Ekspresjonsmønster av -Tubulin, Inversin og dets uregelmessige mål-1 og morfologi av primære flimmerhår i normal menneskelig nyreutvikling og sykdommer

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt:Det spatiotemporale uttrykket av -tubulin, inversjon og ujevnt-1 (DVL-1) proteiner assosiert med Wnt-signalveien, og primær cilia-morfologi ble analysert i utviklingen avnyrer(14.–38. utviklingsuke), frisk postnatal (1.5- og 7-år gammel), og patologisk forandret menneskenyrer,inkludert multicystisk dysplastikknyrer(MCDK), fokal segmentell glomerulosklerose (FSGS) og nefrotisk syndrom av finsk type (CNF). Analysen ble utført ved dobbel immunfluorescens, elektronmikroskopi, semikvantitative og statistiske metoder. Cytoplasmatisk samekspresjon av -tubulin, inversjon og DVL-1 ble observert i de proksimale kronglete tubuli (pct), distale convoluted tubuli (dct) og glomeruli (g) i analysert vev. Undernyreutvikling, reduserte det generelle uttrykket for -tubulin, inversjon og DVL-1, mens det i den postnatale perioden økte noe. De høyeste uttrykkene for -tubulin og inversjon karakteriserte dct og g, mens høy DVL-1 karakteriserte pct. -tubulin, inversjon og DVL-1 uttrykksmønstre i MCDK, FSGS og CNFnyrerskilte seg betydelig fra den sunne kontrollen. Sammenlignet med sunnnyrer, patologisk endretnyrerhadde dysmorfe primære flimmerhår. Ulike uttrykksdynamikker for -tubulin, inversjon og DVL-1 undernyreutvikling kan indikere at bytte mellom kanonisk og ikke-kanonisk Wnt-signalering er avgjørende for normalnyremorfogenese. I kontrast, deres forstyrrede uttrykk i patologisknyrerkan være assosiert med unormale primære flimmerhår, som fører til kroniskenyresykdommer.

Nøkkelord:menneskelig nyreutvikling; -tubulin; inversin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; nyre, nyre

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESYKDOM

Introduksjon 

Utviklingen av den definitive eller metanefriskenyrerbegynner i løpet av den femte svangerskapsuken (GW), som deretter kontinuerlig differensierer for å danne de permanente nyrene [1,2]. Signaleringsinteraksjonene mellom det metanefriske mesenkymet og urinrørsknoppen sikrer riktignyreutvikling under nefrogenese. Kort fortalt induserer ureterknoppen mesenkymal-til-epitelial overgang (MET) i det metanefriske mesenkymet, som kondenserer og dannernyrevesikler, etterfulgt av kommaformede og S-formede kropper, og fører til slutt til glomerulidannelse [3]. Til gjengjeld induserer mesenkymet ytterligere forgrening av ureterknoppen. De metanefrie nyrene blir funksjonelle ekskresjonsenheter ved den 11. uken av menneskelig utvikling. Imidlertid fullføres nefrogenese innen den 34. til 36. uken av fosterutviklingen, når flere forgreningshendelser er fullført, men ytterligere differensieringsprosess av nyrene fortsetter inn i den postnatale perioden [4,5]. Forstyrrelser av disse komplekse interaksjonene resulterer i ulike medfødte abnormiteter i nyrene og urinveiene (CAKUT), inkludert dysplasi, polycystisk nyresykdom, multicystisk dysplastisknyresykdom(MCDK), som følgelig fører til kronisknyresykdom(CKD) [6].

I denne studien var vi fokusert på primært flimmerhår-utseende og Wnt-signalveien, som spiller en viktig rolle under normal nefrogenese og inyrereparasjonsprosess, etter akutt eller kronisknyresykdom[7]. Eksistensen av primære cilia under nefrogenese og det store antallet utviklingsmessigenyredefekter som oppstår hos pasienter med ciliær sykdom påpeker at genuin primær ciliafunksjon er nødvendig for normalnyreorganogenese [8,9]. Den primære cilium er en mikrotubuli-basert organell som er viktig for vevshomeostase, der -tubulin er den grunnleggende komponenten [10]. Tap av -tubulin-acetylering i udødeliggjorte celler utløser epitel-til-mesenkymal overgang (EMT), og antyder dermed at acetylert -tubulin er viktig i stabiliseringen av mikrotubuli [11]. Under menneskelig utvikling muliggjør den primære cilia-medierte Wnt-veien celleproliferasjon, differensiering og vevsmorfogenese [12]. Et betydelig antall barn med nedsatt primær ciliafunksjon og forstyrret Wnt-signalvei utvikler CKD, der medfødtnyrelidelser er ansvarlige for nesten halvparten av tilfellene [13]. Den vanligste medfødte cystiske sykdommen hos barn er multicystisk dysplastisknyresykdom(MCDK) [14]. Flere cyster som ikke kommuniserer [15] og mangler normalnyreparenkym er karakteristiske mikroskopiske funn for MCDK. Fokal segmentell glomerulosklerose (FSGS) er en av de vanligste glomerulære sykdommene som fører til sluttstadietnyresykdom[16]. I begynnelsen er FSGS karakteristisk for å være fokal, involverer bare en minoritet av glomeruli og segmental, som involverer endringer i bare et segment av den glomerulære sirkelen [17]. Medfødt nefrotisk syndrom av finsk type (CNF) er en uvanlig autosomal recessivt arvelignyresykdomrepresentert ved et prenatalt utbrudd av omfattende proteintap [18], assosiert med cystogenese av proksimale tubuli [19]. Mange former for primære glomerulære sykdommer utvikler proteinuri som følge av den skadede glomerulære filtrasjonsbarrieren [20]. En betydelig mengde studier antyder at skade og dysfunksjon av podocyttene har iboende roller i patogenesen av CKD-proteinuri [21]. Studien av Vukojevic et al. viser et økt antall cilierte og dårlig differensierte podocytter i CNF [22]. Tidligere studier indikerte at Wnt/-catenin-signalveien har en grunnleggende rolle i å moderere podocyttdysfunksjon med proteinuri [23]. Det er to hovedveier for Wnt-signalering, en kjent som kanonisk -catenin-avhengig og andre ikke-kanonisk, -catenin-uavhengig. Under musnyreutvikling, kanonisk Wnt-signalering er aktiv på de ureteriske knoppspissene og i S-formede legemer [24]. Videre har Wnt via kanonisk signalering relevans for å opprettholde MET under nefrogenese [25]. Binding av proteinkomplekset som inneholder Dvl til membranreseptoren er nemlig obligatorisk for aktivering av Wnt-banen, mens deaktivering av nøkkelkomponentene i denne banen resulterer i tidlig perinatal dødelighet på grunn av fraværet av den nefrogene sonen inyre[25]. 

