Akutt hudeksponering for ultrafiolett lys utløser nøytrofilmediert nyrebetennelse

Vi og andre har vist at UV-lys induserer rask nøytrofil infiltrasjon i huden (6, 7). Selv om nøytrofiler er store bidragsytere til betennelse på lokale skadesteder, har det nylig blitt erkjent at nøytrofiler også kan hjem til organer fjernt fra det primære betennelsesstedet (8–10), hvor de bidrar til lungevevsskade via produksjon av reaktivt oksygen arter (ROS) (11) eller aktivere det adaptive immunsystemet i lymfeknutene og benmargen (9, 12). Ved SLE antas nøytrofiler å spille en viktig rolle i både lokale og systemiske sykdommer. Nøytrofiler er tilstede i hudlesjonene til SLE-pasienter (13, 14) og inyrevev av pasienter med LN (15, 16). Høy ekspresjon av en nøytrofil gensignatur er en sterk prediktor for aktiv sykdom, inkludert LN og kutane utbrudd (17, 18). Proinflammatoriske lavdensitetsgranulocytter (LDG) øker spesielt hos pasienter med hudsykdom (19). Mens disse funnene impliserer nøytrofiler i lokal vevsskade i SLE, om nøytrofiler gir den patogene koblingen mellom hudbetennelse ognyreskadeer ikke forstått.

For å belyse hvordan hudeksponering for UV-lys påvirkernyreog rollen nøytrofiler spiller i disse prosessene, evaluerte vi endringer inyregenuttrykk i samspill med nøytrofil migrasjon. Vi fant at akutt hudeksponering for UV-lys stimulerer inflammatoriske prosesser inyre,inkludert uttrykk for endoteliale adhesjonsmolekyler, inflammatoriske mediatorer, skademarkører og forbigående proteinuri. Spesielt fant vi at nøytrofiler migrerte tilnyreetter UV-lyseksponering på en IL-17A-avhengig måte, lokalisert til de tubulointerstitielle (TI) områdene der de viste proinflammatoriske fenotyper. Blokkering av nøytrofilhandel ved anti-G-CSF immunoglobulin (IgG) behandling opphevetnyreinflammasjon og forhindret oppregulering av tubulære skademarkører. Sammen viser disse funnene at hudeksponering for UV-lys utløser subklinisknyreinflammatoriske og skadelige prosesser mediert av nøytrofiler.

Resultater

Hudeksponering for UV-lys forårsaker subklinisk nyreskade.Eksponering for sollys har vært assosiert med forverring av systemiske symptomer og forekomst av sykdomsutbrudd hos SLE-pasienter, inkludert nefritt (2–4). Derfor spurte vi først om akutt steril betennelse i huden utløst av en enkelt eksponering for ultrafiolett B (UVB) lys (500 mJ/cm2) hos svarte 6 (B6) mus fører til endringer inyre, inkludert betennelse, skade og proteinuri (fig. 1A). Lungen ble valgt som kontrollorgan, da det ikke er rapportert noen sammenheng mellom lysfølsomhet og klinisk lungesykdom ved SLE. Totalt 500 mJ/cm2 UVB-lys i B6-mus har blitt definert som to minimale erytematøse doser (20), referansedosen som brukes til å protestere på mennesker (21). Genekspresjonsanalyser av perfusertnyre tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-foldnyreinduksjon i s100A9, en nøytrofil mediator assosiert mednyreskade(22), samt økt s100A6-ekspresjon, et kalsiumbindende protein assosiert med tubulær skade (23) (fig. 1 D og E). Mens s100A9-induksjon ble oppdaget i lungen, forble s100A6-genekspresjonen uendret i lungen (SI vedlegg, fig. S1). Den inflammatoriske responsen inyrevar også assosiert med en tidlig økning i il-1-uttrykk (dag 1 og 2 etter UV), mens det var minimal eller ingen endring i tnf eller il-6 (fig. 1F). Il-1-uttrykk ble ikke påvist i lungen før 6 dager etter hudeksponering for UVB-lys (SI vedlegg, fig. S1). Rask induksjon i cxcl12-ekspresjon, et kjemokin utskilt av glomeruli og tubuli og involvert inyreskade(24), ble også funnet inyremen ikke lungen (fig. 1G og SI vedlegg, fig. S1). Derfor starter UVB-lys-utløst hudskade rasktnyreproinflammatoriske prosesser, mens færre endringer observeres i lungen.

I tillegg til den proinflammatoriske responsen observert inyre,både proteinuri og urinalbumin/kreatinin-forholdet økte de første dagene etter hudeksponering for UVB-lys (fig. 1 H og I). Denne raske effekten pånyrefunksjonble ledsaget av oppregulering i uttrykket av lipokalin-2 ognyreskademolekyl 1 (kim-1) (fig. 1 J og K), markører av rørformetnyreskadesom også er observert i LN (25, 26). Til tross for den forbigående naturen til proteinuri, uttrykket av dissenyreskademarkører vedvarte opp til dag 6 (fig. 1 J og K), noe som muligens gjenspeiler vevsreparasjon.

UV-lysindusert betennelse i huden resulterer i nøytrofilmigrering til nyrene.For å undersøke om nøytrofiler deltar i den systemiske inflammatoriske responsen på UVB-lys, undersøkte vi kinetikken til nøytrofilakkumulering i UV-lysbestrålt hud så vel som i milten,nyre,og lunge av C57BL/6 J (B6) mus, en stamme som best etterligner hudforandringer til UVB-lys i menneskelig hud (fig. 2A) (27). Etter akutt hudeksponering for UVB-lys, økte antallet nøytrofiler i huden syv ganger i løpet av 24 timer og forble forhøyet i 6 dager sammenlignet med baseline pre-UV-nivåer (D-1) ​​(Fig. 2B). Dette ble ledsaget av en reduksjon i nøytrofiltall i benmargen og en femdobling av sirkulerende blodnøytrofiler på dag 1 til 6 (fig. 2 C og D). Interessant nok, i samme tidsramme økte nøytrofiler i milten, lungene ognyre(Fig. 2 E–G og SI-vedlegg, Fig. S2A). Den nøyaktige kinetikken varierte mellom organer, og nådde en topp på dag 1 i lungene og dag 2 til 6 inyreog milt (fig. 2 E–G). Inyrer, nøytrofiler for det meste lokalisert til det tubulointerstitielle området, inkludert vaskulaturen, som indikert av farging av nøytrofil elastase (NE) i nærheten av, eller kolokalisert med, blodplate-/endotelcelleadhesjonsmolekyl-1 (PECAM-1/CD31 (Fig. 2H). Representative bilder i fig. 2H viser nøytrofiler i eller rundt den interstitielle vaskulaturen (helhvite piler) og i interstitium (prikkete hvite piler), med sporadiske nøytrofiler, også funnet i glomeruli (gule piler). Lignende lokalisering ble påvist med anti-Ly6G immunfluorescens (IF) farging (SI vedlegg, fig. S2B).

