Echinacoside Rb1 demper aldersrelatert vaskulær svekkelse ved å modulere Gas6-banen

ABSTRAKT

Kontekst:EchinacosideRb1 (Rb1) har mange gunstige effekter og beskytter mot hjerte- og karsykdommer.

Mål: Å undersøke om Rb1 kunne dempe aldersrelatert vaskulær svekkelse og identifisere mekanismen. Materialer og metoder: C57BL/6J hunnmus i alderen 2 og 18 måneder, tilfeldig fordelt til gruppene Young, Young þ 20 mg/kg Rb1, Oldþ vehikel, Old þ 10 mg/kg Rb1 og Old þ 20 mg/kg Rb1 grupper, ble daglig intraperitonealt injisert med bærer eller Rb1 i 3 måneder. De torakale aortasegmentene ble brukt til å inspisere den endotelavhengige vasorelaksasjonen. Venstre thoraxaorta-vev ble samlet for histologiske eller molekylære ekspresjonsanalyser, inkludert aldringsrelaterte proteiner, markører som er relevante for forkalkning og fibrose, og ekspresjon av Gas6/Axl.

Resultater: Vi fant at i Oldþ-vehikelgruppen var uttrykket av senescensproteiner og cellulære adhesjonsmolekyler betydelig økt, med verre endotelavhengig thoraxaorta-relaksasjon (58,35 prosent ± 2,50 prosent) enn i Young-gruppen (88,84 prosent ± 1,20 prosent) ). Imidlertid reduserte Rb1-behandling signifikant ekspresjonsnivåene til disse proteinene og bevarte endotelavhengig avslapning hos gamle mus. Videre reduserte Rb1-behandling også kalsiumavsetning, kollagenavsetning og proteinekspresjonsnivåene av kollagen I og kollagen III i gamle mus. Videre fant vi at nedreguleringen av Gas6-proteinekspresjon med 41,72 prosent og mRNA-ekspresjon med 52,73 prosent hos gamle mus sammenlignet med unge mus ble opphevet ved Rb1-behandling. Men det var ingen signifikant forskjell på Axl-uttrykk blant gruppene.

Konklusjoner: Vår studie bekrefter at Rb1 kan lindre vaskulær skade, noe som tyder på at Rb1 kan være en potensiellanti-aldringsrelatert vaskulært svekkelsesmiddel.

Kjøp Cistanche Rich In Echinacoside

Introduksjon

I løpet av de neste 30 årene i Kina er det en estimert økning fra 12,6 prosent til 26 prosent av voksne over 65 år (Zhou og Walker 2021). Selv om menneskets levetid øker, fortsetter aldersrelaterte sykdommer å være et tema for bekymring.Hjerte- og karsykdommerervanligste sykdommersom rammer eldre mennesker.Vaskulær aldringledsaget av vaskulære strukturelle og funksjonelle endringer er en viktig uavhengig risikofaktor forhjerte- og karsykdommer(Lakatta og Levy 2003). Epidemiologiske undersøkelser har vist at 82 prosent av pasientene som dør av hjerte- og karsykdommer er 65 år eller eldre (Moslehi et al. 2012). Derfor kan det å utforske mekanismen for aldersassosiert vaskulær svekkelse og finne midler som kan beskytte vaskulær funksjon mot aldersrelatert nedgang spille viktige roller for å redusere forekomsten og prevalensen av aldersassosierte kardiovaskulære lidelser hos eldre individer.