Et protein som er avgjørende som en molekylær veksling mellom kanoniske og ikke-kanoniske Wnt-signalveier ble funnet å være inversjon [26]. Selv om interaksjoner mellom ulike proteiner med inversjon er blitt oppdaget, er dens eksakte funksjon ennå ikke fullstendig avklart. Inyreepitelceller, er inversjon lokalisert i de primære cilia, og fungerer som et ciliært protein [27]. I tillegg danner inversjon et jevnt kompleks med tubulin i kulturer avnyreceller, og de kolokaliseres in vivo [27,28]. Inversjon ser ut til å spille en essensiell rolle i den tidlige morfogenese av pronephric system og venstre-høyre symmetribestemmelse under utvikling [29,30]. En betydelig hendelse for både kanoniske og ikke-kanoniske Wnt-signalveier i rekrutteringen av cytoplasmatisk Dvl til cellemembranen. Siden tidligere funn viste at inversjon og Dvl kolokaliserer seg i nyreepitelcellene, kan det spekuleres i at inversjon også kan ha en rolle i ikke-kanonisk signalering. Dysregulering av Wnt-signalering mediert av inversjon utløser avvikende spredning i tubuli [31]. Genetiske tester avslørte en DVL-1-mutasjon hos pasienter med autosomalt-dominant Robinow-syndrom, og presenterte heterogene lidelser hos noen pasienter assosiert med urogenital ognyreanomalier [32].

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRE DIALYSEN

Utviklingsuttrykksmønsteret til -tubulin, inversjon og DVL-1 har blitt undersøkt i forskjellige dyremodeller. Dermed har deres uttrykk i pronephros av Xenopus laevis blitt bekreftet ved bruk av intravital mikroskopi [31], mens de ble funnet i cellelinjer avledet fra murine proksimale tubulære celler ved bruk av konfokal mikroskopi og massespektrometri [33]. I tillegg avslørte lysmikroskopi og dobbel immunfluorescens deres tilstedeværelse i seksjoner av musnyrer[34]. Studier på inversjon knockout-mus rapporterte forstørrede, diffuse cyster inyremedulla og cortex assosiert med situs visceral inversjon [35]. Hos mennesker ble mutasjon av inversjon presentert med infantil nefronoftise som førte til svangerskapsavbrudd [36]. Til tross for utallige studier vedrnyre-tubulin, inversjon og DVL-1 ekspresjonsmønster og funksjon, så langt vi vet, har ikke et ekspresjonsmønster av disse proteinene i det humane føtale og postnatale humane vevet blitt undersøkt ennå og oppnådd en korrelasjon. I tillegg har det ikke blitt rapportert bevis som vurderer uttrykk for inversjon og DVL-1 i tidlig menneskelig utvikling. Derfor hadde denne studien som mål å analysere det romlige og tidsmessige uttrykksmønsteret til -tubulin, inversjon og DVL-1 under føtale og postnatale stadier av friske menneskernyrer, så vel som inyrevev av MCDK, FSGS og CNFnyrerfor å etablere en mulig manglende kobling mellom disse enhetene. Vi foreslår nemlig at forstyrrede ekspresjonsmønstre av -tubulin-, inversjons- og DVL-1-proteiner kan være den underliggende cystogenese-prosessen og en unormal funksjon av primære flimmerhår som fører til kroniskenyresykdommer. 

Resultater

Analysen av utviklingsmessig og postnatalnyrevev ble utført på distinkt differensierte strukturer avnyre:proksimale konvoluterte tubuli (pct), distale convoluted tubuli (dct) og glomeruli (g). Under de analyserte utviklingsstadiene og i postnatalnyrevev, -tubulin, inversjon og DVL-1 viste positive uttrykksmønstre, men med forskjeller i intensitet, distribusjon og mengde. Analysen av den patologiskenyrevevav MCDK, FSGS og CNF ble utført på full bildetelling av de positive cellene sammenlignet med frisk nyrevevskontroll.

2.1. Lysmikroskopi, elektronmikroskopi og immunhistokjemi (-Tubulin) av sunt og patologisk endret postnatalt menneskelig nyrevev

2.1.1. Sunn postnatal nyrelys

mikroskopi av postnatalnyrevev viser veldefinertnyrestrukturer, med en tydelig forskjell mellom medulla og cortex og dannelsen av pct, dct og g i den kortikale regionen. Immunhistokjemisk farging av -tubulin avslører tilstedeværelsen av ett primært cilium i midten av den apikale celleoverflaten til hver tubulære celle og i 0.018 prosent ± 0,00014 prosent SD på overflaten av glomerulære celler. Elektronmikroskopi viser tilstedeværelsen av bare ett primært cilium som stammer fra basalkroppen ved den apikale celleoverflaten av tubuli (Figur 1a).

2.1.2. CNF

De fleste av de analyserte g er mindre og lobulerte (80 prosent ), mens minoriteten er av normal størrelse eller hypertrofisk (20 prosent , n=100). Segmentell eller global sklerose av g er funnet, mens pct og dct er delvis utvidet og belagt med atrofisk epitel. Ultrastrukturelt observeres tap av mikrovilli og reduksjon i cellehøyde med multifragmentering av kjerner. I podocytter går fotprosesser diffust tapt. Tubulære primære cilia er uorganiserte, spesielt i de proksimale tubulis cyster, og viser endringer i lengde og cytoplasmatisk posisjon (figur 1b).

2.1.3. MCDK

I nyrevev kan sporadisk umoden og moden g finnes.Nyrevevet er fylt med mange ovale cyster. Søyleepitelceller dekker cystene og er omgitt av løst bindevev. Immunhistokjemisk farging til -tubulin viser flere lange og uorganiserte primære cilia på overflaten av epitelcellene (figur 1c).