For å bestemme om andre medfødte immunceller viste lokale og systemiske responser som ligner på nøytrofiler, undersøkte vi fordelingen av monocytter (CD11b pluss Ly6C pluss Ly6G−) på samme tidspunkt etter eksponering for UVB-lys. Mens monocytter også ble rekruttert inn i huden, ble det kun påvist et lite antall infiltrerende monocytter inyrepå dag 6 etter UVB-eksponering (∼2-fold versus ~10.5-fold økning inyrenøytrofiler) (Fig. 2F og SI Vedlegg Fig, S3). Ingen økning i monocyttall ble oppdaget i lunge eller milt (SI vedlegg, fig. S3), noe som tyder på at den systemiske responsen på UV-skade var relativt selektiv for nøytrofiler.

Infiltrasjon av nøytrofiler i huden ble ledsaget av histologiske endringer, inkludert tidlig betennelse i dermis og epidermal celledød (dag 1 og 2), etterfulgt av utvikling av akantose og hyperkeratose med serocellulær skorpedannelse i noen tilfeller (dag 6) (SI) Vedlegg, Fig. S4). Spesielt oppsto ingen åpne hudlesjoner etter eksponering for UVB-lys, noe som tyder på at den observerte immuncelleinfiltrasjonen skjedde under sterile forhold, selv om et bidrag fra et endret hudmikrobiom ikke kan utelukkes (20).

Sammen viser disse funnene at eksponering av huden for en enkelt dose UVB-lys mobiliserer nøytrofiler til både det lokale betennelsesstedet så vel som til indre organer, inkludertnyre,ledsaget av blodnøytrofili. Mens generelle migrasjonsmønstre var like i både hann- og hunnmus, var nøytrofilinfiltrasjon i huden raskere hos hunner sammenlignet med hanner (fig. 2B). I motsetning til dette førte ikke epidermal skade ved stripping av tape til nøytrofil migrasjon tilnyretil tross for lignende nivåer av nøytrofil infiltrasjon og inflammatorisk respons og vevsskade som sett med UV-lyseksponering (SI Appendix, Fig. S5), noe som indikerer at systemisk nøytrofilspredning ikke er vanlig for alle former for steril hudskade.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESYKDOM

IL-17A fremmer nøytrofilrekruttering etter hudeksponering for UV-lys.En undersøkelse av kjemotaktiske og inflammatoriske mediatorer i huden avdekket betydelig oppregulering av genuttrykket av nøytrofile kjemokiner og inflammatoriske cytokiner cxcl1, cxcl5/6, g-csf og il-1 1 til 2 dager etter UV-eksponering (fig. 3 A–D). Den raske og vedvarende økningen i ekspresjon av s100A9 samsvarte med kinetikken til nøytrofilinfiltrasjon i huden (fig. 2B og SI-vedlegg, fig. S6), mens cytokinene il-6, tnf og il-33 ble forbigående økt og returnert til basislinjeuttrykk på dag 6 (SI vedlegg, fig. S6). I motsetning til dette var il-36a forhøyet bare på dag 6 (SI vedlegg, fig. S6), noe som kanskje gjenspeiler en reparativ funksjon. Den forbigående (1 til 2 d) tilstedeværelsen av monocytter i huden (SI vedlegg, fig. S3) parallelt med oppreguleringen av monocyttspesifikke kjemokiner ccl4 og ccl2 (SI vedlegg, fig. S6). I likhet med akkumulering av nøytrofiler i huden til hunnmus (fig. 2B), skjedde monocyttakkumulering i huden tidligere hos hunner enn hanner (SI vedlegg, fig. S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-fold kutan induksjon i g-csf-uttrykk i løpet av dag 1 og 2 etter UV (fig. 3C). For å bestemme om induksjonen av disse cytokinene var relevant for nøytrofilmobilisering, kvantifiserte vi først cytokinproteinkonsentrasjoner i blodet, noe som viste en robust og vedvarende (10- til 100-fold) økning i plasmakonsentrasjonen IL-17A 6 til 24 timer etter eksponering for UV-lys (fig. 3F), sammen med en forbigående (topp etter 6 timer) økning i IL-6 og IL-12, cytokiner som kan være nedstrøms for IL-17A (28) (fig. 3 G og H). Ingen økning i plasmakonsentrasjonene av IFN, GM-CSF, TNF, IL-10, IL-27, IL-23 eller IL1 ble observert. For å avgjøre om IL-17A er nødvendig for UVB-indusert nøytrofilrekruttering, blokkerte vi effekten av IL-17A med et nøytraliserende antistoff før UV-eksponering (fig. 3I). Anti–IL-17A IgG dempet blodnøytrofili betydelig (fig. 3J) og svekket nøytrofiltilstrømning i både det eksponerte hudvevet (fig. 3K og SI-vedlegg, fig. S7A) ognyre(Fig. 3L og SI-vedlegg, Fig. S7B). Disse funnene viser at nøytrofilrekruttering som respons på UV-lys formidles, i det minste delvis, av IL-17A.

