Uttrykk av nyrevitamin D og fosfatoninrelaterte gener i en sauemodell av osteoporose
Jul 29, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mer informasjon
Abstrakt:Osteoporose er et betydelig folkehelseproblem rundt om i verden, med postmenopausal osteoporose på grunn av østrogenmangel som resulterer i omtrent 3/4 av tilfellene. I denne studien ble 18 eldre Merino-søyer ovariektomisert, og 10 var kontroller. Tre av de ovariektomiserte søyene ble behandlet ukentlig med 400 mg metylprednisolon i 5 måneder og tre ble behandlet ukentlig i 2 måneder, etterfulgt av en 3-måneds restitusjonsperiode. Etter 2 måneder ble fem kontrolldyr og seks ovariektomiserte dyr avlivet. Etter 5 måneder ble alle de gjenværende søyene avlivet. Nyreprøver ble samlet postmortem for qPCR-analyse av NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA og NCX1. Ovariektomiserte sauer hadde signifikant større VDR-uttrykk sammenlignet med andre grupper. Ovariektomiserte sauer behandlet med glukokortikoider i 2 måneder etterfulgt av eutanasi etter 5 måneder viste signifikante forskjeller i TRPV5, CYP24A1 og klotho genuttrykk sammenlignet med andre grupper. Forskjeller i klotho-uttrykk var mest markerte etter justering for gjentatte mål (p=0.1). Klotho er kjent som "antialdringshormonet" og er involvert i kalsium- og fosformetabolismen. Klotho kan være involvert i utvinningen av bentetthet hos ovariektomiserte sauer behandlet med glukokortikoider i 2 måneder etterfulgt av eutanasi etter 5 måneder. Ytterligere forskning på rollen til klotho anbefales.
Nøkkelord:osteoporose; sau; Vitamin d; fosfatering; qPCR; kalsiummetabolisme; fosformetabolisme; klotho
1. Introduksjon
Osteoporose er et stort folkehelseproblem for verdens stadig aldrende befolkning, og kostet USA nesten 17 milliarder dollar i 205 og anslått å vokse til 25 milliarder dollar i 2025 [1,2]. Omtrent 70-75 prosent av osteoporosebelastningen skyldes postmenopausal osteoporose hos kvinner [1], primær osteoporose hvor østrogenmangel resulterer i redusert beindannelse og økt benresorpsjon, noe som fører til redusert benmasse og benskjørhet [3] . Osteoporose kan også oppstå sekundært til spesifikke årsaker, slik som glukokortikoidbehandling. Sauen er en veletablert stor dyremodell for ulike menneskelige skjelettsykdommer, inkludert osteoporose[4]. En av fordelene med en stor dyremodell, som sauen, er evnen til å teste ortopediske implantater, kirurgiske teknikker og biomaterialer [4]I tillegg er sauen relativt lav kostnad, enkel å håndtere og gir rikelig med materiale for testing [4,5].
De vanligste sauemodellene for osteoporose er 12 måneder postoperativt ovariektomisert sau og 6-måneds ovariektomisert sau på en kalsium- og vitamin D-mangel diett gitt glukokortikoider[4]. Ved å bruke en kombinasjon av kjente osteoporose-induserende faktorer, inkludert ovariektomi, glukokortikoidbehandling og en diett med lavt kalsium, har vi vært i stand til å etablere en sauemodell for osteoporose på bare 5 måneder [6,7], og dermed redusert bolig, fødsel, og fôrkostnader involvert i modellutvikling. I denne modellen ble ovariektomi funnet å øke serumkonsentrasjonene av C-terminale telopeptider av type I kollagen (CTX-I, en benresorpsjonsmarkør) og osteokalsin (benomsetningsmarkør) sammenlignet med kontrollsau. Sau som fikk glukokortikoidbehandling i 2 måneder hadde høyere serum CTX-I konsentrasjoner og lavere serum osteokalcinkonsentrasjoner. I tillegg var lår- og lumbalryggradens bentetthet og total og trabekulær volumetrisk benmineraltetthet i den proksimale tibia lavere i eksperimentelt behandlede grupper sammenlignet med kontrollgruppene, spesielt for ovariektomiserte glukokortikoidbehandlede søyer [6]. Aminosyre- og lipidmetabolismen ble også funnet å være endret hos ovariektomiserte og glukokortikoidbehandlede sauer [7].cistanche wirkungLignende endringer er også funnet i andre osteoporosemodeller for osteoporose hos sauer [8].