2.1.4. FSGS

I 90 prosent av g finnes omfattende segmentell sklerose (n=100), assosiert med interstitiell fibrose og tegn på tubulær skade. Nedgangen i høyden på epitelceller med tap av mikrovilli finnes i elektronmikroskopet, mens endotelceller og mesangiale regioner har vanlig ultrastruktur. I elektronmikroskopet observeres det ekstremt lange og dislokerte (desentraliserte) ciliumet på overflaten av den distale rørformede cellen (Figur 1e). Podocytter viser diffust tap av fotprosesser med omfattende mikrovillusvev. Immunhistokjemisk farging til a-tubulin viser flere lange og uorganiserte primære cilia på overflaten av epitelcellene (figur 1c).

2.2. Immunhistokjemisk farging til 心Tubulin, inversjon og DVL-1- og statistisk analyse av utviklende og sunne postnatale humane nyrer

I 14., 15. og 16. svangerskapsuke ernyrevev presenteres med forskjellige utviklingsstadier av nefrondannelse: fra metanefrie kopper,nyrevesikler stadier for å kommandere S-formede nefroner, og danner dermed den nefrogene sonen i den ytre cortex (Figur 2). Differensiering av pct, dct og g kan observeres i kortikale regioner nærmerenyremedulla. I løpet av 22. GW ble deler av medulla og cortex tydelig karakteristiske, mens i 38. GW,nyrestrukturer fremstår som svært differensierte, og inneholder modne former for pct, dct og g

2.2.1. a-Tubulin

Under utviklingen kommer a-tubulin sterkt til uttrykk i all utviklingnyrestrukturer, primært som visualiserer formen av primære flimmerhår på overflatene av parietale epitelceller i Bowmans kapsel, g, pct og dct. Innenfornyrevev uttrykker 82–97 prosent av pct-cellene a-tubulin, mens uttrykket i dct synker fra 99 prosent til 72 prosent i den 38. GW (se figur 3, tabell 1). Blant ulike utviklingsstadier er det sterkeste uttrykket for a-tubulin funnet i g av 16. GWnyrer, som inneholder 93 prosent av positive celler. 14., 15. og 22. GW (se figur 3a,b, tabell 1), rundt 70 prosent av g-cellene uttrykker a-tubulin, mens det minste uttrykket er observert i 38. GW (p < 0,01)="" med="" 34="" prosent="" av="" de="" positive="" cellene="" (figur="" 3c).="" i="">nyrevev (1.5-år og 7-år gammeltnyrer), er den sterkeste immunreaktiviteten mot a-tubulin observert på den apikale celleoverflaten til pct og dct (figur 3d-f). a-tubulin-ekspresjonen er også tilstede i det perinukleære cytoplasmaet til dct og parietale epitelceller i Bowmans kapsel. a-tubulin flekker allenyrestrukturer med et gjennomsnitt på 50 prosent av positive celler i pct, 94 prosent i dct og 85 prosent i g (figur 3f). Dct-flekker signifikant forskjellig fra pct (p < 0,0001).="" alle="" undersøkte="" strukturer="" farges="" positive="" til="" a-tubulin,="" med="" 77="" prosent="" av="" positive="" celler="" i="" pct,="" 72="" prosent="" i="" dct="" og="" 58="" prosent="" i="" g="">

Figur 3. Immunfluorescensfarging av -tubulin og DAPI i det utviklende og postnatale humane nyrevevet (a–e). nyrer av 14., 15./16., 38. GW (a–c);nyrerav 1.5- og 7-år gamle barn (d,e). Positiv farging av -tubulin (piler) er vist i hver struktur i cortex gjennom utviklings- og postnatale faser (a–e), proksimale convoluted tubuli (pct), distale convoluted tubuli (dct) og glomeruli (g). Detaljer om primære flimmerhår i pct (d) og dct (a–c,e) vises som innfelt med høyere forstørrelse (hvit boks). Forstørrelse ×40, målestokk 100 µm. Fordelingen av -Tubulin-positive celler per struktur gjennom ulike utviklingsstadier og i den postnatale perioden er vist i graf (f). Graf (g) (totalt antall proteinpositive celler i observerte strukturer) viser proteinuttrykk relatert til utviklingstid (lineær regresjon) og sammenheng mellom -Tubulin og DVL-1 gjennom utvikling og modning (Toveis ANOVA etterfulgt av SIDAKs posthoc test). Data er vist som gjennomsnitt ± SD.

Fordelingen av -tubulin-positive celler per struktur gjennom ulike utviklingsstadier og i den postnatale perioden er vist i graf (f). Graf (g) (totalt antall proteinpositive celler i observerte strukturer) viser proteinekspresjon relatert til utviklingstid (lineær regresjon) og sammenheng mellom -tubulin og DVL-1 gjennom utvikling og modning (toveis ANOVA etterfulgt av Sidaks post hoc-test). Data vises som gjennomsnitt ± SD.

2.2.2. Dobbel immunofluorescensfarging til inversjon og DVL-1 og DAPI Nuclear Stain i utviklende og sunne postnatale nyrer Inversjonsuttrykk i utviklende og postnatalt nyrevev

I 14., 15. og 16. GW viser inversjon sterkt granulært uttrykk i g, og mildt granulært uttrykk i cytoplasmaet til pct og dct (Figur 4a,b), mens det i 22. og 38. GW (se Figur 4c) positivt uttrykk observeres i g (tabell 1). Mellom 14. og 22. GW, rundt 50 prosent av celleekspressversjonen. I 16. GW uttrykker pct-celler inversjon i 73 prosent av cellene, mens de reduseres til 29 prosent av cellene (p < 0,05)="" i="" 38.="" gw="" (se="" figur="" 4f).="" positivt="" uttrykk="" for="" inversjon="" finnes="" i="" omtrent="" 80–90="" prosent="" av="" dct-="" og="" g-cellene="" i="">nyrevev av 14. og 16. GW, med det laveste uttrykket i dct av 38. GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" henholdsvis)="" hvor="" 66="" prosent="" av="" cellene="" var="" positive.="" i="">nyrer, pct flekker sterkt ved den apikale cellemembranen, mens dct flekker mest ved basalcellemembranen og i det perinukleære cytoplasmaet (Figur 4d,e). På det stadiet fant vi uttrykk for inversjon i alle undersøktenyrestrukturer, inkludert pct, dct og g, med et gjennomsnittlig uttrykk for positive celler på 92 prosent for pct, 88 prosent for dct og 90 prosent for g (figur 4f). Vi observerte ikke en signifikant forskjell i signalstyrke for inversjonsuttrykk mellom strukturer. Det høyeste uttrykket for inversjon finnes i g, med et gjennomsnitt på 94 prosent av positive celler (figur 4f). En signifikant forskjell er funnet ved å sammenligne fargingen av g (hvor 94 prosent av cellene farges positivt) med pct, hvor 58 prosent av cellene farges positivt (p < 0.01)="" og="" med="" dct,="" hvor="" 49="" prosent="" av="" cellene="" er="" positiv="" (p="">< 0,0001,="" figur="">

