GSK3-hemming ved fosforylering ved Ser389 kontrollerer nevroinflammasjon

Abstrakt: Hemmingen av glykogensyntasekinase 3 (GSK3) ved Ser9-fosforylering påvirker mange fysiologiske prosesser, inkludert immunresponsen. Imidlertid forblir konsekvensene av GSK3-hemming ved alternativ Ser389-fosforylering dårlig karakterisert. Her har vi undersøkt nevroinflammasjon hos GSK3 Ser389 knock-in (KI) mus, der fosforyleringen av Ser389 GSK3 er svekket. Antallet aktiverte mikroglia/infiltrerte makrofager, astrocytter og infiltrerte nøytrofiler var betydelig høyere hos disse dyrene sammenlignet med C57BL/6J villtype (WT) motparter, noe som tyder på at manglende inaktivering av GSK3 ved Ser389-fosforylering resulterer i vedvarende lavgradig nevroinflammasjon. Dessuten mislyktes gliacelleaktivering og hjerneinfiltrasjon av immunceller som respons på lipopolysakkarid (LPS) hos GSK3 Ser389 KI-mus. Slike effekter var hjernespesifikke, da perifer immunitet ikke ble påvirket på samme måte. I tillegg mislyktes fosforylering av IkB-kinasekomplekset (IKK) som svar på LPS i GSK3 Ser389 KI-mus, mens STAT3-fosforylering var fullstendig bevart, noe som tyder på at NF-KB-signalveien er spesifikt påvirket av denne GSK3-regulatoriske veien. Samlet sett indikerer funnene våre at GSK3-inaktivering ved Ser389-fosforylering kontrollerer den inflammatoriske responsen i hjernen, noe som øker behovet for å evaluere dens rolle i progresjonen av nevroinflammatoriske patologier.

cistanche tubulosa - Anti-inflammatorisk

Nøkkelord: nevroinflammasjon; mikroglia; astrocytter; nøytrofiler; NF-KB-signalering; flowcytometri

Hva gjør cistanche urt - Anti-inflammatorisk

Klikk her for å se Cistanche-produkter

【Spør om mer】E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1. Introduksjon

Glykogensyntasekinase 3 (GSK3) er en serin-treoninkinase med bred spesifisitet. GSK3 regulerer prosesser så forskjellige som betennelse, cellevekst, celledifferensiering og energimetabolisme og er involvert i aldersrelaterte sykdommer som diabetes, Alzheimers sykdom og kreft [1]. Begge GSK3 isoformer, GSK3 og GSK3, er allestedsnærværende uttrykt, men deres funksjoner er ikke fullstendig overlappende [2]. GSK3 er konstitutivt aktiv, selv om aktiviteten kan hemmes ved sekvestrering i cytosoliske komplekser så vel som ved fosforylering ved rester Ser9 og Ser389 [3]. Akt-indusert fosforylering av GSK3 ved Ser9 er en GSK3-regulatorisk vei som er tilstede i de fleste celletyper, og det er standardveien for å begrense GSK3-aktivering og forhindre celledød. I motsetning til dette har vi funnet at p38 MAPK-indusert Ser389-fosforylering er begrenset til spesifikke vev som hjernen, thymus og milten [4] og at hjerneuttrykk av fosfo-Ser389 GSK3 er utviklingsregulert [5]. Fosforyleringen av GSK3 av Ser389 utløses først og fremst av DNA-dobbeltrådbruddsrespons, og det er avgjørende å tillate DNA-reparasjon [6,7]. Mens fosforylering på Ser9 er hovedveien for inaktivering av cytoplasmatisk GSK3, brukes Ser389-fosforylering til å inaktivere den nukleære poolen av GSK3 for å øke overlevelsen under DNA DSB-reparasjon [8]. Unnlatelse av å inaktivere GSK3 gjennom Ser389-fosforylering som respons på DSB fører til økt celledød ved nekroptose [6,7]. Dette er høyst relevant fordi den nekroptotiske dødstypen er mer inflammatorisk og er funnet ved inflammatoriske sykdommer [9]. Imidlertid, i motsetning til fosforyleringen av Ser9, forblir implikasjonene av fosforylering av GSK3 på Ser389 dårlig karakterisert. En rekke studier har støttet sammenhengen mellom GSK3 og betennelse. Aktivering av GSK3 ved inflammatoriske stimuli som stress, infeksjon eller traumer fremmer således produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner som IL-6, IL-1 og IFN, mens GSK3-hemming undertrykker syntesen av pro-inflammatoriske mediatorer og øker IL-10-produksjonen av immunceller [10]. GSK3 kan aktiveres av lipopolysakkarid (LPS), en av de viktigste immunstimulerende endotoksinene til gramnegative bakterier [11,12]. Ved binding av bakteriell LPS til Toll-lignende reseptorer (TLR), medierer GSK3 frigjøring av inflammatoriske cytokiner i celler i det medfødte immunsystemet [13]. Dessuten er det rapportert at administrering av GSK3-hemmere til mus behandlet med en dødelig dose LPS øker dyrenes overlevelse betydelig [14]. Til tross for disse pro-inflammatoriske effektene assosiert med GSK3, har antiinflammatoriske effekter også blitt dokumentert [15,16]. Dermed er GSK3-regulering avgjørende for å opprettholde balansen mellom pro- og antiinflammatoriske cytokiner etter TLR-aktivering [17]. Nukleær faktor kB (NF-kB) medierer produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner og er en av de viktigste transkripsjonsfaktorene som aktiveres av TLR. Flere forfattere har bekreftet at GSK3 er i stand til å aktivere NF-kB-signalering gjennom fosforylering av IkB-kinasekomplekset (IKK), som fosforylerer IkB og frigjør aktiv NF-kB. En annen transkripsjonsfaktor fosforylert av GSK3 er en signaltransduser og aktivator av transkripsjon -3 (STAT3), som medierer nevroinflammasjon i sammenheng med septisk sjokk [18]. STAT3-fosforylering av GSK3 resulterer i nukleær translokasjon og aktivering. I tillegg hemmer GSK3 antiinflammatoriske CREB og AP-1 transkripsjonsaktiviteter, og forsterker uttrykket av proinflammatoriske cytokiner [10,19]. Mikrogliaceller er fastboende makrofager i CNS. Sammen med infiltrerte leukocytter spiller mikroglia-aktivering en kritisk rolle ved nevroinflammasjon. Astrocytter er også gliaceller med nevroimmune funksjoner ettersom de krysstaler med mikroglia, leukocytter og endotelceller, og modulerer dermed både medfødte og adaptive immunresponser [20]. Aktivering av mikroglia og astrocytter som respons på inflammatoriske stimuli (gliose) er preget av store cellulære endringer som inkluderer spredning, hypertrofi og cytokinfrigjøring [21]. GSK3 har vært involvert i utviklingen av gliose som respons på LPS eller ved overekspresjon av neural GSK3 [22]. Det er også bevis på at glialreaktivitet og nevroinflammasjon indusert av GSK3 kan medieres ved aktivering av NF-kB-banen i hjernen [19,23]. I kontrast reduserer inaktiveringen av GSK3 glialreaktiviteten, begrenser den nevroinflammatoriske responsen og øker antiinflammatorisk CREB-aktivitet i nevrale celler [24]. Følgelig har det blitt antydet at GSK3 spiller en grunnleggende rolle i progresjonen av nevroinflammatoriske lidelser, som Alzheimers sykdom og multippel sklerose [25]. Fosforylering er en regulatorisk mekanisme for GSK3-aktivitet med store implikasjoner for kontroll av immunresponsen. Således oppregulerer GSK3-hemming ved klassisk Ser9-fosforylering produksjonen av antiinflammatoriske mediatorer og nedregulerer frigjøringen av pro-inflammatoriske cytokiner [26], selv om det også er involvert i oppløsningen av betennelse i en modell av eksperimentell kolitt indusert av trinitrobenzensulfonsyre [27]. Innenfor hjernen har defekt hemming av GSK3 ved Ser9-fosforylering vært relatert til inflammatoriske nevropatologier som Parkinsons sykdom [28] og schizofreni [29]. Til tross for de høye nivåene av fosfo-Ser389 GSK3 som finnes i hjernen [4], er det derimot ukjent om denne veien for inaktivering av GSK3 spiller en rolle i å justere nevroinflammasjon. Her undersøker vi den mulige rollen til Ser389-fosforyleringsmediert GSK3-inaktivering i nevroinflammasjon ved bruk av GSK3 KI-mus der GSK3 Ser389 ble erstattet av Ala for å forhindre C-terminal fosforylering av GSK3 [7,8]. Resultatene våre viser at manglende inaktiv GSK3 ved fosforylering ved Ser389 under fysiologiske forhold fører til kronisk lavgradig nevroinflammasjon så vel som mangel på respons på inflammatoriske stimuli som LPS. Denne kroniske betennelsen ser ut til å være spesifikk for hjernen siden det perifere immunsystemet stort sett er upåvirket. Vi viser også at fraværet av fosfo-Ser389 GSK3 i hjernen til GSK3 KI-mus regulerer NF-kB-signalering, som er en sentral hendelse i kontrollen av nevroinflammasjon. Derfor gir funnene våre støtte for involvering av GSK3-inaktivering ved Ser389-fosforylering i inflammatoriske nevropatologier.