Cistanche kan anti-aldring
Vitamin D-responsive gener og fosfateringssystemet har ikke tidligere blitt utforsket i ovariektomiserte sauemodeller. Vitamin D, hvorav 1,25-dihydroksyvitamin D er den aktive formen, fører til slutt til økte plasma-ioniserte kalsium- og fosforkonsentrasjoner ved å binde seg til vitamin D-reseptoren (VDR)-retinoid X-reseptor-heterodimer og endre uttrykk for en rekke vitaminer. D-responsive gener, slik som kalsiumbindende proteiner (calbindin D9 og 28k (CalD9k, CalD28k)) og kalsiumkanaler (transient reseptor potensiell kationkanal underfamilie V medlem 5 og 6 (TRPV5, TRPV6), plasmamembran kalsium ATPase (PMCA) , natrium-kalsiumveksler 1(NCX1)[9]. Produksjonen av 1,25-dihydroksyvitamin D er et tett regulert trinn, der nyrehydroksylase (CYP27B1) katalyserer omdannelsen av 25-hydroksyvitamin D til 1,25-dihydroksyvitamin D, og enzymet 24-hydroksylase(CYP24A1) bryter ned både 25-hydroksyvitamin D og 1,25-dihydroksyvitamin D til inaktive biprodukter.cistanche StorbritanniaFosfateringssystemet kontrollerer også plasmafosfor- og kalsiumkonsentrasjoner[10]. Lynchpin i dette systemet er fibroblastvekstfaktor 23, som produseres av osteocytter i bein og primært kontrollerer plasmafosforkonsentrasjoner ved å binde seg til kofaktoren klotho for å redusere ekspresjonen av natriumfosfat-kotransportører (NPT1, NPT2a, NPT2c) [11]. På grunn av de innbyrdes relaterte effektene av parathyroidhormon og 1,25-dihydroksyvitamin D, har det vært utfordrende å bestemme effekten av FGF23 på kalsiummetabolismen, men det er bevis som tyder på at det kan regulere intestinal absorpsjon av kalsium og nyre. kalsiumreabsorpsjon[12,13].
Glukokortikoider har en rekke effekter på kalsium- og fosformetabolismen, inkludert hemming av intestinal kalsiumabsorpsjon, redusert renal tubulær kalsiumreabsorpsjon og redusert renal fosforreabsorpsjon [14-16]. I tillegg har lite forskning undersøkt effekten av østrogenmangel på vitamin D-responsive gener og fosfateringssystemet [17,18].
Denne ovariektomiserte dietten med lavt kalsium, glukokortikoid-behandlet sauemodell av osteoporose ga en mulighet til å produsere foreløpig informasjon om effekten av disse behandlingene på uttrykket av fosfaterings- og vitamin D-responsive gener i nyrene hos får. Målet med denne studien var todelt: (1)avgjøre om ovariektomi eller ovariektomi og glukokortikoidbehandling endret uttrykket av vitamin D og fosfatrelaterte gener i nyrene;(2)bestemme forholdet mellom nyrevitamin D og fosfatrelaterte gener, serum vitamin D og serum beinomsetningsmarkører (CTX-I og osteokalsin).
2. Materialer og metoder
Detaljerte metoder for utvikling av den ovariektomerte og glukokortikoidbehandlede sauemodellen for osteoporose er tidligere publisert [6]. Kort fortalt ble eldre Merino-søyer (7-9 år gamle,n=28) tilfeldig fordelt i grupper: kontroll(n=10)ovariektomisert (OVX) (n=12), ovariektomisert og glukokortikoidbehandling (40 mg metylprednisolon ved subkutan injeksjon) månedlig i 2 måneder etterfulgt av ingen behandling på 3 måneder (n=3) og glukokortikoidbehandling (400 mg metylprednisolon) månedlig i 5 måneder (n=3) .sitrus bioflavonoiderSauene ble holdt i et fjøs og fôret enten en kontroll (115g/kg kalsium;2,2g/sau per dag) eller lavt kalsium (5 g/kg kalsium;1g/sau per dag) sauepelletkonsentratfôr [19]. Vedlikeholdskrav for en ikke-drektig søye er 1,2 g/sau per dag[19].