DVL-1 uttrykk i utviklende og postnatalt nyrevev

Mild til sterk ekspresjon av DVL{{0}} er observert i cytoplasmaet til pct, dct og g i fosterperioden (se figur 4a–c, tabell 1). I pct uttrykker 76–86 prosent av cellene DVL-1 i 14.–22. GW, mens i 38. GW er det 57 prosent av positive celler (Figur 4g). I dct av 14. og 15. GW uttrykker 68–70 prosent av cellene DVL-1, i 16. og 22. GW synker antallet positive celler til 42–5{{41} } prosent, mens i det 38. GW-uttrykket (p < 0,001),="" observeres="" i="" 19="" prosent="" av="" dct-cellene.="" uttrykk="" av="" dvl-1="" øker="" i="" g="" gjennom="" fosterstadier:="" i="" 14.="" gw="" er="" det="" 6="" prosent,="" mens="" det="" i="" 15.,="" 16.="" og="" 22.="" gw="" øker="" til="" 10="" prosent="" (p="">< 0,01).="" i="" 38="" gw="" uttrykker="" 14="" prosent="" av="" g-cellene="" dvl-1="" (figur="" 4="" g).="" i="" den="" postnatale="" perioden="" er="" dvl-1-immunreaktiviteten="" spredt="" i="" cytoplasmaet="" (tabell="" 1)="" til="" både="" pct="" og="" dct="" (figur="" 4d,e).="" signalet="" finnes="" i="" alle="" de="" undersøkte="" strukturene,="" men="" mest="" i="" det="" perinukleære="" cytoplasmaet.="" intensiteten="" til="" dvl-1-uttrykk="" er="" signifikant="" høyere="" i="" pct="" sammenlignet="" med="" dct="" og="" g="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" prosent="" av="" cellene="" i="" pct="" og="" dct="" uttrykker="" dvl-1,="" mens="" i="" g="" er="" 21="" prosent="" av="" cellene="" positive="" (figur="" 4="" g).="" vi="" fant="" ikke="" en="" signifikant="" forskjell="" mellom="" prosentandelen="" av="" immunreaktive="" celler="" i="">nyrestrukturer. Prosentandelen av DVL-1-immunreaktive celler er henholdsvis 34 prosent i pct, 36 prosent i dct og 27 prosent i g (figur 4g).

Figur 4. Dobbel immunfluorescensfarging av inversjon (grønn), DVL-1 (rød) og DAPI (blå) i det utviklende og postnatale nyrevevet (14.–38. GW, 1.5- og {{6 }}år gammelt nyrevev). Positiv farging (piler) vises i hver struktur gjennom alle utviklingsfaser (a–c) og den postnatale perioden (d,e). Sammenslåtte mikrofoner sammen med strukturer av interesse i cortex: proksimale kronglete tubuli (pct), distale convoluted tubuli (dct) og glomeruli (g). Kolokalisering av inversjon/DVL-1 (pilspiss) vises i sammenslåtte mikrofotografier. Negative kontrollfarginger vises som innsettinger ved inversjon og DVL-1 (a). Erytrocytter kan sees som sterkt fargede celler nær dct. Detaljer vises som innlegg med høyere forstørrelse. Forstørrelse ×40, målestokk 100 µm. Dynamisk positiv cellefordeling av inversjon og DVL-1 i nyrestrukturer (pct, dct, g) gjennom utviklingsstadier og postnatale stadier er vist i grafer (f,g). Graf (h) viser proteinuttrykk (totalt antall positive celler i strukturer) relatert til utviklingstid (lineær regresjon) og sammenheng mellom inversjon til DVL-1 gjennom utvikling og modning (toveis ANOVA etterfulgt av Sidaks post hoc-test ). Data vises som gjennomsnitt ± SD.

Samuttrykk av inversjon og DVL-1 observeres i cytoplasmaet til nyrene g, dct og pct under utvikling (se figur 4a–c, sammenslåing). I den postnatale perioden karakteriserer co-ekspresjon av inversjon og DVL-1 ulike cellulære rom av tubulære celler i pct og dct, mens co-ekspresjon i g karakteriseres av den sterke prevalensen av inversjonsuttrykk (se figur 4d, sammenslåing ). I 7-året postnatale nyrer, er samuttrykk av inversjon og DVL-1 sett i tubulære celler av dct og pct, og i g der inversjonsuttrykk dominerer litt sammenlignet med DVL-1 (Figur 4e, slå sammen).

2.2.3. Forskjeller i uttrykk for -Tubulin, inversjon og DVL-1 mellom ulike utviklingsnyrestadier og postnatale nyrer

Antall -tubulin-positive celler i pct av føtalt nyrevev var statistisk signifikant høyere sammenlignet med 7-år gamle barns nyrevev (13. (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" og="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" av="" tidlige="" fosterstadier="" (13.,="" 15.,="" 16.="" og="" 22.="" gw)="" hadde="" flere="" positive="" celler="" sammenlignet="" med="" 38.="" gw="" og="" 1.{19}}år="" gamle="" barns="" nyrevev="" (henholdsvis="" p="">< 0,0001,="" figur="" 3f).="" når="" ulike="" utviklingsstadier="" ble="" sammenlignet,="" fant="" vi="" lavere="" nivåer="" av="" inversjonsuttrykk="" i="" pct="" av="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" og="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" gw="" sammenlignet="" med="">nyrevev fra det 1.5-år gamle barnet. I dct ble det funnet statistisk signifikant lavere uttrykk for inversjon ved å sammenligne 16. GW med 38. GW nyrevev (p < 0.0001).="" videre="" ble="" lavere="" uttrykk="" for="" inversjon="" i="" dct="" observert="" i="" 7-år="" gammelt="" barns="" nyrevev;="" sammenligne="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" begge),="" 16.="" og="" 1.5-år="" gammelt="" nyrevev="" med="" dct="" av="" 7-år="" gammelt="" nyrevev="" (p="">< 0,00001,="" henholdsvis="" figur="" 4f).="" det="" observerte="" signalet="" til="" dvl-1-uttrykk="" gjennom="" de="" forskjellige="" stadiene="" avslørte="" at="" prosent="" av="" den="" 13.="" (p="">< 0,01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Forholdet mellom uttrykk for -Tubulin og inversjon til DVL-1 i utviklende og postnatalt nyrevev