Nøytrofiler medierer nyrebetennelse etter hudeksponering for UVLys.For å finne ut om nøytrofiler var ansvarlige for de inflammatoriske endringene inyre following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000- ganger etter UV-eksponering, noe som antyder en kjemotaktisk rolle for G-CSF i nøytrofilrekruttering som respons på UV-lys, hemmet vi nøytrofilmobilisering fra benmargen ved å blokkere G-CSF som skissert i fig. 4A. Nøytralisering av G-CSF forhindret blodnøytrofili så vel som nøytrofil rekruttering tilnyreetter hudeksponering for UVB-lys (fig. 4 B og C). Spesielt, som tidligere rapportert i forskjellige modeller (29, 30), endret ikke blokkering av G-CSF monocyttall inyre(Fig. 4D). Redusert nøytrofil migrasjon tilnyreble ledsaget av en betydelig reduksjon inyreekspresjon av adhesjonsmolekylene vcam-1 og e-selektin (fig. 4 E og F) samt de inflammatoriske mediatorene s100A9 og il-1 1 d etter UVB-eksponering (fig. 4 G og H). Videre er vevsskademarkørene lipocalin-2 og kim-1 inyreble signifikant redusert i UV-lys-eksponerte mus behandlet med G-CSF-blokkerende antistoff i forhold til isotype-behandlede UV-eksponerte dyr (fig. 4 I og J). Som vi rapporterte tidligere (6), utløste akutt hudeksponering for UVB-lys en type I interferonrespons inyre(Fig. 4K). Blokkering av G-CSF reduserte IFN-poengsummen betydelig, men opphevet ikke fullstendig (fig. 4K). Mens tilstedeværelsen av nøytrofiler inyrevar nødvendig for de akutte inflammatoriske og skaderesponsene observert 1 d etter hudeksponering for UV-lys (fig. 4), ble det ikke sett forskjeller i proteinuri på dette tidspunktet, da topp proteinuri oppstod rundt dag 4 etter UV-eksponering (fig. 1 H og JEG). Sammen indikerer disse dataene at nøytrofiler er ansvarlige for den inflammatoriske responsen og, direkte eller indirekte, bidrar til type I interferon-induksjon inyreetter eksponering for UV-lys av huden. I likhet med resultatene oppnådd med anti-G-CSF IgG, undertrykte administrering av nøytraliserende anti-IL-17 antistoff delvis nøytrofilmigrasjon tilnyreog resulterte i redusert genuttrykk avnyreinflammatoriske (vcam-1 og s100A9) og skadesmarkører (lipocalin-2 og kim-1), selv om bare reduksjonen i kim-1-uttrykk var statistisk signifikant (SI Appendix, Fig. . S7 C–F)

En underpopulasjon av nyreneøytrofiler er reversert transmigrert, en fenotype som også oppdages i blodet til SLE-pasienter.Selv om det lenge har vært antatt at nøytrofiler som kommer inn i infeksjonssteder eller steril betennelse senere gjennomgår apoptose og raskt fjernes av makrofager, har en rekke studier avslørt at noen nøytrofiler trafikkerer på en toveis måte, det vil si etter å ha kommet inn i et vev, transmigrerer de. tilbake i blodet og infiltrere et annet sted, en prosess referert til som omvendt transmigrasjon (rTEM) (8, 10, 11, 31–34). For å undersøke om nøytrofiler som huser tilnyreetter hudeksponering for UVB-lys passert via den eksponerte huden, studerte vi nøytrofilmigrasjon i en fotoaktiverbar B6-musemodell (humant ubiquitin C [UBC]-fotoaktivert [PA]-grønt fluorescerende protein [GFP]).

Eksperimentskjemaet er illustrert i fig. 5A; 1 d etter hudeksponering for en enkelt dose UVB-lys, ble huden eksponert for fiolett lys (405 nm) slik at infiltrerende immunceller ble fotokonvertert til GFP-positive celler. Fotokonverterte nøytrofiler (GFP pluss Ly6G pluss) ble deretter kvantifisert i perfusertnyrerden neste dagen. Flowcytometrianalyse viste at ~20 prosent av nyre-infiltrerende nøytrofiler var GFP-positive etter subtraksjon av bakgrunnssignalet (~10 prosent) (fig. 5B). I motsetning til modellene for steril betennelse i leveren eller cremaster-muskelen (8, 10), påviste vi ikke fotokonverterte nøytrofiler i lungen, muligens fordi det ble funnet få nøytrofiler i lungen på dag 2 (fig. 2F). For å teste om GFP pluss nøytrofiler inyreekstravasert fra UV-eksponert hudvev eller ble PA intravaskulært, sammenlignet vi endringene i antall GFP pluss nøytrofiler oppnådd franyrerav mus der den samme huden som ble utsatt for UV-lys var PA med fiolett lys en dag senere (Gruppe I) versus mus der huden ved siden av eksponeringen for UV-lys var PA med fiolett lys en dag senere (Gruppe II, diagram i SI-vedlegg, Fig. S8A). Selv om det ikke var noen forskjeller i prosentandelen av sirkulerende nøytrofiler mellom gruppene (SI vedlegg, fig. S8B), ble det observert en større økning i GFP pluss nøytrofiler inyrerav mus hvor UV-eksponert hud også var PA (gruppe I) sammenlignet med mangelen på økning i GFP pluss nøytrofiler i musene der ikke-UV-eksponert hud var PA (Gruppe II) (SI vedlegg, fig. S7B). I gruppe II var nøytrofiltallene lik bakgrunnen for GFP-positivitet sett i fig. 5B (SI vedlegg, fig. S8B).

Mens lave nivåer av GFP plussnyrenøytrofiler i gruppe II antydet at fiolett lys ikke PA sirkulerte celler i ikke-UV-eksponert hud, det forble mulig at eksponering for UV-lys endret nøytrofile interaksjoner med blodkar i huden, noe som muliggjorde større fotokonvertering og påfølgendenyreadgang. For å bestemme de relative proporsjonene av TEM-nøytrofiler, kvantifiserte vi uttrykket av overflatemarkører som ble brukt til å karakterisere nøytrofiler som gjennomgikk rTEM: CXCR4hi (8) og ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). Faktisk GFP plussnyrenøytrofiler uttrykte høyere nivåer av CXCR4 sammenlignet med GFP pluss nøytrofiler i huden eller GFP-nøytrofiler inyre(Fig. 5C). Av