Blodprøver ble tatt via halsvenepunktur 2 måneder og 5 måneder etter operasjonen. Osteocalcin ble målt ved bruk av Micro Vue Osteocalcin immunoassay-settet, og CTX-I ved bruk av IDS Serum CrossLaps ELISA-settet, som tidligere rapportert [6]Serum-totale kalsium- og fosforkonsentrasjoner ble målt ved bruk av spektrofotometri på en AU680 Clinical Chemistry Analyzer (Beckman Coulter, Brea) , CA, USA). Serum 25-hydroksyvitamin D-konsentrasjon ble målt ved bruk av isotopfortynningsvæskekromatogram;rafi-massespektrometri ved Endolab, Canterbury Health Laboratories, Christchurch, New Zealand.
Etter måneder ble 5 søyer fra kontrollgruppen og 6 fra OVX-gruppen avlivet og obdusert. Etter 5 måneder ble de gjenværende søyene også avlivet (kontrollgruppe n =5, OVX-gruppe n=6, OVX pluss 2m glukokortikoider n=3 og OVX pluss 5m glukokortikoider n=5 ) og obdusert. Nyreprøver ble samlet innen 30 minutter etter døden og delt i to, med en prøve plassert i 10 prosent nøytralt bufret formalin og behandlet for histologi, og den andre snappfryst i flytende nitrogen og lagret ved-80 grad til behandling av hematoksylin og eosin-fargede deler av nyrene ble undersøkt av hovedforfatteren og bekreftet fraværet av betydelige lesjoner.
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Massey University Animal Ethics Committee (godkjenningsnummer 14/103) og utført i henhold til Code of Ethical Conduct for bruk av levende dyr til forskning ved Massey University, Palmerston North, New Zealand.
RNA-ekstraksjon og qPCR ble utført som tidligere beskrevet [20,21]. Kort fortalt ble Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) brukt til å ekstrahere RNA i henhold til produsentens instruksjoner. Genomisk DNA ble fjernet med Ambion Turbo DNA-fritt (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved bruk av et Qubit 2.0-fluorometer og Qubit RNA-analysesett for bredt spekter (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), og RNA-kvaliteten ble vurdert ved å bestemme 260/280-forholdet og kjøre på en agarosegel. Transcriptor første streng cDNA syntesesett (Roche) ble brukt til å syntetisere cDNA. Hver 20 μL reaksjonsblanding inneholdt 600 ng RNA, 2,5 μM oligo（dT）, 8mM RT-reaksjonsbuffer, 1 mM dNTP, 10U revers transkriptase, 20 U RNase-hemmer og RNase-Dnase-fritt vann. Reaksjonen ble utført ved 55 grader i 30 minutter, 85 grader i 5 minutter, og deretter avkjølt ved 4 grader ved bruk av en Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Sanntids qPCR ble utført ved bruk av StepOne Plus sanntids PCR-maskin (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA). Hver PCR-blanding inneholdt 5 uL Power SYBR Green PCR-masterblanding (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), forover- og reversprimere ved konsentrasjonene oppført i Tabell S1, 10 ng cDNA, og deretter laget opp til 10 μL med RNase, DNase-fritt vann. PCR-protokollen besto av 95 grader i 20 s, 40 sykluser ved 95 grader for og 60 grader for, og til slutt en smeltekurve fra 60 grader til 95 grader med en oppvarmingshastighet på 0,3 grader /15 s. Vann og reaksjonsblanding uten revers transkriptase ble inkludert som negative kontroller i hver PCR-kjøring, og alle prøver ble kjørt i duplikat. Følgende gener ble vurdert: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA og NCX1. PKG1 og SDHA har tidligere blitt funnet å være stabilt uttrykt i ovine nyre [20], og prøver ble normalisert i forhold til ekspresjonen av disse genene og geneffektivitet ved å bruke 2-AACt-metoden [22].