-Tubulin- og inversjonsuttrykk ble sammenlignet med DVL-1-uttrykk gjennom utviklingsstadier og i postnatalt nyrevev. -tubulin hadde statistisk høyere uttrykk i alle observerte stadier, sammenlignet med uttrykket av DVL-1 (p < 0.001,="" figur="" 3g).="" gjennom="" alle="" de="" observerte="" stadiene="" hadde="" inversjon="" et="" høyere="" uttrykk="" sammenlignet="" med="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" figur="" 4="">

2.2.5. Sammenligning av immunhistokjemisk farging med -Tubulin, versjon og DVL-1- og statistisk analyse av patologisk endret nyrevev (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Forskjellen mellom -tubulinfarging i MCDK, FSGS og CNF var statistisk signifikant i sammenligning til sunt postnatalt nyrevev som kontrollgruppe (henholdsvis p < 0.0001).="" dysplastisk="" nyrevev="" hadde="" signifikant="" høyere="" ekspresjon="" sammenlignet="" med="" kontrollgruppen,="" mens="" fsgs="" og="" cnf="" viste="" signifikant="" lavere="" ekspresjon="" av="" -tubulin="" sammenlignet="" med="" sunn="" kontroll="" (figur="">

Inversjon

Inversjon uttrykkes i cytoplasmaet til uorganiserte epitelceller og tubuli av MCDK (Figur 5a). I CNF karakteriserer inversjonsuttrykk g og dct, mens det viser mindre intensivt i pct-cyster (Figur 5b). I FSGS er inversjon sterkt uttrykt i g og dct, men mindre intensivt i pct-cyster (Figur 5c). Romlig uttrykk for inversjon viste en statistisk signifikant høyere fargingsrate i friskt nyrevev (figur 5g) sammenlignet med MCDK, FSGS og CNF (p < 0.0001,="">

Figur 5. Dobbel immunfluorescensfarging av inversjon (grønn), DVL-1 (rød) og DAPI (blå) i patologisk nyrevev i MCDK (a), CNF (b) og FSGS (c): tubuli (t) , glomeruli (g), pct cyste (c), høyden på pct epitelceller (*). Struktur og cellesamlokalisering av inversjon og DVL-1 (pilspisser) er vist i de sammenslåtte seksjonene med detaljer i innsettinger med høyere forstørrelse. Negative kontrollfarginger vises som innsettinger ved inversjon og DVL-1 (a). Forstørrelse ×40, målestokk 10{{20}} µm. Forholdet mellom -tubulin (d) og inversjon (e) til DVL-1 uttrykk i MCDK, FSGS og CNF (toveis ANOVA etterfulgt av SIDAKs post hoc test). Forskjellen i epitelcellehøyde (f) til FSGS, CNF og MCDK pct sammenlignet med sunn kontroll (enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc test, n=50). Forskjellen i total positiv celleprosent av -tubulin, inversjon og DVL-1 i MCDK, CNF og FSGS sammenlignet med sunn kontroll (g–i), enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test). Data vises som gjennomsnitt ± SD. Signifikante forskjeller er indikert med p-verdi (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" er="" svært="" mildt="" uttrykt="" bare="" i="" uorganiserte="" tubuli="" av="" mcdk,="" mens="" i="" cnf="" karakteriserer="" uttrykket="" dct="" og="" g="" (figur="" 5a,b).="" i="" fsgs="" er="" dvl-1="" observert="" som="" mild="" reaktivitet="" i="" g,="" dct="" og="" pct="" (figur="" 5c).="" sunt="" nyrevev="" farget="" til="" dvl-1="" viste="" en="" signifikant="" høyere="" grad="" av="" farging="" (figur="" 5="" h)="" i="" motsetning="" til="" mcdk="" og="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" begge),="" mens="" ingen="" signifikant="" forskjell="" ble="" funnet="" for="">

2.2.6. Forholdet mellom uttrykk for -Tubulin og inversjon til DVL-1 i patologisk endret nyrevev (MCDK, CNF, FSGS)I MCDK, FSGS og CNF er -tubulin farget betydelig høyere enn DVL-1 (p < 0.0001,="" henholdsvis="" figur="" 5d).="" inversjon="" farget="" betydelig="" høyere="" sammenlignet="" med="" dvl-1="" i="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" og="" i="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" figur="">

2.2.7. Forskjeller i epitelcellehøyde til proksimale snirklete tubuli mellom sunn kontroll og patologisk endret nyrevev (MCDK, CNF, FSGS)Høyden på pct-epitelceller (n {{0}} per gruppe) ble sammenlignet mellom tubuliceller i friskt nyrevev og patologisk endret nyrevev (Figur 5b,c,f). Gjennomsnittlig epitelcellehøyde i HC var 12,91 µm ± 1,847 µm og var signifikant høyere sammenlignet med CNF og FSGS (p < 0.0001,="" henholdsvis).="" gjennomsnittlig="" cellehøyde="" i="" cnf="" pct="" var="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" mens="" i="" fsgs="" var="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" pct-epitelceller="" av="" mcdk="" viste="" ikke="" signifikante="" endringer="" i="" høyde="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" sammenlignet="" med="">

2.2.8. Forskjeller i primær cilia-lengde mellom sunn kontroll og patologisk endret nyrevev (MCDK, CNF, FSGS)

Primær ciliumlengde (n= 50 per gruppe) ble sammenlignet mellom HC og patologisk endret nyrevev (figur 6c). Sunt nyrevev og MCDK ble farget med -tubulin for å sikre spesifisiteten til -tubulin ciliumfarging (figur 6a,b). I friskt nyrevev var primært cilium 5,065 µm ± 1,229 µm langt, mens i MCDK var CNF og FSGS signifikant lengre (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Diskusjon