renter,nyreekspresjon av CXCR4-liganden, cxcl12, 1 til 2 dager etter hudeksponering for UVB-lys var samtidig med tilstedeværelsen av CXCR4hi-nøytrofiler inyre(Fig. 1G), som muligens gir den kjemotaktiske stimulansen for rekruttering av disse nøytrofilene inn i nyrene. Av interesse oppdaget vi CXCR4hi og ICAM1- hiCXCR1lo nøytrofiler i benmargen sent etter UV-eksponering (dag 6, SI vedlegg, fig. S9 B og C), noe som tyder på at noen av disse nøytrofilene også er hjemme igjen til benmarg lik det som er rapportert for rTEM etter leverskade eller virusinfeksjon i huden (12, 36). I samsvar med disse observasjonene oppdaget vi høyere CXCR4-ekspresjon på blodnøytrofiler på dag 2 etter UV-eksponering, og muligens fanget opp celler på vei tilnyreog benmarg (SI vedlegg, fig. S9D). På samme måte ble en betydelig større prosentandel av ICAM1hiCXCR1lo-celler påvist blant GFP pluss nøytrofiler inyresammenlignet med GFP pluss nøytrofiler i huden og GFP− nøytrofiler inyre(Fig. 5D). ICAM1hiCXCR1lo-fenotypen ble påvist på ~20 til 35 prosent av GFP pluss nøytrofiler inyre(Fig. 5D), noe som tyder på at en undergruppe av nøytrofiler som migrerer tilnyrevia UV-eksponert hud gjøre det ved omvendt transmigrering, mens resten avnyrenøytrofiler aktiveres sannsynligvis mens de sirkulerer gjennom betent UV-eksponert hud. ICAM1- hiCXCR1lo nøytrofilsubpopulasjonen ble også påvist inyrerav normale B6-mus eksponert for UV-lys som ikke mottok PA (SI vedlegg, fig. S9A).

Mens både CXCR4hi og ICAM1hiCXCR1lo nøytrofile fenotyper har vært assosiert med inflammatoriske funksjoner og vevsskade i forskjellige musemodeller (11, 31, 37), har få studier blitt utført på disse cellepopulasjonene ved menneskelig sykdom. Gitt den nye rollen til nøytrofiler i SLE (13, 17, 18) og deres tilsynelatende heterogenitet (19), undersøkte vi om polymorfonukleære celler med normal tetthet (PMN) eller LDG fra SLE-pasienter

demonstrerte de omvendt migrerende fenotypene: CXCR4hi (37, 38) og ICAM1hiCXCR1lo. Flowcytometriprofilering av PMN og LDG avslørte høyere CXCR4-ekspresjon på overflaten av disse cellene hos SLE-pasienter sammenlignet med friske kontroller (fig. 6 A og C). Dessuten fant vi en liten, men betydelig høyere prosentandel av ICAM1hiCXCR1lo PMN i SLE-blod (gjennomsnittlig 3,5 prosent) i forhold til friske kontroller (gjennomsnittlig 1,4 prosent) (fig. 6B). Interessant nok inneholdt LDG-nøytrofilpopulasjonen (CD15 pluss CD14loCD10 pluss i mononukleære celler fra perifert blod [PBMCs]) en større prosentandel av ICAM1hiCXCR1lo-celler enn PMN-ene i både sunt (gjennomsnittlig, 7,1 prosent) og SLE-blod (gjennomsnittlig, 29,5 prosent). 6 B og D). Den rTEM-lignende befolkningen var betydelig mer representert i LDGs fra SLE-pasienter i forhold til friske kontroller (fig. 6D). Disse dataene identifiserer tilstedeværelsen av rTEM-lignende nøytrofile fenotyper i PMN-er og spesielt LDG-er hos SLE-pasienter.

Diskusjon

De systemiske effektene av hudeksponering for UV-lys er dårlig forstått. Identifisering av disse banene under normale baseline-forhold kan informere om mekanismer for systemisk vevsinvolvering etter soleksponering som oppstår ved sykdommer som SLE (2–4). Her rapporterer vi flere funn om hvordan eksponering for sollys påvirker nyrene. Først demonstrerte vi at akutt hudeksponering for UVB-lys utløser inflammatoriske og skaderesponser inyre,inkludert subklinisk proteinuri. Spennende, dissenyreendringer ble ledsaget av nøytrofil infiltrasjon i nyrene etter UVB-lys-mediert hudbetennelse. Nøytrofilresponsen var avhengig av IL-17A og G-CSF. Nøytrofiler i nyrene hadde proinflammatoriske fenotyper, som vist ved ekstracellulær lokalisering av NE, en høyere andel av rTEM (CXCR4hi) også kjent som "aldrede" og ICAM1hiCXCR1lo-celler. Nøytrofiler var direkte involvert i subklinisknyreskade,som utarming av nøytrofile resulterer i betydelige reduksjoner i uttrykket av adhesjonsmolekyler, inflammatoriske cytokiner, IFN-I-signatur og nyreskademarkører etter hud-UV-eksponering.

Andre typer hudskade, som tape-stripping og lokal påføring av en TLR7-agonist, har blitt rapportert å forsterkenyreskadei visse lupus-modeller, selv om sykdomsforbedring ble antatt å være mediert av makrofager og dendrittiske celler i stedet for nøytrofiler (39, 40). Etter å ha demonstrert at stripping av tape ikke førte til rekruttering av nøytrofiler tilnyre, foreslår vi at eksponering for UV-lys er forskjellig fra andre typer steril hudbetennelse. Dette kan forklares med generering av fotoprodukter eller unike inflammatoriske mediatorer etter UV-skade som forbereder nyrene for betennelse, av forskjeller i fjerning av nøytrofiler etter UV sammenlignet med tapestripping, eller av andre faktorer. Vi observerte at UV-lys utløste en rask og sterk induksjon av il-17a messenger-RNA (mRNA) i huden sammen med høye sirkulerende IL-17A-proteinnivåer (~100-fold økning) , som var nødvendig for nøytrofilrekruttering etter eksponering for UV-lys. Den samtidige induksjonen av 100- til 1,000- ganger i hudens g-csf-uttrykk antyder at IL-17A/G-CSF-aksen er den sannsynlige mekanismen som er ansvarlig for nøytrofili og nøytrofilvevs-søking som respons på UV-lys. Rollen til IL-17A i å regulere granulopoiesis og nøytrofilrekruttering via induksjon av G-CSF er godt anerkjent under homeostatiske forhold, og noen få studier har identifisert IL-17A som viktig for nøytrofilrekruttering til nettstedene til steril betennelse (41, 42). Ved lupus er forhøyet IL-17A-uttrykk funnet i kutane lesjoner (43), og økte sirkulerende IL-17A-nivåer har vært assosiert med verre sykdomsmanifestasjoner (44), selv om det spesifikke forholdet til nøytrofiler, en patogen populasjon i denne sykdommen (13, 17, 18), forblir uutforsket. I tillegg til sine direkte effekter på G-CSF-mediert mobilisering av nøytrofiler fra benmargen, kan IL- 17A også bidra til nøytrofil homing tilnyreved å stimulere uttrykket av adhesjonsmolekyler (f.eks. VCAM-1 og E-Selectin) pånyreendotel (45, 46).

Ved å bruke den samme modellen for akutt UV-eksponering rapporterte vi nylig at en enkelt dose UV-lys utløste en lokal og systemisk IFN-I-respons, som var nødvendig for effektiv nøytrofilrekruttering til huden (6). Siden IFN-I har vist seg å indusere IL-17A-produksjon (47), er det sannsynlig at disse banene enten uavhengig eller sammen fører til UV-lys-mediert nøytrofil rekruttering og migrasjon vi rapporterer her. Mens funnene våre antyder en inflammatorisk rolle for IL- 17A, har undertrykkende effekter av UVB-lys på IL-17A-signalering tidligere blitt rapportert ved psoriasis, der eksponering av psoriasishud for UVB-lys eliminerte patogene T-celler og myeloide inflammatoriske dendriske celler (48, 49). Siden psoriatisk hud, i motsetning til sunn, er rik på IL-17-produserende og –responderende T-celler, vil forskjellen i cellesammensetning sannsynligvis bestemme responsen på UVB-lys, inkludert omfanget av UVB-lysmediert undertrykkelse av IL -17Et reseptoruttrykk (50). UV-dosering kan også avgjøre om den inflammatoriske eller terapeutiske effekten oppstår: lave doser er assosiert med antiinflammatoriske og immundempende konsekvenser (51), muligens ved å hemme CD8 T-celleresponser (52).

Nøytrofiler spiller flere roller under vevsbetennelse. Når de aktiveres av patogenassosierte molekylære mønstre og skadeassosierte molekylære mønstre (DAMPS) eller ved reseptorengasjement, bidrar nøytrofiler direkte til vevsskade ved å frigjøre proteaser, ROS og ekstrudering av nøytrofile ekstracellulære feller (NET) (53, 54). Nøytrofiler kan også fremme vevsreparasjon ved fagocytose av cellulære debris og ved å muliggjøre revaskularisering av vev (8). Ved SLE er en nøytrofil gensignatur en sterk prediktor for aktiv sykdom inkludert LN og kutan lupus (17, 18). Nøytrofiler finnes i kutane lesjoner (13, 14) samtnyrebiopsiprøver (15, 16) av SLE-pasienter, og deres inflammatoriske egenskaper er delvis blitt tilskrevet NET-dannelse (16). Denne prosessen inkluderer økt produksjon av ROS (55), mitokondriell DNA-frigjøring (55) og frigjøring og induksjon av inflammatoriske proteiner, slik som s100A9 (56), IL-1b (57) og type I-interferoner (55) 58). Funnene våre om at hemming av nøytrofilmigrasjon til nyren opphevet s100A9 og reduserte IL-1b-ekspresjonen betydelig ognyreIFN-score tyder på at lignende inflammatoriske funksjoner kan være på spill. Relevant for nyresykdom ved SLE, nøytrofiler hovedsakelig lokalisert til TI-endotelet, stedet for økt ekspresjon avnyreskademarkører kim-1 og lipocalin-2 i LN nyrevev (59,60). Proteinuri kan oppstå på grunn av overdreven permeabilitet av den glomerulære barrieren for proteiner på grunn av nedsatt reabsorpsjon av protein av tubuli eller en kombinasjon av disse mekanismene (61). TI-skade hos SLE-pasienter er et hyppig patologisk funn i LN-nyrer, inkludert de med mild glomerulær skade (61, 62). TI-skade har vist seg å forutsi alvorlighetsgraden av LN (63, 64), men mekanismene som utløser den er ukjente. Siden forhøyet kim-1 og lipocalin-2 er anerkjente markører for TI-skade i SLE (26, 65) og blokkerer nøytrofil migrasjon tilnyrehemmet uttrykket deres, foreslår vi at den forbigående proteinurien observert etter UV-eksponering er en konsekvens av nøytrofilmediert subklinisk TI-betennelse (65). Økt nyre-vcam-1-uttrykk, en annen markør for TI-skade i SLE (66), støtter denne modellen ytterligere.

I tillegg til å forplante betennelse på de lokale stedene for steril eller infeksjonsskade, har nøytrofiler vist seg hjem til fjerne organer (8–10), der de, avhengig av konteksten, bidrar til vevsskade via ROS-produksjon (11) eller aktiverer det adaptive immunsystemet i lymfeknutene og benmargen (9, 12). Den inflammatoriske naturen til disse nøytrofilene har blitt tilskrevet deres evne til å forlate det primære skadestedet og migrere til sekundære steder, det vil si å gjennomgå rTEM (9–11, 31–34). Våre funn om at PA av GFP-holdige celler i huden etter UV-eksponering førte til påvisning av GFP pluss nøytrofiler inyremed fenotypen rTEM tyder på at en underpopulasjon avnyrenøytrofiler reversert migrert fra UV-eksponert hud (GFP pluss nøytrofiler utgjør ~20 prosent avnyrenøytrofiler og av disse er 20 til 35 prosent rTEM; derfor utgjør rTEM 4 til 7 prosent av totalennyrenøytrofiler). Denne andelen av rTEM er sammenlignbar med andelen rapportert etter steril leverskade (~9 prosent ) (36) og iskemi-reperfusjonsskade (~8 prosent ) (11). rTEM har under andre omstendigheter vist seg å være pro-inflammatorisk (10, 11) og har svekket apoptose (35), noe som fører til muligheten for at de spiller en rolle i UV-indusertnyreskade.Det forhøyede CXCR4-uttrykket på disse nøytrofilene er spesielt relevant, som en tilfeldighetnyreekspresjon av cxcl12, en CXCR4-ligand uttrykt av podocytter og tubuli (24), ble observert, noe som sannsynligvis ga et kjemotaktisk signal for denne nøytrofilpopulasjonen. Økt CXCR4-ekspresjon på immunceller kombinert med høye nivåer avnyreCXCL12 er identifisert hos SLE-pasienter med LN (67), og denne veien var implisert i lupus så vel som iskemi-reperfusjonnyreskadei mus (24, 68). I tillegg til å være en markør for rTEM, er økt CXCR4-ekspresjon også en indikator på "aldrede" nøytrofiler, som kan mediere vevsskadelige inflammatoriske responser (38). Den nøyaktige rollen til CXCR4 i nøytrofilrekruttering tilnyrekan undersøkes ved CXCR4-antagonisme som tidligere gjort i andre modeller av sterile skader (38).

Vevsspesifikk nøytrofilmigrasjon og mekanismene som er ansvarlige for differensiell ekspresjon av adhesjonsmolekyler i forskjellige organer er ikke godt forstått (69). Høyere ekspresjonsnivåer av kjemokinet cxcl12 inyremen ikke lungen kunne forklare den foretrukne tilstedeværelsen av CXCR4hi-nøytrofiler i nyrene. I tillegg vil induksjonen av ekspresjon av vcam-1 og e-selektin i nyrene, sammenlignet med ingen endring i uttrykk i lungen, sannsynligvis bidra til fortrinnsrett nøytrofilrekruttering og retensjon i nyrene. Den 5- til 6-doble økningen i s100A9-ekspresjon i lungen sammenlignet med en 30- til 60-dobling i nyrene samt en 6-dobling i il-1b-uttrykk i lungen sammenlignet med 16-dobbel økning i nyrene indikerer ytterligere vevsforskjeller i den inflammatoriske responsen. Reduksjonen i nøytrofilinfiltrasjon av nyrene etter nøytralisering av G-CSF kan tilskrives både en reduksjon i sirkulerende antall og aktivering av nøytrofiler samt en reduksjon i lokal ekspresjon av vcam-1 og e-selektin. Vi kan imidlertid ikke være sikre på om initial oppregulering av disse adhesjonsmolekylene etter hud-UV-eksponering tilskrives hudavledede cytokiner/DAMPS eller om nøytrofiler, gjennom frigjøring av serinproteaser, bidrar direkte til deres uttrykk, slik det er vist i andre sammenhenger (70). Uavhengig av mekanismene, og å merke seg at vi ikke har utført en omfattende analyse av alt vev, gir studiene våre bevis for en viss organselektivitet i UV-lys-medierte systemiske effekter. Fremtidige studier vil ta for seg vevsspesifikke funksjonelle konsekvenser av systemisk nøytrofilspredning ved for eksempel vaskulær albuminlekkasje og ødemdannelse i lungen (11, 36).

Hos pasienter med SLE er det vanskelig å entydig relatere hudens UV-lyseksponering til forverring av systemisk sykdom, da det er betydelig variasjon (1 til 3 uker) i synlige fotosensitivitetsresponser hos ulike individer (21). I tillegg subklinisknyreskadekan lett gå glipp av inntil påfølgende eksponering for UV-lys forsterker effektene. Mens vi fant ut at nøytrofil-mediertnyrebetennelsesom respons på UV-lys ikke forårsaker klinisk sykdom hos friske mus, kan en slik mekanisme bidra til LN-bluss hos lysfølsomme lupuspasienter på flere måter. Fc-reseptorengasjement av immunkomplekser kan øke nøytrofilrekruttering, noe som resulterer i ROS og proteasefrigjøring (71); den økte kapasiteten til lupusnøytrofiler og LDG-er til å produsere NET, som hos SLE-pasienter ikke fjernes effektivt (72), kan føre til frigjøring av vevsskadelige proteaser (73), spredning av IFN-I-responsen (58) , eller direkte skade pånyreendotel ved å skape vaskulær skade og lekkasje (16). Dessuten kan de underliggende forskjellene i lupushud, slik som forbedret IFN-I-signalering (5, 74) og defekter i beskyttende Langerhans-cellepopulasjon (75), informere om omfanget og arten av nøytrofilmedierte systemiske responser. Sporing av nøytrofilmigrasjon kombinert med avhør av autoantistoffer, akkumulering av apoptotiske celler og lave komplementnivåer kan løses ved å bruke nye modeller av lupus, slik som genetisk definerte trippelmutanter (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− og Sle1.Mfge8− /−C3−/−) (76) eller andre lupusstammer etter eksponering for UV-lys.

De eksakte mekanismene som knytter nøytrofiler til betennelse i SLE kan i tillegg være påvirket av nøytrofil/LDG-fenotypen, ettersom heterogenitet i disse populasjonene har blitt mer tydelig (77). Våre funn av forhøyede CXCR4 og ICAM1hiCXCR1lo (rTEM) sirkulerende populasjoner, spesielt i SLE LDGs, bidrar ytterligere til denne heterogeniteten og antyder at noen av de mer pro-inflammatoriske granulocyttene i blod kan ha tidligere "vevserfaring", det vil si bosted i berørt organvev, som huden, før systemisk spredning. rTEM-fenotypene er tidligere rapportert i leddvæske og sirkulerende nøytrofiler hos pasienter med revmatoid artritt (35, 78) og ved akutt pankreatitt-assosiert lungeskade (79). Deres rolle i SLE krever videre etterforskning.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESMERTER

Materialer og metoder

Mus.Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Washington, Seattle. Innledende eksperimenter ble utført med både hann- og hunnmus C57BL/6J (Jackson Laboratory, 3 til 4 mnd gamle, fig. 1 og 2). Hunnmus ble brukt til alle påfølgende eksperimenter. PA-studier ble utført på B6. Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J hunnmus (Jackson Laboratory, 3 til 4 mnd gamle). Disse musene ble generert ved injeksjon av en transgen vektor som bærer PAGFP (T203H-variant) under transkripsjonskontroll av den humane ubiquitin C-promotoren i C57BL/6-embryoer. Dyrene ble holdt under patogenfrie forhold og holdt i lys-mørke sykluser på 12 timer med ad libitum tilgang til mat og vann. Forsøkene på alle dyrene ble utført på samme tid på dagen for å unngå påvirkning av døgnrytme på nøytrofilmigrasjon (38).