2. Resultater

2.1. Unnlatelse av å inaktivere GSK3 av Ser389-fosforylering fører til økt basal nevroinflammasjon

Inaktivering av GSK3 ved fosforylering på Ser9 har vært assosiert med et antiinflammatorisk stadium i hjernen [30]. Selv om inaktivering av GSK3 ved fosforylering på Ser389 er viktig for å redusere nevronal død forårsaket av DNA-dobbeltstrengsbrudd i hjernen, har ingen studier undersøkt om denne veien også kan regulere den nevroinflammatoriske responsen. Vi brukte derfor de tidligere beskrevne GSK3 Ser389 KI-musene, der Ser389 er erstattet av Ala, for å forhindre Ser389-fosforylering. Vi undersøkte residente og infiltrerte immunceller i hele hjernen (unntatt lillehjernen og luktepærer) fra WT og GSK3 Ser389 KI mus ved mekanisk dissosiasjon av vevet og Percoll gradient, etter en tidligere optimalisert protokoll for å oppnå en balansert blanding av residente og infiltrerte celler i hjernen, inkludert mikroglia/makrofager, astrocytter, infiltrerte nøytrofiler og lymfocytter [31]. Celler ble deretter analysert ved flowcytometri ved bruk av standardmarkører (figur S1 i tilleggsmaterialer) [31-33]. Aktiverte og hvilende mikroglia/makrofager ble identifisert som henholdsvis CD11b+CD45high og CD11b+CD45low, mens lymfocyttpopulasjonen ble markert som CD45+CD11b- [32,34]. Nøytrofiler ble karakterisert som CD45+Ly6G+-celler; og astrocytter ble definert i CD45−-populasjonen ved ekspresjon av celleoverflateantigenet-2 (ACSA-2). Denne markøren brukes til påvisning av utviklende og voksne astrocytter [35]. Oppregulering av ACSA-2 har blitt observert i reaktive astrocytter assosiert med inflammatoriske tilstander, slik som autoimmun demyelinisering [36]. Vi fant tidligere at antallet ACSA-2+-astrocytter i musehjerner øker etter LPS-behandling, noe som ytterligere indikerer at nivået av ACSA-2-ekspresjon korrelerer med astrocyttaktivering som respons på inflammatoriske stimuli [31]. Selv om ACSA-2 også kan uttrykkes i en liten underpopulasjon av mikroglia og makrofager [35], er disse cellene innenfor CD45+-populasjonen. Flowcytometrianalyse av hjernecelleisolatene fra mus under fysiologiske forhold viste en markert økning i fraksjonen av aktiverte mikroglia/makrofager i GSK3 Ser389 KI-mus sammenlignet med WT-mus (Figur 1a). I motsetning til dette sank prosentandelen av hvilende mikroglia i hjernen til GSK3 Ser389 KI-mus (figur 1b). I tillegg var det en markant økning i tilstedeværelsen av ACSA-2+-astrocytter (dvs. aktiverte astrocytter) i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 1c). Når det gjelder immuncelleinfiltrasjon i hjernen, var det en klar akkumulering av nøytrofiler i hjernen til GSK3 Ser389 KI-mus i forhold til WT-mus (Figur 1d), noe som ytterligere demonstrerer tilstedeværelsen av pågående inflammatorisk respons i hjernen til GSK3 Ser389 KI-mus under fysiologisk forhold. Frekvensen av CD45+CD11b-leukocytter (hovedsakelig lymfocytiske celler) i hjernen ble imidlertid ikke påvirket i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 1e). Sammen viser disse resultatene at unnlatelse av å hemme GSK3 ved fosforylering ved Ser389 fører til en kronisk medfødt inflammatorisk respons i hjernen som forårsaker reaktivitet mellom mikroglia og astrocytter.