Målet med vår studie var å undersøke et immunhistokjemisk uttrykk av a-tubulin, inversjon og DVL-1 hos fosternyrevev og postnatalt nyrevev. Videre ønsket vi å undersøke om uttrykket og fargemønsteret til a-tubulin, inversjon og DVL-1 er forstyrret i forskjellige nyresykdommer sammenlignet med sunn kontroll. Til tross for den omfattende interessen fra de andre forskerne for rollen til a-tubulin, inversjon og DVL-1 under nyreutvikling, har de fleste av de tidligere studiene brukt dyr eller in vitro eksperimentelle modeller. Så vidt vi er kjent med, er dette den første studien som hadde vist uttrykk og lokalisering av a-tubulin sammen med inversjon og DVL-1 i føtale og postnatale humane nyrer, og som hadde utforsket ekspresjonen av nevnte proteiner i nyrene sykdommer, som MCDK, FSGS og CNF. Vi analyserte også endringer i cilia-lengde og utseende ved lys- og elektronmikroskopi, da vår tidligere studie allerede har indikert at ciliære forstyrrelser kan være assosiert med cystogenese i FSGF og CNF [19].

I den kanoniske Wnt-signalveien rekrutterer bindingen av Wnt-ligander til reseptorer Dvl [37]. Prosesser av MET og den plane cellepolaritetsveien under de tidlige stadiene av nyremorfogenese kontrolleres av Wnt-signalering. Ved å formidle Wnt-banen kontrollerer de primære cilia celleproliferasjon, differensiering og vevsmorfogenese [12] gjennom organisering av cellecytoskjelettet og celleorientering samt tubulær strukturforlengelse [2,38]. I vår studie var -tubulin, inversjon og DVL-1 alle tilstede i nyrestrukturer, og alle kolokaliserte ikke bare under fosterets nyreutvikling, men også i nyrevevet fra 1.5- og {{9 }}år gamle barn. Disse funnene er i samsvar med aktiveringen av Wnt-signalveien som ble bevist å forekomme allerede under tubulogenese [39]. I tillegg har resultatene våre avslørt at uttrykket av -tubulin og inversjon er gjensidig relatert til DVL-1 og at de viser en statistisk signifikant forskjell mellom uttrykksmønstrene deres. Dette er i samsvar med eksperimentelle modeller, ettersom mutasjonen av hele Dvl-proteinfamilien i mus resulterer i mangel på gastrulasjonsprosess, mens mutasjoner som ikke inkluderer hele proteinfamilien viser defekter i plassering av nodal cilia sammen med organdefekter [40] . Tidligere funn antydet at inversjon har en rolle i cellemigrasjon i Xenopus pronephros. Siden det segmentet korrelerer med pattedyrløkken til Henle og distale tubuli, kan dette indikere viktigheten av inversjon under nyreutvikling også hos mennesker [41]. I samsvar med dette premisset har tidligere studier avslørt at mutasjon av inversjonsgenet kan resultere i nefronoftise type 2, som er mediert av unormal DVL-1-ekspresjon [42]. Til tross for at primærciliums rolle er kontroversiell i reguleringen av Wnt-signalveien, fant vi at -tubulin kolokaliserte med inversjon og DVL-1 i de analyserte nyreprøvene. Videre har tidligere studier påpekt at det primære cilium sammen med inversjon regulerer nedbrytningen av Dvl ved å påvirke Wnt-signalveien [43]. Ved humane nyresykdommer assosiert med utvikling av cyster, er unormal lokalisering og funksjon av primære cilia observert [19]. Tilsvarende bekreftet denne studien også morfologiske endringer av primær ciliadannelse i patologiske tilstander som CNF, FSGS og MCDK. Tidligere funn anerkjente at overaktivering av den kanoniske Wnt-banen etter nyreskade fører til irreversible strukturelle endringer av nyrevev [44]. Tvert imot, primær cilium fikk rollen som å bytte fra kanonisk til ikke-kanonisk Wnt-vei for å hjelpenyrereparere. Videre ble overaktivering av den kanoniske Wnt-banen i transplantert nyrevev funnet å ha en positiv prediktiv verdi mot nyrefibrose [45]. Hvis den kanoniske Wnt-veien råder på bekostning av den ikke-kanoniske, støtter den teorien om nyrefibrose som utfall. Våre funn av senket -tubulin og inversjonsuttrykk i CNF og FSGS antyder inaktivitet av den ikke-kanoniske Wnt-veien, spesielt ettersom begge forholdene har en tendens til å føre til sluttstadietnyresykdom.Det antas nemlig at normal lokalisering og funksjon av primær cilium kan være en faktor for å opprettholde en vanlig Wnt-vei og derfor en forutsetning for normal utvikling. I motsetning til dette, hvis Wnt-banen er forbedret, kan det resultere i dysregulert celleproliferasjon og differensiering som fører til karsinogenese [46]. Som tidligere beskrevet er den kanoniske Wnt-banen obligatorisk for initiering av MET og dannelse av nefronet, mens forstyrrelsen kan føre tilnyrehypoplasi [47]. Resultatene våre støtter denne ideen ved å avsløre det laveste uttrykket av DVL-1 med det høyeste uttrykket av -tubulin i MCDK sammenlignet med sunn kontroll. Disse resultatene kan innebære den laveste aktiveringen av den kanoniske Wnt-banen, som kan være en underliggende årsak til fravær av nefrondannelse. I motsetning til dette kan det høyeste -tubulin-uttrykket med det laveste DVL-1-uttrykket forklare funnene til flere cyster ettersom det ikke er noen organisert forlengelse og cellepolarisering styrt av den ikke-kanoniske Wnt-banen. Tidligere studier hadde også vist at inversjon hemmer den kanoniske Wnt-signalveien ved å målrette Dvl for degradering [26]. Dette trinnet i deres interaksjon ble funnet å være nødvendig for å hemme kanonisk Wnt-signalering i opprettholdelsen av normal rørformet forlengelse og posisjonering. Inversjonsmutasjon resulterer i oppregulering av kanonisk Wnt-signalering, som senere provoserte unormal spredning i tubulære celler. Dette trinnet har vist seg å være avgjørende i cystogenese [42], mens knockout av inversjon hos mus fører til polycystisk nyresykdom [48]. I følge teorien omnyrecystogenese regnes inversjon som et "mykoprotein", på grunn av dets lokalisering til primære flimmerhår inyrerørformede celler. I vår studie var primære flimmerhår tilstede på den apikale celleoverflaten til tubulære celler i alle de analyserte stadiene, mens under fosterstadier var ekspresjonen av -tubulin sterkere enn i den postnatale perioden.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESMERTER

Tidligere studier har vist at primær flimmerhårfunksjon kan påvirkes av dysregulering av -tubulin under utvikling, noe som kan føre til cystogenese, unormal nyreutvikling og mulig kronisk nyresykdom i barndommen [31,49]. Dette er i samsvar med våre funn av forkortede og dysmorfe primære cilia observert i MCDK eller med multiple og ekstremt forlengede eller dislokerte cilia funnet i utvidede tubuli av CNF og FSGS sammenlignet med sunn kontroll. For å støtte det faktum at de kanoniske og ikke-kanoniske Wnt-signalveiene, regulert av primære cilia, anses å være obligatoriske for normal nyreutvikling, fant vi signifikant lavere farging av inversjon og DVL-1 i MCDK sammenlignet med sunn kontroll [31,49]. Ulik ekspresjonsmønsterdynamikk av -tubulin, inversjon og DVL-1 gjennom forskjellige nyreutviklingsfaser kan indikere bytte mellom den kanoniske og ikke-kanoniske Wnt-signalveien under normal nyremorfogenese. Vi foreslår at deres utveksling bestemmer transkripsjon i kanonisk vei eller rekkefølge av cellemigrasjon og polarisering under nyreutvikling i en ikke-kanonisk signalvei. Deres balanse og uttrykk i alle undersøkte nyrestrukturer antyder deres viktige rolle i normal nyreutvikling. Under normal nyreutvikling (fra 13. GW til 38. GW) synker det totale uttrykket av -tubulin, inversjon og DVL-1 ettersom nyrevev får moden morfologi. Hos 1.5- og 7-år gammelt nyrevev viste -tubulin og inversjon en svak økning i uttrykket, noe som støtter det faktum at den ikke-kanoniske Wnt-banen forblir aktiv etter fødselen. Tvert imot, DVL-1 vedvarer med redusert uttrykksmønster, noe som kan bidra til en konklusjon om at den kanoniske Wnt-veien er stilnet i sunt nyrevev. Som et resultat av patologiske nyretilstander, kan epitelceller i nyren reagere med gjenopptreden av EMT og fibrose [50] assosiert med reaktivering av den kanoniske Wnt-banen [44]. Derfor kan forstyrrelser av -tubulin, inversjon og DVL-1 funnet i syke nyrer være den underliggende patologiske mekanismen og et resultat av overgangen fra ikke-kanonisk til kanonisk Wnt-vei i den utviklende nyren, som henviser til vekslingen mellom reversibel til irreversibel nyre skader. Videre endringer i deres prenatale og postnatalenyreuttrykksmønster kan være assosiert med svekkelse av nyrefunksjonen i voksen alder, noe som fører til medfødte sykdommer og kronisk nyresvikt.

4. Materialer og metoder

4.1. Menneskelige prøver

Prøver av føtalt nyrevev ble samlet etter tap av graviditet ved 14., 15., 16., 22. og 38. GW ved avdelingen for gynekologi og obstetrikk ved Universitetssykehussenteret Split. Alt ervervet fostermateriale ble undersøkt av en patolog, og kun vev uten tegn til abnormiteter, maserasjoner eller intrauterin død og med normalt karyogram ble brukt til studien. Medisinske journaler av mødre ble undersøkt før prøvetaking, og i tilfelle helseproblemer som kan påvirke graviditetsutfallet, ble nyrevev ekskludert fra studien. Modenhet ble bestemt av hodeomkrets, abdominal omkrets og lårbenslengde [51] i samsvar med pasientenes menstruasjonskalendere. Prøver av 1.5- og 7-år gammelt nyrevev ble tatt etter utilsiktede dødsfall. Prøvene ble innhentet ved avdeling for patologi ved Universitetssykehussenteret Split. Prøvene av det multicystiske dysplastiske nyrevevet (MCDK) ble tatt etter tap av graviditet, fokal segmentell glomerulosklerose (FSGS) og nefrotisk syndrom av finsk type (CNF) ble tatt på grunn av nefrektomi. Alt innhentet materiale ble undersøkt og evaluert av en patolog, som klassifiserte diagnosene. Studieprotokollen ble godkjent av den etiske komiteen ved University of Split School of Medicine (20. mai 2016) i samsvar med Helsinki-erklæringen og dens oppdateringer (klassifiseringsnr.: 003-08/16-03/0001, registernr: 2181-198-03-04-16-0024, 20. mai 2016) [52].

4.2. Immunhistokjemi

Innsamlet vevsprøvefiksering ble behandlet med 4 prosent paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS) i 24 timer ved 22 ◦C. Etter dehydrering i 100 prosent etanol ble prøver innebygd i parafin, som beskrevet tidligere [53]. Prøver ble skåret i 5 µm tykke seksjoner ved bruk av en mikrotom og deretter montert på objektglass. For å bekrefte vevsbevaring ble hver 10. seksjon farget med hematoksylin og eosin [54]. Depart-feminisering og immunhistokjemi ble utført som tidligere beskrevet [2,55,56]. Etter skylling i PBS, ble objektglass inkubert over natten med primære antistoffer i et fuktig kammer ved 22 ◦C (StainTray lysbildefargingssystem; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Primære antistoffer som ble brukt var kanin monoklonalt anti-alfa tubulin antistoff (fortynning 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, Storbritannia), kanin polyklonalt anti-inversjonsantistoff (fortynning 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, Storbritannia), mus monoklonalt DVL -1 antistoff (1:150 fortynning; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) og kanin polyklonalt anti-gamma tubulin antistoff (for å verifisere primær cilia-spesifikk farging med alfa- tubulin, 1:500 fortynning; ab11321, Abcam, Cambridge, Storbritannia). Etter skylling i PBS ble sekundære antistoffer administrert i en time som oppført: esel anti-kanin IgG H&L, Alexa Fluor 488 (fortynning 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, Storbritannia) og geit anti-mus IgG H&L, TRITC (fortynning) 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ble brukt til farging av kjernene og etter en 2-min inkubering ble det brukt objektglass ble vasket i PBS og dekket med monteringsmedium og dekkglass. Uspesifikk farging ble forhindret ved å bruke proteinblokk (ab64226; Abcam, Cambridge, Storbritannia) før den primære antistoffpåføringen. Som negativ kontroll ble det utført en pre-adsorpsjonstest, mens spesifisiteten til de sekundære antistoffene ble kontrollert ved å utelate de primære antistoffene fra fargingsprosedyrene.

4.3. Elektronmikroskopi

Fiksering avnyrevev ble utført i 4 prosent paraformaldehyd i 24 timer, etterfulgt av etterfiksering i 1 prosent osmiumtetroksid i 1 time. Dehydreringsprosessen ble utført med etanolserier og avsluttet med innstøping i LX 112 harpiks [22]. En-mikrometer tynne seksjoner ble farget med toluidinblått og studert for å velge ultratynne seksjoner. Ultratynne snitt med en tykkelse på 0.05 mikrometer ble undersøkt etter farging med uranylacetat og blycitrat. JEOL 1200 EX mikroskop ble brukt for å ta mikrofotografiene.

4.4. Genetisk analyse

Som tidligere beskrevet [19], ved bruk av leukocytter fra det perifere blodet, ble genomisk DNA ekstrahert. En homozygot missense-mutasjon i NPHS1-genet ble funnet (c.1096A > C; p.Ser366Arg) som bekreftet diagnosen medfødt nefrotisk syndrom av finsk type (CNF) [57].

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREINFEKSJON

4.5. Dataanalyse

Seksjonsanalysen ble utført på et FL-fluorescensmikroskop ved bruk av 3 FL-fluorescenskanaler (Olympus BX51, Tokyo, Japan). Bildene ble tatt med digitalkamera DP71 (Olympus, Tokyo, Japan) med høyeffekts (×40) forstørrelse. Bare dennyrecortex som inneholdt proksimale convoluted tubuli (pct), distale convoluted tubuli (dct) og glomeruli (g) var av interesse. Bilder ble deretter behandlet av ImageJ-programvare (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA, https://imagej.nih.gov/ij/ (åpnet 15. oktober 2018), 1997–2021. ) og Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, California, USA) for videre evaluering. Før celletelling ble delt kanaler ImageJ-verktøyet brukt. Etterpå ble det originale immunfluorescensmikroskopiske bildet trukket fra den røde eller grønne kanalen (avhengig av hva den opprinnelige kanalen var) ved å bruke bildekalkulatoren ImageJ-verktøyet for å forhindre signallekkasje. Verdier under terskelnivå 50 ble vurdert som negative. Vi telte immunreaktive signaler i celler med minst 20 strukturer (pct, dct eller g) per stadium eller totalt positivt antall celler per mikrofoto av multicystisk dysplastikknyrevev, FSGS og CNF. Vi klassifiserte celler som positive hvis immunfluorescenssignalet akkumulerte på et hvilket som helst nivå av membranen, cytoplasmaet eller kjernen over verdi 50 målt på ImageJ-programvare ved bruk av terskelkommando. Negative celler ble kategorisert som celler med fravær av immunreaktivitet. To uavhengige etterforskere analyserte dataene.

4.6. Semikvantitativ analyse

Intensiteten til -tubulin, inversjon og DVL-1-fargesignal ble evaluert av to uavhengige forskere som brukte ImageJ-programvare. Total signalintensitet ble målt etter at bildet ble satt til 8-bittype; etterpå ble intensiteten av markørfarging evaluert i 20 pct, dct og g ved å måle det skisserte området av strukturen. Hvis resultater mellom evaluatorer var forskjellige, avklarte en tredje uavhengig forsker tvilen. Maksimal signalintensitet for -tubulin var 84.125 ± 3.214 SD, for inversjon var 71.50 ± 2.715 SD og for DVL-1 80.916 ± 1.875 SD. Den høyeste metningen av signalfarge på mikroskopfotografiene ble markert som 3 (66,66–99,99 prosent av total signalbildeintensitet), etterfulgt av 2 (33,33–66,66 prosent) for den mellomliggende signalintensiteten og 1 (0,33 prosent –33,33 prosent) for lav signalintensitet (tabell 1.).

4.7. Statistisk analyse

For å bestemme forskjeller mellom stadier og strukturer ble Kruskal–Wallis-testen utført, etterfulgt av Dunns post hoc ved bruk av GraphPad Prism-programvare (Graphpad Software Inc., San Diego California, USA, www.graphpad.com (åpnet 15. oktober) 2018.)). Antall positive celler ble uttrykt i prosent som middelverdi ± standardavvik (SD), mens statistisk signifikans ble bekreftet ved p < 0,05.="" antall="" analyserte="" strukturer="" var="" 4200="" i="" 35="" prøver,="" med="" et="" samlet="" antall="" på="" 135="" 256="" celler="" talt.="" vi="" brukte="" 2-way="" anova="" med="" sidaks="" post="" hoc-test="" for="" å="" teste="" forskjeller="" i="" uttrykk="" for="" -tubulin,="" inversjon="" og="" dvl-1="" i="" ulike="" utviklingsstadier.="" for="" å="" studere="" proteinuttrykk="" angående="" utviklingstid="" brukte="" vi="" lineær="" regresjon.="" enveis="" anova="" etterfulgt="" av="" tukeys="" post="" hoc-test="" ble="" brukt="" til="" å="" utforske="" forskjellene="" i="" uttrykk="" for="" -tubulin,="" inversjon="" og="" dvl-1="" hos="">nyrevev sammenlignet med vev av MCDK, FSGS og CNF. Forskjeller i uttrykk for proteiner mellom MCDK, FSGS og CNF ble undersøkt med 2-måte ANOVA etterfulgt av Sidaks post hoc-test. Enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test ble brukt til å evaluere forskjellene i cilia-lengde og epitelcellehøyde på pct mellom sunn kontroll og patologisknyrevev. Data ble vist som middelverdi ± standardavvik (SD) med statistisk forskjell bekreftet ved p <>