Eksponering for UVB-lys og tapestripping.Ryggaspektet til hann- og hunnmus C57BL/6 ble barbert minst 24 timer før bestråling med UVB-lys, og bare musene med ikke-pigmentert hud ble brukt i eksperimentene. Mus ble bedøvet med isofluran og eksponert for én dose UVB-lys (500 mJ/cm2) ved bruk av FS40T12/UVB-pærer (National Biological Corporation), med toppemisjon mellom 300 og 315 nm. UVB-lysenergien ved den dorsale overflaten ble målt med et Photo light IL1400A radiometer utstyrt med en SEL240/UVB-detektor (International Light Technologies). Mus ble avlivet 1, 2 eller 6 dager etter eksponering for UVB-lys, og ikke-bestrålte mus ble brukt som kontroller (D-1) (Fig. 2A). Epidermal tape stripping ble utført som tidligere beskrevet (7), og hud ognyreble evaluert 24 timer etter skade

Hemming av IL-17A og G-CSF.Mus ble behandlet intravenøst ​​med 100 ug renset rotte-anti-mus IL-17A IgG (BioLegend) eller isotypekontroll 3 timer før eksponering for UV-lys (1 × 500 mJ/cm2) (fig. 3I). Nøytrofil tilstedeværelse i blod, hud og saltvann perfusertnyrevev ble evaluert ved flowcytometri 24 timer etter UV-eksponering som beskrevet nedenfor. Nøytrofilmigrasjon som respons på UV-lys ble hemmet ved å behandle mus intraperitonealt med 50 ug anti-mus G-CSF monoklonalt antistoff eller muse IgG isotypekontroll (R&D Systems) 24 timer og 3 timer før hudeksponering for UVB-lys (1 × 500 mJ) /cm2) (fig. 4A). Etter hjerteperfusjon, antall nøytrofile og monocytter inyreble evaluert ved flowcytometri og genuttrykk ved qPCR, som beskrevet nedenfor. Mus som ikke ble utsatt for UVB-lys ble brukt som en ekstra kontrollgruppe.

Isolering av celler fra forskjellige organer.Etter eutanasi med CO2-inhalasjon ble et stykke rygghud fjernet og holdt i RPMI (Roswell Park Memorial Institute)-løsning på is til behandling. Blod ble samlet ved hjertepunktur i etylendiamintetraeddiksyrebelagte sprøyter. Hjerteperfusjon ble deretter utført ved bruk av fosfatbufret saltvann (PBS) (~60 ml) gjennom venstre ventrikkel etter klipping av høyre atrium. Vellykket perfusjon ble bestemt ved å observere fullstendignyreog blekhet i lungene. Lunger, nyrer, milt og begge lårbenene ble fjernet forsiktig og plassert i RPMI-løsning på is inntil prøvebehandling. Celler ble isolert fra ekvivalente områder av hudvev (~30 mm2) ved å hakke og fordøye vevet med 0.28 enheter/ml Liberase TM (Roche) og 0.1 mg/ml deoksyribonuklease I ( Worthington) i PBS med Ca pluss 2 og Mg pluss 2 i 60 minutter ved 37 grader med risting. Celler ble isolert fra ennyreper dyr;nyrevev ble hakket og fordøyd i 2 mg/ml kollagenase type I (Worthington) i 30 minutter ved 37 grader i henhold til en publisert protokoll. Lungeceller ble høstet ved å fordøye vev i PBS (Ca pluss 2 og Mg pluss 2) med 1 mg/ml kollagenase type 1 og 60 U deoksyribonuklease I. Hele milter ble knust på en 40 μm cellesil og vasket med RPMI-løsning. Helblod og celler fra milten, benmargen, nyrene og lungene ble behandlet med 1X røde blodceller (RBC) Lysis Buffer (BD Biosciences). Etter isolering/fordøyelse ble celler fra alt vev filtrert (40 μm), vasket med PBS og resuspendert i RPMI-løsning før telling.

Flowcytometrifarging og analyse.Celler ble behandlet med Fc Block TruStain FcX (Biolegend) og farget med Zombie Aqua Viability-fargestoff (Biolegend) i henhold til leverandørens anbefalinger. Celler ble vasket og overflatefarging ble utført ved bruk av musespesifikke fluorescerende antistoffer kjøpt fra Biolegend. Ulike myeloidcellepopulasjoner ble analysert i porten for levende immunceller (Zombie Aqua-CD45 plus). Prosent og antall nøytrofiler (Ly6CintLy6Ghi) og monocytter (Ly6C pluss Ly6G−) ble kvantifisert. Representativ flowcytometri gating er presentert i SI vedlegg, Fig. S10. Prosent ekspresjon og gjennomsnittlig fluorescensintensitet av overflatemarkører i PA-modellen (CXCR4, ICAM1 og CXCR1) ble bestemt ved å bruke fluorescens minus én (FMO) fargingskontroller i nøytrofilporten (Ly6Ghi). Alle prøver ble behandlet med CytoFLEX flowcytometer (Beckman Coulter) og data ble analysert med FlowJo programvareversjon 10 (Tree Star).

Fotoaktiveringsstudier (PA).UBC-PA-GFP-mus ble barbert og en del av ryggen ble bestrålt med én dose UVB-lys (500 mJ/cm2) som ovenfor. Bare hudområdet som skal fotokonverteres ble utsatt for UVB-lys, mens den gjenværende huden ble dekket med aluminiumsfolie. Etter 24 timer fra UVB-indusert steril skade, ble hele den UVB-bestrålte hudregionen utsatt for fiolett lys (405 nm) ved bruk av en 50 W lysemitterende diodelampe med 0,37 numerisk apertur (NA) fiber (Mightex) ved kraften på 100 mW (15 min eksponering per område). Denne metoden ble optimalisert basert på en publisert protokoll for hudspesifikk fotokonvertering (80).Nyrerog lungene ble samlet og behandlet for flowcytometrianalyse 24 timer etter PA, som beskrevet ovenfor. Tilnærmingen og tidslinjen er skissert i diagrammet i fig. 5A. Prosenten av GFP pluss nøytrofiler inyreble sammenlignet med det som ble funnet hos mus under tre kontrollforhold: 1) ingen UV og ingen PA, 2) UV men ingen PA, og 3) ingen UV men PA. CXCR4-ekspresjonsnivåer og ICAM1hiCXCR1lo-fenotype innenfor GFP pluss og GFP−nøytrofiler i huden ognyreble evaluert ved flowcytometri ved bruk av musespesifikke fluorescensmerkede antistoffer kjøpt fra Biolegend. For å finne ut om GFP pluss nøytrofiler inyrestammer fra huden og ikke blod, hud i en gruppe mus ble utsatt for UV-lys og PA som beskrevet ovenfor (gruppe I), mens i en annen gruppe ble huden utsatt for UV-lys, men PA ble utført på det tilstøtende hudområdet ikke utsatt for UV-lys (Gruppe II) (diagram i SI-vedlegg, Fig. S7A).Nyrerble samlet og behandlet for flowcytometrianalyse som beskrevet ovenfor.

Genekspresjon og proteomiske analyser.Hud,nyre,og lungeprøver ble lagret i RNAlater-løsning (QIAGEN). RNA ble ekstrahert av RNeasy Kit fra QIAGEN, og komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert ved å bruke High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems). Transkripsjonene av inflammatoriske kjemokiner, cytokiner og adhesjonsmolekyler ble kvantifisert ved sanntids qPCR ved å bruke primerne oppført i SI-vedlegg, tabell S1 og normalisert til gjennomsnittet av 18S-transkriptnivåer. Dosen av UVB-lys som ble brukt påvirket ikke 18S-ekspresjon i noen av organene. Relativt uttrykk for mRNA-mål ble bestemt ved å bruke standardformelen 2^(−Ct) × koeffisient. IFN-skår ble avledet fra uttrykket av 10 representative interferon-stimulerte gener (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 og ifi27l2a) som tidligere beskrevet (6). Gjennomsnittet og SD for det relative uttrykket for hver ISG ble bestemt inyrerav mus som ikke er utsatt for UV-lys (meannoUV og SDnoUV). Disse ble deretter brukt til å standardisere ekspresjonsnivåene til hver ISG i nyrene til behandlede mus (IgG isotype pluss UVB eller a-GCSF pluss UVB). De standardiserte ekspresjonsnivåene ble deretter summert for hver mus for å utlede en IFN-ekspresjonsscore; i=uttrykk for hver ISG; Genbehandling=relativt genuttrykksnivå etter behandling; og Gene inoUV=relative genekspresjonsnivå i mus som ikke er eksponert for UVB-lys. ∑ 10 i=1=Geneitreatment−meanGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . Proteinnivåer i plasma- og hudvevsproteinekstrakter ble målt ved å bruke definerte analyttpaneler LEGENDplex Mouse Inflammation Panel og Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

IF farging av frossen nyrevev.Saltvann-perfusertnyrerble fiksert i 4 prosent paraformaldehyd i 1 time ved romtemperatur og, etter nedsenking i 30 prosent sukrose, frosset i optimalt skjæremedium (Sakura Finetek). 5-μm vevsseksjonene ble rehydrert i PBS før IF-farging. Vev ble permeabilisert med 0,1 prosent Triton X-100 i PBS og deretter blokkert i PBS pluss 0,1 prosent Triton X-100/5 prosent BSA (bovint serumalbumin)/5 prosent kaninserum . NE- og endotelceller ble påvist ved farging med henholdsvis anti-mus NE Cy5 (1:100, Bioss) og anti-mus PECAM-1/CD31 Al488 (1:100, Biolegend), ved 4 grader over natten. Nøytrofil tilstedeværelse inyreble bekreftet ved farging med anti-mus Ly6G Al647 (1:100, Biolegend). Vev ble montert ved hjelp av ProLong Gold med 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) monteringsmedium (Invitrogen) og avbildet med Nikon Eclipse 90i fluorescerende mikroskop (Histology and Imaging Core, University of Washington).

Hudhistoologisk evaluering.Formalinfikserte, parafininnstøpte hudvevsseksjoner (4 til 5 μm) ble farget med hematoksylin og eosin ved University of Washington Histology and Imaging Core før UV, dag 1, dag 2 og dag 6 etter UVB-bestråling (n {{ 7}} kvinner). Huden ble skåret på en blind måte for følgende parametere: betennelse i dermis/subcutis, epidermal celledød, akantose, hyperkeratose, serocellulær skorpedannelse og erosjon/ulcerasjon. Disse parameterne ble skåret på en skala fra 0 til 4 avhengig av alvorlighetsgrad og omfang, med unntak av erosjon/ulcerasjon, som ble skåret som tilstede (1) eller fraværende (0). Representative bilder ble tatt med NIS-Elements BR 3.2 64bit og belagt i Adobe Photoshop med lysjusteringer brukt på hele bildet. Original forstørrelse er oppgitt.

Urinmålinger.Urinproteinnivåer ble evaluert ved Bradford-proteinanalysen (Thermo Fisher Scientific). Urinprøver ble testet ved 1:40 fortynning i PBS, og proteinkonsentrasjon i urin ble bestemt basert på seriefortynninger av kjente konsentrasjoner av BSA. Urinalbumin/kreatinin-forholdet ble evaluert ved å bruke Albuwell-albuminanalysen og Creatinine Companion Kit (Exocell) i henhold til produsentens instruksjoner.

Menneskelig prøvesamling og strømningscytometrianalyse.Denne studien ble godkjent av University of Washington Institution Review Board (STUDY00001145). Fullblod ble samlet inn i hepariniserte rør fra friske frivillige og SLE-pasienter etter informert samtykke. Nøytrofiler (PMNs) og PBMCs ble isolert ved Ficoll-Paque diskontinuerlig gradientseparasjon (GE Healthcare). PMN-er ble renset fra erytrocyttpelleten ved 5 prosent dekstran-sedimentering. Etter RBC-lyse ble cellene farget med fluorescensmerkede antistoffer kjøpt fra Biolegend, og CXCR4-ekspresjon og prosent ICAM1hiCXCR1lo-celler ble evaluert i PMN-er (CD66b pluss ) og LDG-er (CD15 pluss , CD14lo og CD101 pluss i PBMC-er). Gatestrategien for LDG-er og ICAM1hiCXCR1lo-farging basert på FMO er vist i SI-vedlegg, Fig. S11. Prøver ble behandlet med CytoFLEX flowcytometer (Beckman Coulter), og data ble analysert med FlowJo programvareversjon 10 (Tree Star).

Statistiske analyser.Data ble analysert ved bruk av GraphPad Prism 7-programvare (GraphPad Software Inc.) og presentert som gjennomsnitt ± SEM. Den statistiske forskjellen mellom de to datagruppene ble bestemt i forhold til ikke-bestrålte kontroller (D-1) ved å bruke Students test. Enveis ANOVA med flere sammenligninger og Tukey post hoc ble brukt for å bestemme den statistiske signifikansen mellom de tre gruppene.