Figur 1. Inaktivering av GSK3 ved Ser389-fosforylering påvirker hjernecellepopulasjoner som er involvert i nevroinflammasjon. Hjerner fra både WT- og GSK3 Ser389 KI-mus ble fjernet og behandlet for flowcytometrianalyse av (a) CD11b++CD45høyaktiverte mikroglia/makrofager, (b) CD11b++CD45lavhvilende mikroglia, (c) ACSA -2+ astrocytter, (d) Ly6G+ nøytrofiler og (e) CD11b− lymfocytter. Histogrammer representerer cellenummer, uttrykt som prosentandelen av CD45−celler (astrocytter) eller CD45+-celler (alle andre populasjoner). Data vises som gjennomsnitt ± SEM (n=7–9). Student t-test ble brukt for å sammenligne genotyper. *, p < {{20}}.05; **, p < 0,01. WT, vill-type; KI, og GSK3 Ser389 banker på.

2.2. Mangel på effekt av GSK3-fosforylering ved Ser389 på miltceller

For å undersøke om den endrede inflammatoriske tilstanden oppdaget i GSK3 Ser389 KI-mus er begrenset til hjernen eller om effekten også er systemisk, utførte vi flowcytometrianalyse for de forskjellige cellepopulasjonene i milten. Nøytrofiler ble identifisert som Ly6G+-celler. Ly6G-uttrykk var svært variabel siden det avhenger av modningsstadiet til celler, som tidligere vist [37]. I tillegg ble monocytiske myeloidceller merket som Ly6G–CD38+CD11b+-celler. Disse monocyttene/makrofagene presenterte to klart distinkte populasjoner basert på nivåene av CD38-ekspresjon, som tidligere rapportert [38]. CD8+-celler, CD4+-celler og B220+-celler (B-celler) ble også evaluert (figur S2 i tilleggsmaterialer).

Figur 2. Flowcytometrianalyse viser lignende miltcellepopulasjoner i WT- og GSK3 Ser389 KI-mus. Etter dissosiasjonen av miltceller ble flowcytometri brukt for å vurdere antall (a) Ly6G+ nøytrofiler, (b) CD38+CD11b+ monocytter/makrofager, (c) CD4+ celler, (d) CD8+-celler og (e) B220+-celler. Histogrammer viser celletall uttrykt som en prosentandel av totale celler. Data tilsvarer gjennomsnitt ± SEM (n=5–7). Student t-test ble brukt for å sammenligne genotyper. WT, vill-type; KI, GSK3 Ser389 knockin.

2.3. LPS er ikke i stand til å øke nevroinflammasjon hos GSK3 Ser389 KI-mus

Deretter undersøkte vi om avskaffelse av Ser389-fosforylering, i tillegg til å forårsake basal tonisk betennelse, også kunne påvirke den inflammatoriske responsen utløst av LPS. WT- og GSK3 Ser389 KI-mus ble injisert intraperitonealt med en subletal dose (0,5 mg/kg) bakteriell lipopolysakkarid (LPS). Den hjerneinflammatoriske responsen ble undersøkt tre dager senere siden slik behandling tidligere har vist seg å gi lavgradig betennelse i musehjerner [39,40]. Denne LPS-responsen ligner også den kroniske inflammatoriske tilstanden observert i flere nevrologiske sykdommer, inkludert depresjon, angst og Parkinsons sykdom [41,42]. Som forventet induserte LPS glialreaktivitet i WT-mus, bestemt av økningen i frekvensen av aktiverte mikroglia/makrofager (figur 3a) og redusert frekvens av hvilende mikroglia (figur 3b). I motsetning klarte ikke LPS å utløse ytterligere inflammatorisk respons i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 3a,b). Tabell 1 sammenligner direkte omfanget av LPS-responser mellom de to genotypene. I tillegg økte denne LPS-behandlingen prosentandelen av ACSA-2+-astrocytter i WT-mus, som tidligere rapportert [31], men ikke i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 3c). Når det gjelder hjerneinfiltrasjon av immunceller, forårsaket LPS en akkumulering av nøytrofiler i WT-mus, men hadde ingen effekt i GSK3 Ser389 KI-mus (Figur 3d). Til slutt fremmet ikke LPS-administrasjon lymfocyttakkumulering i hjernen i verken WT- eller GSK3 Ser389 KI-mus (figur 3e). Til sammen indikerer disse observasjonene at inaktivering av GSK3 ved Ser389-fosforylering er avgjørende for å forhindre en tonisk inflammatorisk tilstand i hjernen, men bidrar til akutt hjernebetennelse som respons på stimuli som LPS.

Tabell 1. Forskjeller i LPS-effekter mellom WT- og GSK3 Ser389 KI-mus. Verdier representerer celleantall etter LPS-behandling i hver genotype og er uttrykt som en økning i forhold til vehikelbehandlede kontroller (gjennomsnitt ± SEM). Stjerner indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom effektene av LPS i WT- og GSK3 Ser389 KI-dyr. WT, vill-type; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolysakkarid. *, p < 0.05; **, p < 0,01.

Figur 3. Nevroimmunceller fra GSK3 Ser389 KI-mus klarer ikke å reagere på LPS. Voksne WT- og GSK3 Ser389 KI-mus ble injisert intraperitonealt med LPS (0,5 mg/kg). Tre dager senere, hjernepopulasjoner av (a) CD11b++CD45høyaktiverte mikroglia/makrofager, (b) CD11b+CD45lavhvilende mikroglia, (c) ACSA-2+ astrocytter, (d) Ly6G+ nøytrofiler, og ( e) CD11b-lymfocytter ble evaluert ved flowcytometri. Histogrammer viser LPS-effekter på celleantall i begge genotyper. Data presenteres som prosentandeler av CD45−celler (astrocytter) eller CD45+-celler (alle andre populasjoner), og verdier tilsvarer gjennomsnitt ± SEM (n=7–9). Student t-test ble brukt for å evaluere betydningen av endringer indusert av LPS i hver genotype. ** p < 0.01. WT, vill-type; KI, GSK3 Ser389 knockin; LPS, lipopolysakkarid.

Deretter undersøkte vi den mulige påvirkningen av hippocampal GSK3 Ser389-fosforylering på basal glialaktivering og glialresponsen på inflammatoriske stimuli. For dette formålet ble Iba-1-merking evaluert ved mikroskopi i dentate gyrus (Figur 4a). Først ble WT-mus evaluert. Mikrografer viser lav basal glialaktivering, men en kraftig økning i glialimmunreaktivitet som respons på LPS-injeksjon (0,5 mg/kg, 3 dager) (figur 4b). Kvantifisering av den integrerte tettheten for Iba-1-immunfarging viste verdier som var 53 % høyere i WT-mus etter behandling (figur 4d). Disse endringene var statistisk signifikante og er i samsvar med den fremtredende cellulære hypertrofien forårsaket av LPS i musehippocampus tidligere rapportert [43,44].

Figur 4. Gliose som respons på LPS er endret i GSK3 Ser389 KI-mus. Voksne WT- og GSK3 Ser389 KI-mus ble injisert intraperitonealt med LPS eller bærer (C). Etter 3 dager ble hjerner behandlet for fluorescerende mikroskopi. (a) En koronal hippocampus-seksjon tilpasset fra musehjerneatlaset [45] indikerer lokaliseringen av bildene, som inkluderer dentate gyrus. (b) Hjerneseksjoner ble immunmerket for mikroglia/makrofagemarkører Iba-1. Grafer viser den integrerte tettheten til Iba-1-immunreaktivitet, som er en måling av glialreaktivitet som reflekterer både intensiteten og utvidelsen av glialfarging. (c) Sammenligning av kontroll WT- og KI-dyr. (d) LPS-respons i hver musegenotype. Alle verdier er uttrykt med økt respekt for WT-kontroller behandlet med vehikel (gjennomsnitt ± SEM, n=4–5). Student t-test ble brukt. *, p < 0.05. Målestokk, 100 µm. WT, vill-type; KI, GSK3 Ser389 knockin; C, kjøretøy; LPS, lipopolysakkarid.

Analysen av hippocampus til Ser389 KI-mus avslørte forskjeller i basal mikroglialaktivering med hensyn til WT-mus. Selv om visuell inspeksjon av mikrofotografier viste en moderat glialaktivering hos mutante dyr (figur 4b), indikerte integrerte tetthetsmålinger at økningen i glialimmunreaktivitet var statistisk signifikant (figur 4c). Interessant nok viste Ser389 KI-mus ingen tegn til ytterligere aktivering etter LPS-behandling (Figur 4b), og kvantitativ analyse bekreftet at LPS ikke var i stand til å øke Iba-1-immunfarging i hippocampus (Figur 4d), noe som tyder på at gliacelleaktivering ved LPS er svekket i fravær av GSK3 Ser389-fosforylering.

cistanche-tilskuddsfordeler – Anti-inflammatorisk

2.5. Perifer immunrespons på LPS ble ikke påvirket i GSK3 Ser389 KI-mus

Våre tidligere eksperimenter avslører de dype konsekvensene av GSK3-inaktivering ved Ser389-fosforylering på hjernens respons på LPS. Deretter tok vi for oss om lignende effekter er tilstede i systemisk immunitet. Siden LPS er kjent for å forårsake aktivering av medfødte immunceller i milten [46], ble miltcellepopulasjoner fra både WT- og GSK3 Ser389 KI-mus evaluert 3 dager etter LPS-injeksjon (0,5 mg/kg). antall Ly6G+ nøytrofiler (Figur 5a) og CD38++CD11b++Ly6G−monocytter/makrofager (Figur 5b) økte signifikant i WT-mus som respons på LPS-behandling. Disse LPS-effektene, forventet i WT-mus, ble også observert i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 5a,b). Ingen forskjeller mellom genotyper ble oppnådd heller når lymfocyttpopulasjoner fra milten ble analysert, da prosentandelen av milt-CD4+-celler (Figur 5c) og CD8+-celler (Figur 5d) ble redusert med LPS også i begge musestrengene (reduksjonen i mutante mus var statistisk signifikant bare for CD4+-celler); og B220+ B-celler var upåvirket av LPS uavhengig av genotype (figur 5e). Disse observasjonene står i motsetning til de differensielle effektene av LPS funnet i hjernen til begge genotyper. Mens GSK3 Ser389 KI-mus er resistente mot nevroinflammasjonen utløst av LPS, er disse musene ikke systemisk desensibiliserte for LPS. Derfor ser effekten av GSK3 Ser389-fosforylering ut til å være selektive for hjernen.

Figur 5. Lignende perifer immunrespons på LPS i GSK3 Ser389 KI- og WT-mus. Voksne WT- og GSK3 Ser389 KI-mus ble ip injisert med LPS. Etter 3 dager ble miltceller ekstrahert og behandlet for å evaluere, ved hjelp av flowcytometri, antall (a) Ly6G+ nøytrofiler, (b) CD38+CD11b+ monocytter/makrofager, (c) CD8+, (d) CD4+ og (e) B220+ celler. Histogrammer viser effekten av LPS på celleantall, inkludert WT- og KI-mus. Student t-test ble brukt for å evaluere betydningen av endringer indusert av LPS i hver genotype. Gjennomsnitt ± SEM vises (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0,01. WT, vill-type; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitoneal; C, kjøretøy; LPS, lipopolysakkarid.

2.6. LPS-indusert NF-KB-baneaktivering i Hippocampus er opphevet i GSK3 Ser389 KI-mus

NF-KB er en transkripsjonsfaktor som er avgjørende for at LPS skal indusere betennelse [47]. I tillegg har NF-KB vist seg å være regulert av GSK3 i hjernen [2,19,23]. Vi undersøkte derfor NF-KB-aktivering i hjernen som respons på LPS ved analyse av IKK-fosforylering, et tidlig trinn i NF-kB-aktiveringsveien. WT- og GSK3 Ser389 KI-mus ble ip administrert med LPS (0,5 mg/kg) og etter 4 timer ble hippocampus høstet. Helcelleekstrakter ble brukt til å undersøke fosfo-IKK / og total IKK / ved Western blotting. Som forventet økte LPS IKK-fosforylering i hippocampus hos WT-mus (Figur 6a,b). I kontrast klarte ikke LPS å indusere IKK-fosforylering i GSK3 Ser389 KI-mus (figur 6a,b). Aktivering av STAT3 har også vært assosiert med LPS-indusert betennelse [48]. Vi undersøkte derfor fosforyleringen av STAT3 ved Western blot-analyse. I motsetning til NF-kB-aktivering, ble fosforylering av STAT3 sterkt indusert i hippocampus til både WT- og GSK3 Ser389 KI-mus som respons på LPS (Figur 6a,c). Forebygging av GSK3-inaktivering ved Ser389-fosforylering svekker selektivt NF-KB-signalering, noe som er i samsvar med en rolle for GSK3 som en oppstrøms regulator av NF-KB-banen i hippocampus. Disse resultatene tyder på at GSK3-banen påvirker nevroinflammasjon ved å kontrollere viktige inflammatoriske mediatorer, slik som NF-KB.

Figur 6. Unnlatelse av å inaktivere GSK3 ved Ser389-fosforylering påvirker NF-KB- og STAT3-signalering forskjellig hos LPS-behandlede mus. Aktivering av NF-KB- og STAT3-veiene ble undersøkt i helcellelysater fra hippocampus 4 timer etter ip-injeksjon av LPS ({{10}},5 mg/kg) eller bærer (C) i begge WT og GSK3 Ser389 KI mus. Blots illustrerer Western blot-analysen av fosfor-IKK / , total IKK / , fosfor-STAT3 og total STAT3. (a) -tubulin-deteksjon ble inkludert som en belastningskontroll. Tilknyttede grafer tilsvarer (b) fosfo-IKK / /IKK / og (c) fosfo-STAT3/STAT3-forhold, oppnådd fra densitometriske analysen av Western blot-bånd. Student t-test ble brukt for å sammenligne ubehandlede kontroller (C) og LPS-behandlede dyr i hver genotype (gjennomsnitt ± SEM, n=5–6). *, p < 0.05; ***, p < 0,001. Data er representative for fire uavhengige eksperimenter for pIKK/IKK og tre uavhengige eksperimenter for pSTAT3/STAT3. WT, vill-type; KI, GSK3 Ser389 knockin; ip, intraperitoneal; C, kjøretøy; LPS, lipopolysakkarid.

3. Diskusjon

I hjernen er dysregulering av GSK3-aktivitet knyttet til flere nevropatologier der kronisk betennelse er et vanlig kjennetegn [25]. Siden en stor litteratur støtter at hemming av GSK3 ved Ser9-fosforylering oppregulerer antiinflammatoriske mediatorer og nedregulerer pro-inflammatoriske cytokiner [23,28,30], er mekanismen som vanligvis foreslås for å forklare defekt GSK3-inaktivering i nevroinflammatoriske patologier manglende fosforylering av Ser9 [3]. Imidlertid har uvanlig høye nivåer av fosfo-Ser389 GSK3 blitt oppdaget i hjernen [4], noe som tyder på at denne alternative veien for GSK3-inaktivering også kan spille en fremtredende rolle i hjernen. Eksperimentene som presenteres her avdekker implikasjonen av GSK3 Ser389-fosforylering i nevroinflammasjon, noe som legger til tidligere bevis som tyder på involvering av denne banen i hjernens DNA-reparasjon og neuronal overlevelse [6,7]. Et av nøkkelfunnene i det nåværende arbeidet er at hjernen til GSK3 Ser389 KI-mus viser vedvarende gliose og økt immuncelleinfiltrasjon, noe som stemmer overens med forestillingen om at hindring av GSK3-inaktivering gjennom Ser389-fosforylering fører til nevroinflammasjon. Data fra våre flowcytometri-eksperimenter peker tydelig på økt nevroinflammasjon hos disse dyrene, ettersom antallet aktiverte mikroglia/makrofager, ACSA 2+-astrocytter og infiltrerte nøytrofiler i hjernen til Ser389 GSK3 KI-mus var betydelig høyere. Til tross for at mikro-astrogliose tydelig ble observert ved flowcytometri, viste analyse av hippocampus-mikrografer fra hjerneseksjoner av Ser389 GSK3 KI-mus at hypertrofi av mikroglia/makrofager bare var mild. Lignende resultater ble observert når andre hjerneområder ble analysert for å vurdere omfanget og intensiteten av gliose (ikke vist). Derfor konkluderer vi med at i fravær av pro-inflammatoriske stimuli, fører mangelen på GSK3 Ser389-fosforylering til en grad av nevroinflammasjon som bør klassifiseres som lavgradig. Tallrike studier støtter assosiasjonen mellom GSK3-hyperaktivitet og nevrodegenerasjon ved nevrologiske lidelser [25]. I denne sammenhengen kan den inflammatoriske responsen som vi observerte i Ser389 GSK3 KI-mus være konsekvensen av nevrodegenerasjon, ettersom tidligere studier har oppdaget nevronal død i cortex og hippocampus til disse dyrene [6]. Dette er i samsvar med observasjonen at DNA-skade inaktiverer GSK3 gjennom Ser389-fosforylering som en mekanisme for å forhindre celledød og fremme DSB-reparasjon [7,8]. Som en konsekvens er ikke hjernen til KI-mus, der Ser389-fosforylering forhindres, beskyttet mot DSB-indusert nevronal død. Koblingen mellom fosfor-Ser389 GSK3-ekspresjon og celleoverlevelse ble først foreslått i lymfocytter, som en mekanisme involvert i den adaptive immunresponsen. Dermed ble fraværet av GSK3 Ser389-fosforylering i KI-mus funnet å indusere nekroptose i B-celler under dens sene modning, som er en svært inflammatorisk type celledød relatert til flere patologier [9]. Det er også interessant å merke seg at ikke bare Ser389-fosforylering, men også Ser9-fosforylering kan utløses for å inaktivere GSK3 som svar på DNA-skade. Ser389 GSK3 KI-mus presenterer imidlertid en nevrodegenerativ fenotype [6] som ikke er tilstede i Ser9 GSK3 KI-mus [49,50], noe som indikerer at Ser389-fosforylering spiller spesifikke roller i kontrollen av GSK3-aktivitet og at det er scenarier der Ser9-fosforylering ikke kan kompensere for tap av Ser389-fosforylering. Følgelig må den spennende koblingen mellom Ser389 GSK3-deregulering, nevroinflammasjon og nevrodegenerasjon som avdukes her, utforskes ytterligere for å avklare om endret GSK3-fosforylering ved Ser389 kan være en nøkkelfaktor i nevropatologier der kronisk betennelse er karakteristisk, for eksempel Alzheimers sykdom. I tillegg er den milde, men vedvarende aktiveringen av nevroimmune celler observert i GSK3 Ser389 KI-mus i samsvar med hypotesen om at svikt i å fosforylere Ser389 kan være assosiert med immunosenescens. Dette er en aldersrelatert prosess preget av en nedgang i immunfunksjoner sammen med en økning i uttrykket av proinflammatoriske mediatorer; som fører til kronisk lavgradig betennelse [1,51]. Flere forfattere har pekt på involvering av GSK3-deregulering i aldersrelatert betennelse [1,52]. Det har også blitt foreslått at den unormale funksjonen til mikroglia observert i sammenheng med hjerneimmunosenescens til slutt kan forårsake nevrodegenerasjon [53]. Dermed kan akselerert immunosenescens i Ser389 GSK3 KI-mus bidra til tap av nevroner som tidligere er rapportert i disse dyrene [6]. LPS har blitt mye brukt for å indusere betennelse i både "in vivo" og "in vitro" modeller. Imidlertid er det bevis på at dosen av LPS administrert i stor grad bestemmer typen inflammatorisk respons indusert [54–56]. Høye doser LPS produserer septiske sjokklignende responser; mens moderate LPS-doser utløser en vedvarende lavgradig betennelse nærmere det som er observert ved mange kroniske sykdommer [42]. I denne sammenheng er det viktig å understreke at LPS-dosen valgt for våre eksperimenter (0,5 mg/kg, ip) er moderat og er langt fra LD50 rapportert for LPS hos mus (10–25 mg/kg) [57,58 ]. I samsvar med tidligere rapporter [40,59] fant vi at en slik LPS-dose ikke er dødelig og er tilstrekkelig til å øke gliose og hjerneinfiltrasjon av nøytrofiler i WT-dyr, mens lymfocyttinfiltrasjon ikke påvirkes. Bemerkelsesverdig nok ble en slik moderat (men signifikant) LPS-respons opphevet i hjernen til KI-mus med svekket inaktivering av GSK3 ved Ser389-fosforylering. I følge denne observasjonen kan utvidet GSK3-hyperaktivering i hjernen til slutt nedregulere følsomheten for pro-inflammatoriske fornærmelser. Det er bemerkelsesverdig at den defekte responsen på LPS hos mutantmusene er forenlig med mekanismen for immuntoleranse eller resistens, en vanlig prosess i CNS rettet mot å redusere gliacelleaktivering og begrense hjerneskade fra overdreven betennelse [60,61]. I samsvar med denne ideen viste en tidligere studie at GSK3-aktivering hos mus kan indusere immuntoleranse og undertrykke LPS-responser [62].

Fordeler med cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

Det er også interessant å vurdere at hjerneeffektene beskrevet i denne studien viser høy spesifisitet. I motsetning til hjernen, presenterte de fleste miltcellepopulasjoner evaluert i WT- og Ser389 GSK3 KI-dyr den samme profilen under ustimulerte forhold, så vel som en lignende respons på LPS. Dette antyder at GSK3-inaktiveringsveien avhengig av Ser389-fosforylering spiller spesifikke roller i reguleringen av nevroinflammasjon. I samsvar med denne hypotesen viser hjerneceller et høyt uttrykk av fosfo-Ser389 GSK3 sammenlignet med andre vev, og dette uttrykket er tett regulert under utvikling av hjernen [5]. Til slutt, ifølge våre funn, er reguleringen av GSK3 ved fosforylering ved Ser389 spesifikt mediert av NF-kB-signalveien, siden STAT3-aktivering var upåvirket i Ser389 GSK3 KI. Mange nedstrøms inflammatoriske mediatorer er regulert av NF-kB-aktivering, inkludert cytokiner, reseptorer, transkripsjonsfaktorer og enzymer. Å identifisere hvilke av disse NF-kB-målene som er påvirket av Ser389 GSK3-fosforylering er utenfor rammen av vårt arbeid, men det vil være et spennende mål for fremtidige studier som tar sikte på å klargjøre mekanismene for nevroinflammasjon.

4. Materialer og metoder

4.1. Dyr

C57BL/6J Wild-type (WT) mus ble kjøpt fra Jackson Laboratories. C57BL/6 GSK3 Ser389 KI-mus, hvor Ser389-resten av GSK3 ble erstattet av Ala for å forhindre fosforylering, ble generert som tidligere beskrevet [8]. Alle mus ble holdt i dyreanlegget tilknyttet Albacete Medical School under en 12-lys/mørke-syklus. Mat og vann ble gitt ad libitum. Fire til seks måneder gamle voksne mus ble brukt til eksperimentene.

4.2. LPS administrasjon

For å indusere en inflammatorisk respons, fikk mus en enkelt intraperitoneal (ip) injeksjon av {{0}},5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (serotype typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Madrid, Spania) ble oppløst i sterilt, endotoksinfritt 0,9 % saltvann ved 10 mg/ml. Tre dager etter behandling ble mus avlivet, og hjernen og milten ble fjernet for immunhistokjemi eller flowcytometrianalyse av gliaceller og infiltrerte immunceller. For Western blotting-analyse ble dyrene avlivet 4 timer etter ip-injeksjon av 0,5 mg/kg LPS, da LPS tidligere har blitt rapportert å oppregulere inflammatoriske proteiner i muse- og rottehjerner 2-4 timer etter ip-administrering [63,64].

4.3. Flowcytometri

For flowcytometrianalyse av hjernevev og miltceller ble dyr bedøvet med en ip-injeksjon av tribrometanol, som er anbefalt for akutte terminale studier. Den lave dosen av tribrometanol som brukes (200 mg/kg) gir lett anestesi uten alvorlige bivirkninger eller påvirkning på inflammatorisk cytokinekspresjon [65]. Dyreprosedyrer ble utført etter å ha verifisert fraværet av reflekser.

4.3.1. Hjernevevsdissosiasjon og Percoll-gradientisolering av nevrale celler

Mus ble perfusert intrakardialt med 50 mL 0,9 % NaCl før vevsinnsamling for å fjerne sirkulerende celler fra hjernens blodårer. Etter perfusjon ble hjernen fjernet, hjernehinnene og choroid plexus ble forsiktig separert, og lillehjernen og luktløkene ble kastet. Det gjenværende vevet ble plassert i kald Hank's Balanced Salt Solution, som er fri for kalsiumklorid og magnesiumklorid (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Madrid, Spania, 14175). Vevsprøver ble deretter finhakket med en skalpell før fordøyelsen. Oppkuttet vev ble deretter plassert i MACS C-rør (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Spania, 130-093-237) ​​i et totalt volum på 5 ml, og behandlet med en mekanisk dissosiator ved 6 rpm i 30 minutter. Enzymatisk dissosiasjon ble utført i henhold til vår egen protokoll [31] ved bruk av papain (100 U; Worthington, LK003178) og dispase II (6 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spania, D4963) i Earle's Balanced Salt Solution (EBSS [+]CaCl2 /[+]MgSO4; Gibco, Madrid, Spania, 24010). DNAse I (100 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Spania, DN25) ble tilsatt til løsningen for å fjerne DNA-slimet som negativt påvirker cellelevedyktigheten [66]. Før bruk ble papain aktivert i 30 minutter ved 37 ◦C i 5 % CO2. For å stoppe fordøyelsen ble prøver fortynnet med kald HBSS og plassert på is. Denne løsningen ble deretter pipettert 10 ganger ved bruk av 5 ml pipetter og filtrert gjennom en 70 µm cellesil (BD, 352350). Den resulterende enkeltcellesuspensjonen ble sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. En 30 % PercollTM (GE Healthcare, Madrid, Spania, 17-0891-01) gradient ble brukt for å fjerne myelin og berike homogenatet til levedyktige gliaceller. For dette formål ble en stamløsning av isotonisk Percoll (SIP) fremstilt (9:1 Percoll i 10× HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2; Gibco, 14185), og cellepelleter ble resuspendert i 30 % (v/ v) SIP (i 1× HBSS). 30 % Percoll-gradienten ble utført ved å tilsette 3 mL SIP til 7 mL 1 x HBSS inneholdende cellesuspensjonen i et 14 mL polypropylenrør. Hver gradient ble sentrifugert uten brems ved 300 x g i 30 minutter ved 18 ◦C. Etter sentrifugering ble cellene fra bunnlaget samlet, vasket med 1 x HBSS, sentrifugert i 10 minutter ved 300 x g og resuspendert i 10 ml 1 x lyseringsbuffer for røde blodlegemer ved 4 ◦C. Etter lysering ble cellesuspensjon sentrifugert ved 300 x g i 10 minutter, og den resulterende cellepelleten ble til slutt resuspendert i 50 µL blokkeringsbuffer før farging for flowcytometri.

4.3.2. Miltcelledissosiasjon

Miltene ble plassert på en petriskål inneholdende RPMI 1640 og kuttet i små biter. Det resulterende vevet ble ført inn i en 70 µm cellesil (BD, 352350) og brutt opp i en sirkulær bevegelse med den ribbede toppen av en sprøytes stempel. RPMI 1640 ble deretter ført gjennom silen. Det desintegrerte vevet ble overført til 50 ml rør (Sarstedt, Barcelona, ​​Spania, 62.547.254) og sentrifugert ved 100 g i 10 minutter. Supernatanten inneholdende cellesuspensjonen ble deretter samlet og sentrifugert igjen ved 300 g i 10 minutter. Den resulterende supernatanten ble fjernet, og pelleten ble resuspendert i 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) med 1 % FBS for å telle antall celler under mikroskopet, hvoretter den ble sentrifugert på nytt ved 300 g i 5 minutter. Bare 500,000 celler per prøve ble brukt. Hver prøve ble deretter resuspendert i 50 µL blokkeringsbuffer før farging for flowcytometri.

4.3.3. Ekstracellulær flowcytometri-farging

Tabell 2. Antistoffer og reagenser brukt til flowcytometrianalyse.

4.4. Immunhistokjemi

Mus ble dypt bedøvet og intrakardialt perfusert med saltvann {{0}},9 % (vekt/volum). Hjernene deres ble samlet og etterfiksert med 4% paraformaldehyd i 24 timer. Etter postfiksering ble de kryobeskyttet med 30 % sukrose og frosset ved -20 ◦C inntil seksjonering. Vevsseksjoner (20 µm) ble kuttet ved hjelp av en kryostat (ThermoFisher, Microm™ HM550), tint montert på Superfrost Plus-objektglass (ThermoFisher, J1800AMNZ) og til slutt lagret ved -20 ◦C til farging. Immunhistokjemisk farging av vevssnitt ble utført som beskrevet tidligere [67]. Primære og sekundære antistoffløsninger ble fortynnet i 1 x PBS med 1 % BSA. Seksjonene ble inkubert med det primære antistoffet anti-kanin Iba-1 (1:500 fortynning; Wako Chemicals, Barcelona, ​​Spania, 019-19741). Alexa Fluor 488-konjugert geit-anti-kanin IgG (1:2000 fortynning; ThermoFisher, Madrid, Spania, A11031) ble brukt som sekundært antistoff. Passende positivt kontrollvev ble inkludert, samt primære og sekundære negative kontroller. Fluorescerende merkingsbilder ble tatt med en ZEISS Apotome. 2 mikroskop med et axiom 503 mono digitalkamera og Zen Blue-kontrollprogramvaren versjon 2.3 (Carl Zeiss). Et 10× objektiv (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0,45, AIR) ble brukt for å visualisere hippocampus. Den integrerte tettheten i områdene av interesse ble beregnet med ImageJ-programvare. Denne parameteren tilsvarer summen av intensitetsverdiene for hver piksel i den valgte regionen. Derfor brukes den for kvantifisering av antall celler farget i kombinasjon med fargeintensiteten til hver celle.

cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet

4.5. Western blot-analyse

Musehjerner ble raskt fjernet, og hippocampi ble umiddelbart dissekert og frosset. Vev ble fremstilt ved å bruke en hypertonisk lyseringsbuffer inneholdende proteasehemmere som tidligere beskrevet [68]. De primære antistoffene som ble brukt var anti-kanin fosfor-IKK / (1:1000 fortynning; Cell Signaling, Alcobendas, Spania, 2861), anti-kanin IKK / (1:1000 fortynning; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland, sc{{ 9}}), anti-kanin fosfor-STAT3 (1:1000 fortynning; Cell Signaling, 9145) og anti-mus STAT3 (1:1000 fortynning; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Anti-mus-tubulin (1:2000 fortynning; Santa Cruz Biotechnology, sc-32293) ble brukt som en ladekontroll. Anti-kanin HRP (1:5000 fortynning; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, USA, 111-035-144) og anti-muse HRP (1:5000 fortynning; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003) ble brukt som sekundære antistoffer . Proteinbåndkvantifisering ble utført ved bånddensitometrianalyse med NIH ImageJ Software (versjon 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, åpnet 1. mars 2022). For å sikre like belastninger, ble den integrerte tettheten oppnådd for hvert bånd uttrykt som en relativ verdi i forhold til passende husholdningsbelastningskontroll.

4.6. Statistisk analyse

Resultatene ble statistisk analysert med GraphPad Prism-programvaren (San Diego, CA, USA). Data presenteres som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM) for generelt fire uavhengige eksperimenter (n {{0}}–9). Etter å ha bekreftet normalfordelingen av data ved Shapiro-Wilk-testen, ble statistisk signifikans mellom de to gruppene bestemt av Student t-testen for parametriske data. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikante når sannsynlighetsverdier (p) var mindre enn 0.05 (*), 0,01 (**) eller 0,001 (***). Figurer viser representative eksperimenter.

5. Konklusjoner

Oppsummert indikerer funnene våre at manglende inaktivering av GSK3 ved Ser389-fosforylering fører til kronisk betennelse og endotoksintoleranse, og at hemmingen av GSK3 ved Ser9- og Ser389-fosforylering spiller komplementære og ikke overflødige roller i den nevroimmune responsen. Derfor bør de spesifikke konsekvensene av GSK3 Ser389-fosforylering for nevropatologi og hjernealdring undersøkes.

Referanser

1. Souder, DC; Anderson, RM Et ekspanderende GSK3-nettverk: Implikasjoner for aldringsforskning. Gerovitenskap 2019, 41, 369–382. [CrossRef] [PubMed]

2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, M.; Jin, O.; Woodgett, JR Krav til glykogensyntase-kinase-3 i celleoverlevelse og NF-KB-aktivering. Nature 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]

3. Jope, RS; Johnson, GV Glamouren og dysterheten til glykogensyntasekinase-3. Trender Biochem. Sci. 2004, 29, 95–102. [CrossRef]

4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, B.; tre, CD; Aronshtam, A.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, B.; et al. Fosforylering av p38 MAPK som en alternativ vei for GSK3beta-inaktivering. Science 2008, 320, 667–670. [CrossRef]

5. