306, 2018.

20. Van der Hauwaert C, Savary G, Gnemmi V, Glowacki F, Pottier N, Bouillez A, Maboudou P, Zini L, Leroy X, Cauffiez C,et al: Isolering og karakterisering av en primær proksimal tubulær epitelcellemodell fra den menneskelige nyren ved CD10/CD13 dobbeltmerking. PLoS One 8: e66750, 2013.