Arteriell aldring har vært implisert i patogenesen av vaskulær dysfunksjon og ulike hjerte- og karsykdommer og er et kjennetegn på aldring (Minamino og Komuro 2007). Vaskulære endringer som følge av aldring varierer og inkluderer endotelial dysfunksjon, hypertrofi av vaskulære glatte muskelceller (VSMC), arteriell dilatasjon, reorganisering av den ekstracellulære matrisen (ECM), vaskulær forkalkning og en økning i kollagen-til-elastin-forholdet med fragmentering og vaskulær stivning (Tolle et al. 2015). Brandes et al. (2005) rapporterte at aldersrelatert endoteldysfunksjon ofte var preget av ubalanse i endotelavledet avslapning og kontraktile faktorer. Videre studie av Herrera et al. (2010) viste også at endotelial dysfunksjon var nært assosiert med en progressiv nedgang i endotelavhengig vasodilatasjon. Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan aldring påvirker vasodilatasjon eller utløser ubalanse i relaterte faktorer og til slutt fører til vaskulær dysfunksjon. Acosta et al. (2008) viste at vaskulære celler som gjennomgår senescens kan produsere adhesjonsmolekyler, inkludert plasminogenaktivatorhemmer 1 (PAI-1), et vaskulært celleadhesjonsprotein 1 (VCAM-1) og intercellulært celleadhesjonsmolekyl{{ 14}} (ICAM-1). Alle disse adhesjonsmolekylene ble antatt å spille viktige roller i rekruttering av monocytter til aterosklerotiske steder og deretter initiere vaskulær ombygging, noe som til slutt resulterte i en reduksjon i etterlevelse og en økning i stivhet (Acosta et al. 2008; Kovacic et al. 2011). Vaskulær stivhet er den viktigste manifestasjonen av vaskulær aldring. Det tilskrives ECM-remodellering og bidrar til en nedgang i vasodilatasjon. Tidligere studier har vist at vaskulær stivhet og VSMC senescens tilskrives medial forkalkning og kollagenavsetning (Mauriello et al. 1992; McClelland et al. 2006; Nakano-Kurimoto et al. 2009; Wendorff et al. 2015; Kim18 et al. ). Derfor kan vasodilatasjonsdysfunksjon skyldes forkalkning og fibrose. Redusering av kalsium- eller kollagenavsetning kan forsinke aldringsrelatert arteriell svekkelse.

EchinacosideRb1 (Rb1) er en av de aktive komponentene som finnes i ginseng. Forskning har rapportert at Rb1 utøver mange gunstige antisenescens og anti-apoptotiske effekter, spesielt for å beskytte myokard og endotel (Zheng et al. 2017; Zhou et al. 2017; Zheng et al. 2020). Nyere studier har vist at Rb1 kan redusere kronisk nyresykdomsassosiert vaskulær forkalkning og type I kollagenekspresjon hos rotter (Zhou et al. 2019b). Funn har også antydet at Rb1 reduserer type I kollagenekspresjon (Kwok et al. 2012). Effekten av Rb1 på aldersassosiert vaskulær svekkelse er imidlertid ikke undersøkt.

Det er rapportert at Rb1 hemmer vaskulær forkalkning gjennom vekststoppspesifikk gen 6 (Gas6) transaktivering in vitro (Nanao-Hamai et al. 2019). Gas6, et medlem av den vitamin K-avhengige proteinfamilien, er involvert i reguleringen av flere cellulære funksjoner etter binding til reseptoren Axl, en membranreseptor tyrosinkinase (Nakano et al. 1997; Fridell et al. 1998; Yanagita et al. . 2001). Noen studier har indikert at Gas6/Axl-banen spiller en sentral rolle i vaskulær biologi og sykdommer som vaskulær forkalkning vaskulær remodellering av lunge og aterosklerose (Korshunov et al. 2006; Hurtado et al. 2010; Son et al. 2010). Vi antar at Rb1 kan dempe aldersrelatert vaskulær svekkelse ved å undertrykke forkalkning og fibrose, som potensielt er assosiert med reguleringen av Gas6/Axl-banen.

Materialer og metoder

Eksperimentelle reagenser

Rb1 (renhet større enn 98 prosent) ble oppnådd fra Victory (Sichuan, Kina). Antistoffer mot p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) og GAPDH (ab18160) ble kjøpt fra Abcam (MA, USA). Antistoffer mot kollagen I (14695), kollagen III (22734) og Axl (13196) ble kjøpt fra Proteintech Group (MA, USA). Antistoffer mot Gas6 (A8545) og p16INK4a (A0262) ble kjøpt fra ABclonal Technology (Hubei, Kina). Modifisert Krebs-Henseleit (KH) buffer, fenylefrin (en potent vasokonstriktor) og acetylkolin (Ach, en endotelavhengig NO-donor) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (MO, USA). Alle andre reagenser som ble brukt var av analytisk kvalitet.

Dyr og forvaltning

Denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Sun Yat-Sen University. De fleste livstidsstudier har vist effekter på kvinner (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); derfor utførte vi vår langtidsstudie med hunnmus. C57BL/6J hunnmus i alderen 2 og 18 måneder ble hentet fra Center of Experimental Animals, Sun Yat-Sen University. Musene ble matet med en normal diett og holdt under kontrollerte forhold (24 ± 2 C og 50 ± 5 prosent fuktighet) med 12 timers lys/mørke fotoperioder under spesifikke patogenfrie forhold. 40 unge C57BL/6J hunnmus ved 2 måneders alder ble tilfeldig fordelt til gruppene Young og Young þ 20 mg/kg Rb1 (Young þ Rb1-20) (n ¼ 20 hver). Disse musene ble behandlet med en daglig intraperitoneal injeksjon av bærer (steril saltvannsløsning) eller 20 mg/kg Rb1 oppløst i bæreren i 3 måneder før eutanasi ved CO2-kvelning ved 5 måneders alder. 60 gamle C57BL/6J hunnmus ved 18 måneders alder ble tilfeldig fordelt til Old þ kjøretøyet, Old þ 10 mg/kg Rb1 (Gamle þ Rb1-10) og Old þ 20 mg/kg Rb1 (Gamle þ Rb 1-20) grupper (n ¼ 20 hver). Musene som overlevde til slutten av dette eksperimentet fikk daglige intraperitoneale injeksjoner av bæreren alene eller Rb1 (10 eller 20 mg/kg) i 3 måneder, hvoretter musene ble avlivet ved 21 måneders alder. Eksperimenter ble gjentatt minst tre ganger med 4-5 mus per gruppe.

Materialer og metoder Eksperimentelle reagenser

Rb1 (renhet større enn 98 prosent) ble oppnådd fra Victory (Sichuan, Kina). Antistoffer mot p21Cip1 (ab188224), p16INK4a (ab51243), ICAM-1 (ab179707), VCAM-1 (ab134047), PAI-1 (ab222754) og GAPDH (ab18160) ble kjøpt fra Abcam (MA, USA). Antistoffer mot kollagen I (14695), kollagen III (22734) og Axl (13196) ble kjøpt fra Proteintech Group (MA, USA). Antistoffer mot Gas6 (A8545) og p16INK4a (A0262) ble kjøpt fra ABclonal Technology (Hubei, Kina). Modifisert Krebs-Henseleit (KH) buffer, fenylefrin (en potent vasokonstriktor) og acetylkolin (Ach, en endotelavhengig NO-donor) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (MO, USA). Alle andre reagenser som ble brukt var av analytisk kvalitet.

Dyr og forvaltning

Denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Sun Yat-Sen University. De fleste livstidsstudier har vist effekter på kvinner (Hsu et al. 2018; Qin et al. 2018); derfor utførte vi vår langtidsstudie med hunnmus. C57BL/6J hunnmus i alderen 2 og 18 måneder ble hentet fra Center of Experimental Animals, Sun Yat-Sen University. Musene ble matet med en normal diett og holdt under kontrollerte forhold (24 ± 2 C og 50 ± 5 prosent fuktighet) med 12 timers lys/mørke fotoperioder under spesifikke patogenfrie forhold. 40 unge C57BL/6J hunnmus ved 2 måneders alder ble tilfeldig fordelt til gruppene Young og Young þ 20 mg/kg Rb1 (Young þ Rb1-20) (n ¼ 20 hver). Disse musene ble behandlet med en daglig intraperitoneal injeksjon av bærer (steril saltvannsløsning) eller 20 mg/kg Rb1 oppløst i bæreren i 3 måneder før eutanasi ved CO2-kvelning ved 5 måneders alder. 60 gamle C57BL/6J hunnmus ved 18 måneders alder ble tilfeldig fordelt til Old þ kjøretøyet, Old þ 10 mg/kg Rb1 (Gamle þ Rb1-10) og Old þ 20 mg/kg Rb1 (Gamle þ Rb 1-20) grupper (n ¼ 20 hver). Musene som overlevde til slutten av dette eksperimentet fikk daglige intraperitoneale injeksjoner av bæreren alene eller Rb1 (10 eller 20 mg/kg) i 3 måneder, hvoretter musene ble avlivet ved 21 måneders alder. Eksperimenter ble gjentatt minst tre ganger med 4-5 mus per gruppe.

Bestemmelse av vasorelaksasjon i thoraxaortaringer

Etter at dyrene var avlivet, ble thoraxaortaringene raskt fjernet og plassert i kald KH-bufferløsning (118 mmol/L NaCl, 4,75 mmol/L KCl, 25 mmol/L NaHCO3, 1,18, mmol/L MgSO4 1. 18 mmol/L KH2PO4, 2,54 mmol/L CaCl2 og 11,1 mmol/L glukose), og det omkringliggende fettet og vevet ble nøye debridert. Lengden på aortaringene var omtrent 3 mm. Aortasegmentene ble hengt opp på kroker av rustfritt stål, luftet i KH-buffer og kontinuerlig oksygenert med 95 prosent O2 ved 37 C. Aorta-ringene ble deretter koblet til FORT-10 krafttransdusere for MacLab-datainnsamling. En initial passiv spenning i aortaringene ble satt til 3 mN i 30 minutter for å oppnå karringstabilitet før videre eksperimentering. KH-bufferen ble erstattet hvert 10. minutt. Fenylefrin ble tilsatt til vevsbadet i en konsentrasjon på 105 mol/L for å indusere vasokonstriksjon. Etter å ha oppnådd karringstabilitet, ble vasorelaksanten Ach (10 9 – 10 5 mol/L) tilsatt til vevsbadet i umiddelbar rekkefølge for å oppnå dose-responskurven. Relaksasjonen ved hver konsentrasjon ble målt og uttrykkes som prosentandelen av kraft generert som respons på fenylefrin.

Immunhistokjemi

Thoracic aorta vev ble fiksert i formalin, dehydrert, innebygd i parafin og kuttet i 4 lm tverrsnitt. Disse seksjonene ble inkubert i sitratbuffer (pH 6.0) og mikrobølget i 10 minutter to ganger etter å ha gjennomgått avparafinisering og rehydrering. Geiteserum (10 prosent) (Gibco, BRL, NY, USA) ble brukt til å blokkere ikke-spesifikk binding i 1 time ved 37 C, etterfulgt av inkubasjon over natten med primære antistoffer mot p21Cip1 (1:1000) og p16INK4a (1:200) ) ved 4 C i en fuktig boks. Etter tre vaskinger i PBS ble pepperrotperoksidase (HRP)-konjugerte sekundære antistoffer (Abcam) tilsatt og inkubert i 60 minutter ved 37 C, etterfulgt av diaminobenzidin (1:100, Abcam)-farging. Hematoksylin ble påført for å motfarge cellekjernene. Snittene ble dekket med nøytral gummi og fotografert under et Zeiss-mikroskop.

Haematoxylin-eosin (HE) farging

Parafininnstøpte thoraxaorta-seksjoner ble farget med hematoksylin i 2 minutter. Etter vasking og behandling med 1 prosent sur alkohol ble snittene behandlet med eosinfarging i 3 min. Etterpå ble seksjonene vasket, dehydrert og behandlet med xylen før mikroskopisk observasjon. De torakale aortaseksjonene ble fotografert under et Zeiss-mikroskop.

Massons trikromfarging

Parafininnstøpte thoraxaortaseksjoner ble farget i Weigerts jernhematoksylin i 10 minutter etter å ha gjennomgått avparafinisering og rehydrering og ble deretter vasket med PBS i 5 minutter. Vevet ble deretter farget i Biebrich scarlet-syre fuchsin-løsning i 5 minutter og vasket i destillert vann. Seksjonene gjennomgikk deretter differensiering og dehydrering i 75 prosent og 90 prosent alkohol noen ganger, etterfulgt av skylling i vann fra springen. Til slutt ble seksjonene ryddet i xylen og montert med et monteringsmedium. Snittene ble visualisert med et mikroskop. Interstitiell kollagenavsetning ble indikert med blågrønn farging.

Alizarin rød S-farging

For aortaforkalkningsfarging ble seksjoner av thoraxaorta farget med 2 prosent alizarin rød S-løsning i 10 minutter og vasket med PBS. Deretter ble seksjonene bløtlagt i vannfri aceton i 30 s, en blandet løsning av vannfri aceton og xylen (volumforhold ¼ 1:1) i 15 s, og vannfri xylen i 1 min. Interstitielle kalsiumfosfatsalter ble indikert med rødfarging.

Western blotting

Thoraxaorta ble plassert i RIPA-lysebuffer (HaiGene, Haerbin, Kina) supplert med en proteasehemmer (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA) og deretter homogenisert ved ultralydbehandling på is. Vevslysatet ble sentrifugert ved 12,000 g ved 4 C i 15 minutter, og supernatanten ble samlet i et nytt rør. Etterpå ble proteinkonsentrasjonen i supernatanten bestemt ved bruk av et BCA-proteinanalysesett (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, Kina). SDS PAGE ble utført med like mengder protein fra hver prøve som tidligere beskrevet (Zheng et al. 2020), og proteinene ble deretter overført til PVDF-membraner (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). Membranene ble inkubert ved 4 C over natten med ett av følgende primære antistoffer etter å ha blitt blokkert med 5 prosent bovint serumalbumin (Gibco) i 1 time ved romtemperatur: p21Cip1 (1:1000), p16INK4a (1:1000), ICAM{ {16}} (1:1000), VCAM-1 (1:5000), PAI-1 (1:1000), kollagen I (1:1000), kollagen III (1:300), Gas6 (1:1000), Axl (1:500) og GAPDH (1:1000). Etter å ha blitt vasket, ble membranene inkubert med et HRP-konjugert sekundært antistoff (Boster, Wuhan, Kina) i 1 time ved romtemperatur. Sekundær antistoffbinding ble analysert ved bruk av et ECL-sett (EMD Millipore), og intensiteten til båndene ble analysert ved bruk av ImageJ-programvare (versjon 1.41; National Institutes of Health, MD, USA). GAPDH-uttrykk ble brukt som en intern kontroll.

Sanntids kvantitativ RT-PCR (qPCR)

Først ble totalt RNA isolert fra thoraxaortas ved bruk av et TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (9767, TaKaRa) i samsvar med produsentens protokoller. RNA-konsentrasjonen ble deretter målt med et DS-11 FX-spektrofotometer (DeNovix). Deretter ble det ekstraherte RNA (1000 ng hver for et 20 ml reaksjonssystem) reverstranskribert til cDNA ved bruk av PrimeScriptTM RT Master Mix (RR360A, TaKaRa) i henhold til produsentens instruksjoner i et ProFlex PCR-system (Thermo Scientific) ). Til slutt ble revers transkripsjonsproduktene brukt som maler for videre PCR-amplifisering med SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa). Følgende primersekvenser ble brukt: Gapdh: fremover 50 -CAGCAACTCCCA CTCTTCCAC-30 og revers 50 - TGGTCCAGGGTTTCTTAC TC-30; og Axl: fremover 50 -GGAACCCAGGGAATATCACAGG- 30 og revers 50 -AGTTCTAGGATCTGTCCATCTCG-30; og Gas6 fremover 50 -TGCTGGCTTCCGAGTCTTC-30 og bakover 50 -CGGGTCGTTCTCGAACAC-30. Hver reaksjonsbrønn i en 96-brønnklar plate (Thermo Scientific) som inneholdt 0,4 pmol/lL forover- og reversprimere, 1 SYBR Premix Ex Taq II (RR820A, TaKaRa) og 10 ng cDNA. Det endelige reaksjonsvolumet var 20 ml, og alle prøvene ble analysert i tre eksemplarer. cDNA-amplifisering ble utført som følger: pre-denaturering ved 95 C i 30 s, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 C i 5 s, og annealing ved 60 C i 35 s i QuantStudio5 (Thermo Scientific). 2–DDCT-metoden ble brukt for relativ kvantitativ analyse av de innsamlede dataene. Det relative mRNA-ekspresjonsnivået til målgener ble oppnådd ved å sammenligne data fra den eksperimentelle gruppen med de fra kontrollgruppen med referanse til Gapdh.

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950