Statistisk analyse ble utført ved bruk av R Studio 1.3.1093[23] med R-versjonen
4.0.3 and the tidyverse, nlme 3.1-150 og Gary
2.1.2 pakker. Lineære modeller ble brukt på log10 transformerte genfoldekspresjonsdata. I den første modellen var genuttrykk utfallsvariabelen, mens gruppe (kontroll eller OVX men unntatt glukokortikoidbehandlet sau) og tid (avlivet ved 2 m eller 5 m) var avhengige variabler, med en interaksjonsterm (gruppe: tid) inkludert. I den andre modellen var genuttrykk utfallsvariabelen, mens gruppen (kontroll, OVX, OVX med glukokortikoidbehandling i 2 m, og OVX med glukokortikoidbehandling i 5 m) var den avhengige variabelen.cynomorium fordelerEttersom flere utfallsvariabler (gener) ble testet for forskjeller mellom grupper, ble p-verdier justert for flere tester ved å bruke den sekvensielle Holm-prosedyren [24]. Serumkalsium-, fosfor- og 25-hydroksyvitamin D-konsentrasjoner ble testet i genekspresjonsmodellene, men var ikke signifikante og ble fjernet på grunn av mangelen på signifikante forskjeller mellom gruppene. I tillegg ble hovedkomponentanalyse brukt for å vurdere om log10-transformerte genfold-ekspresjonsdata var forskjellig etter gruppe, tidspunkt for eutanasi eller serum-25-hydroksyvitamin D-konsentrasjon. Spearmans parvise korrelasjon og spredningsplott ble brukt for å studere korrelasjonen mellom log10 transformerte genfoldekspresjonsdata og serumanalytter.
3. Resultater
3.1. Effekt av ovariektomi, tid siden ovariektomi og glukokortikoidbehandling på serumkalsium-, fosfor- og 25-hydroksyvitamin D-konsentrasjoner
De fullstendige resultatene for serumkalsium-, fosfor- og 25-hydroksyvitamin D-konsentrasjoner i hver gruppe er presentert i figur 1." Det var ingen signifikante forskjeller i serumkalsium-, -fosfor- og 25-hydroksyvitamin D-konsentrasjoner mellom ovariektomi og lav kalsium diettgruppe og ikke-ovariektomisert tilstrekkelig kalsiumdiettgruppe, og tid siden ovariektomi på 2 måneder og 5 måneder. Disse resultatene tyder på at ovariektomi kombinert med lav kalsiumdiett ikke hadde noen innvirkning på serumkalsiumkonsentrasjoner. Sauer som ble ovariektomert for og behandlet med glukokortikoider i måneder, etterfulgt av eutanasi etter 5 måneder, hadde signifikant lavere serumkalsiumkonsentrasjoner (p =0.0462, adj R20.13) sammenlignet med 5 m ovariektomert på lavkalsiumdiett og 5 m ovariektomert på en lav kalsiumdiett og glukokortikoidbehandlede sauer. Undersøkelse av dataene tyder imidlertid på at dette kan skyldes et dyr som var hypokalsemisk (1,52 mmol/L, referanseområde 2.0-2.7 mmol/L); fjerning av dette dyret fjernet enhver betydning.ørkenhyasintAlle andre sauer hadde serumkalsiumkonsentrasjoner innenfor referanseområdet. Ingen forskjeller ble sett i serumfosfor eller 25-hydroksyvitamin D-konsentrasjoner hos 5 m ovariektomiserte og glukokortikoidbehandlede sauer.
3.2. Effekt av ovariektomi og tid siden ovariektomi på vitamin D og fosfatonin-relatert genuttrykk i nyrene
Genekspresjon av vitamin D og fosfatrelaterte gener var ikke assosiert med ovariektomi eller tid siden ovariektomi (figur 2). Unntaket var vitamin D-reseptoren(VDR), der OVX-gruppen hadde signifikant større VDR-ekspresjon(p=0.05, adj R2 0.16); denne betydningen forsvant imidlertid etter justering for gjentatte tiltak.
3.3. Effekt av ovariektomi og glukokortikoidbehandling på vitamin D og fosfatonin-relatert genuttrykk i NYREN 5 måneder postoperativt
De fullstendige resultatene er presentert i figur 3. Uttrykket av PTH1R var signifikant høyere hos OVX-sau behandlet med glukokortikoider i 5 måneder sammenlignet med de andre gruppene (p=0.04, adj R40.18), mens TRPV5 (p{ {8}}.01, adj R20.31) og CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) uttrykk var signifikant høyere hos OVX-sau behandlet med glukokortikoider i 2 måneder sammenlignet med de andre gruppene.
Uttrykket av klotho var signifikant forskjellig mellom alle gruppene (p =0.01, adj R20.48), med det laveste uttrykket hos kontrollsau. OVX sau behandlet med glukokortikoider i 2 måneder hadde det høyeste uttrykket (p =0.002), etterfulgt av OVX sau (p=0.008) og deretter OVX sau behandlet med glukokortikoider i 5 måneder (p{ {10}}.03). Men når det ble justert for gjentatte mål, var ikke genuttrykk signifikant forskjellig mellom disse gruppene, med klotho som viste den største forskjellen i OVX-sau behandlet med glukokortikoider i 5 måneder (p=0.1).
Tilsvarende var uttrykket for VDR signifikant forskjellig mellom alle grupper (p=0.03, adj R20.38). Det største uttrykket for VDR var i OVX-sau behandlet med glukokortikoider i måneder (p=0.009), etterfulgt av OVX-sau (p=0.01), deretter OVX-sau behandlet med glukokortikoider i 5 måneder (p=0.05), og det laveste uttrykket var til stede i kontrollsau.
3.4.PCA for samlet genuttrykk mellom grupper
PCA-analyse av OVX, kontroll og eutanasi etter 2 og 5 måneder klarte ikke å skille ut de forskjellige gruppene (figur S1). PCL og PC2 forklarte 69,6 prosent av variasjonen. På samme måte klarte ikke PCA-analyse av grupper som ble avlivet etter 5 måneder å skille ut de forskjellige gruppene. PCL og PC2 forklarte 53,2 prosent av variasjonen (figur S2). PCA-analyse viste at samlet genuttrykk ikke kunne forklares med serumkalsium og fosfor av 25-hydroksyvitamin D-konsentrasjoner (figur S3).
3.5. Parvis korrelasjon mellom alle analytter og genuttrykk
Uavhengig av ovariektomistatus, kalsiuminnholdet i dietten, tid siden ovariektomi (2m eller 5m), eller glukokortikoidbehandlingsstatus, var NPT1-genekspresjonen signifikant og positivt korrelert (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">
4. Diskusjon
Resultatene fra denne studien tyder på at behandling av ovariektomiert sau med glukokortikoider har hatt størst innvirkning på genuttrykket, mens selve ovariektomien og tiden etter ovariektomi (2 og 5 måneder) hadde liten innvirkning på genuttrykket. I en univariat analyse ble det sett signifikante forskjeller i TRPV5-, CYP24A1- og klotho-genekspresjon hos ovariektomiserte sauer behandlet med glukokortikoider i 2 måneder etterfulgt av eutanasi ved 5 måneder, og i PTH1R hos ovariektomiserte sauer behandlet med glukokortikoider i 5 måneder. Forskjellene var mest markerte i klotho-uttrykk etter justering for gjentatte mål.
Kvantitativ perifer computertomografi av den proksimale tibia til disse sauene viste at ovariektomi reduserte total volumetrisk benmineraltetthet (vBMD) med 8 prosent, ovariektomi med glukokortikoidbehandling i 5 måneder med 27 prosent, og ovariektomi med glukokortikoider i 2 måneder og 2 måneder. med 13 prosent [6]. Interessant nok var trabekulær BMD, trabekulært område og trabekulært benmineralinnhold lik eller større enn kontrollene hos ovariektomiserte sauer behandlet med glukokortikoider i 2 måneder og avlivet etter 5 måneder, noe som tyder på gjenvinning av benmasse [6]. Glukokortikoider har flere veldokumenterte effekter på bein som fører til utvikling av glukokortikoid-indusert osteoporose. Disse effektene inkluderer hemming av dannelsen av osteoblast-progenitorceller og osteoblaster, økende osteoblastapoptose og redusert osteoidproduksjon, som alle reduserer bendannelse [25,26]. Samtidig øker glukokortikoider benresorpsjonen ved å redusere OPG-ekspresjonen, øke RANKL-ekspresjonen, øke osteoklastdannelsen, redusere osteoklastapoptose og øke sekresjonen av katepsiner og matrisemetalloproteinaser av osteoklaster [25,26].
Klotho er en integrert komponent av fosfateringssystemet, hvorved det binder seg til fibroblastvekstfaktor 23(FGF23) i nyrene. Klotho-FGF23-komplekset binder seg deretter til FGFR1IIC-reseptoren, som initierer flere cellulære veier og til slutt resulterer i oppregulering av renal 24-hydroksylase(CYP24A1)-ekspresjon og nedregulering av renal la-hydroksylase (CYP27B1) og renal tubulær Na/P II-kotransportører (NPT2a og 2c) [10]. Det økte uttrykket (forskjellene i hvilke var mest markert etter justering for gjentatte mål) av klotho hos sau på glukokortikoider i 2 måneder og deretter avlivet ved 5 måneder, kan forklare det økte CYP241-uttrykket som også sees i denne gruppen sauer, til tross for at det ikke var noen signifikante forskjeller i serum 25OHD konsentrasjoner.
Klotho er kjent som antialdringsproteinet, og mus med klotho-mangel har lav beindannelse og benresorpsjon, noe som fører til osteopeni med lav beinomsetning [27,28]. I tillegg er spesifikke klotho-genpolymorfismer assosiert med redusert beinmineraltetthet hos mennesker [29,30]. Løselig klotho oppregulerer tidlig vekstresponsprotein 1 (EGR-1) og induserer ekspresjonen av bendifferensieringsmarkører i osteoblastcellekultur [31]I tillegg kan glukokortikoider undertrykke fibroblastvekstfaktor 232]. Kanskje de større klotho-uttrykkene hos sauer på glukokortikoider i 2 måneder og deretter avlivet etter 5 måneder gjenspeiler restitusjonsprosessen for denne sauen etter glukokortikoidbehandling og, gitt dens rolle i beindannelse og resorpsjon, muligens en nøkkeldriver for beingjenoppretting og derfor potensielt et behandlingsmål for osteoporose hos mennesker.
Imidlertid hadde OVX-sau også økte klotho-uttrykk sammenlignet med kontrollsau. Tilsvarende viste en studie på mus med aromatase-mangel at østrogenmangel økte klotho-proteinnivåer, og østradiolbehandling reduserte klotho-uttrykk i disse musene [17]. Hos mus nedregulerer østrogen NPT2a i en prosess som er uavhengig av klotho/FGF23 og PTH[18]. Denne effekten ble imidlertid ikke sett hos sauene som ble behandlet med eggstokkene i denne nåværende studien. Ellers er det lite litteratur om effekten av østrogenmangel på klotho. Ytterligere forskning bør undersøke effekten av både ovariektomi og glukokortikoider på klotho-ekspresjon, gitt dens rolle i aldring og ved kronisk nyresykdom.
TRPV5 er en epitelial kalsiumkanal som hovedsakelig kommer til uttrykk i de distale, kronglete tubuli og forbindende tubuli i nyrene [20,33]. TRPV5-kanalen er konstitutivt åpen, men gjennomgår kalsiumavhengig inaktivering i forbindelse med calmodulin, et kalsiumfølende protein [34]. TRPV5-ekspresjon kan økes med PTH og 1,25(OH)D3 [35]. En sau som var på glukokortikoider i 2 måneder og deretter avlivet ved 5 måneder var hypokalsemi, og serumkalsiumkonsentrasjonen var signifikant lavere hos sau i denne gruppen sammenlignet med de andre gruppene. Det er derfor sannsynlig at den økte TRPV5-ekspresjonen er et resultat av den reduserte serumkalsiumkonsentrasjonen hos disse dyrene. Glukokortikoider har vist seg å redusere intestinal kalsiumabsorpsjon ved å redusere ekspresjonen av TRPV6 og CalD9k [36,37] og øke urinutskillelsen av kalsium [14], men klinisk signifikant hypokalsemi hos friske individer er uvanlig. Tilsvarende viste sauene med lav serumkalsiumkonsentrasjon ingen kliniske tegn på hypokalsemisk tetani. Alternativt kan det økte uttrykket av TRPV5 hos sau på glukokortikoider i 2 måneder og deretter avlives etter 5 måneder reflektere gjenopprettingsprosessen, hvorved det kreves økt resorpsjon av kalsium fra nyrene for å erstatte gjenvunnet trabekulær BMD, område og benmineralinnhold.
Hos sau behandlet med glukokortikoider i 5 måneder var PTH1R-ekspresjonen økt sammenlignet med de andre gruppene. I tillegg, sammenlignet med andre grupper, var det liten variasjon i uttrykket mellom sauene i gruppen. Selv om det ikke ble sett noen forskjeller i serumkalsiumkonsentrasjoner hos sau behandlet med glukokortikoider i 5 måneder, kan dette kanskje være assosiert med økt virkning av PTH og dets reseptor. Effekten av glukokortikoider på PTH-sekresjon og virkning er uklare. Noen studier på mennesker har funnet at pasienter behandlet med glukokortikoid har økte serum-PTH-konsentrasjoner, sammen med redusert kalsiumabsorpsjon, økt kalsiumutskillelse i urin og redusert benmasse [38,39]. Imidlertid har de fleste studier ikke funnet noen endringer i serum PTH-konsentrasjoner hos mennesker på glukokortikoidbehandling [38,40,41]. En studie har vist at virkningen av glukokortikoider kanskje er på endring av sekresjonen av PTH, med økt pulserende sekresjon av PTH hos glukokortikoidbehandlede individer [4]. Andre har også vist økt PTH1R-ekspresjon i mesenkymale stamceller og osteoblastlignende celler som respons på behandling med deksametason [43,44]. Som sådan er økningen i renal PTH1R-ekspresjon hos sauene behandlet med glukokortikoider i 5 måneder sannsynligvis på grunn av de 5 månedene med glukokortikoidbehandling.
Mens ovariektomi kombinert med en diett med lite kalsium resulterte i minimale endringer i genuttrykk, så det ut til å endre uttrykket av VDR, med ovariektomierte sauer på en diett med mildt lavt kalsium som hadde større VDR-ekspresjon sammenlignet med kontrollsau. Dette er i motsetning til en studie på ovariektomiserte rotter der de som ble matet med en diett med normale kalsiumnivåer viste økt renal VDR-ekspresjon, mens de som fikk en lav kalsiumdiett hadde redusert VDR-ekspresjon [45]. Det er vanskelig i denne nåværende sauestudien å skille ut effekten av ovariektomi på renal ekspresjon av VDR fra effekten av lavkalsiumdietten. Imidlertid var det ingen signifikante forskjeller i serumkalsiumkonsentrasjoner mellom gruppene (med unntak av glukokortikoidgruppen) noe som tyder på at dietten med mildt lavt kalsium hadde minimal effekt, og at effektene på VDR kanskje skyldes ovariektomien. Det vil imidlertid kreves ytterligere forskning for å undersøke disse sammenhengene.
To tidligere studier har undersøkt de separate sammenhengene mellom vitamin D-responsive gener, og fosfatering-relaterte gener i sauenyrer [20,21]. Forholdet mellom vitamin D og fosfateringsveier har imidlertid ikke blitt undersøkt. Interessant nok gjelder de mest signifikante korrelasjonene mellom gener som er rapportert i disse to papirene også for genforholdene i denne nåværende sauestudien, noe som antyder konsistens i resultatene mellom studier og forholdet mellom disse genene.cistanche salsa ekstraktAv de interessante forholdene som ikke tidligere er rapportert, som man kunne forvente gitt dens sentrale rolle i kalsiummetabolismen, var uttrykk for PTH1R sterkt korrelert med CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho og NPT2c. Ekspresjon av klotho var sterkt korrelert med genuttrykk av TRPV5, noe som er i samsvar med annen litteratur som viser at klotho oppregulerer TRPV5 og fremmer renal kalsiumreabsorpsjon [46,47].
Dessverre kunne de forskjellige gruppene ikke separeres basert på vitamin D-responsivt og fosfaterende genuttrykk ved bruk av PCA-analyse. Dette skyldes sannsynligvis hovedbegrensningen til denne studien - den lille utvalgsstørrelsen. Med bare 3-6 dyr i hver av gruppene, har dette sannsynligvis begrenset muligheten til å oppdage forskjeller i genuttrykk mellom grupper.
5. Konklusjoner
Resultatene fra denne studien viser at de mest markante forskjellene i genuttrykk var i renal klotho-ekspresjon hos ovariektomiserte sauer behandlet med glukokortikoider i 2 måneder etterfulgt av en restitusjonsperiode på 5 måneder. Gitt klotho er "anti-aldrings"-hormonet og har en kritisk rolle i kalsium- og fosfatmetabolismen, er det mulig at dette hormonet er kritisk involvert i utvinningen av trabekulær benmineraltetthet og -areal hos behandlede sauer og kan derfor potensielt være et behandlingsmål for osteoporose hos mennesker. Det kreves imidlertid mer forskning på effekten av glukokortikoider og ovariektomi på klotho.
Denne artikkelen er hentet fra Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals
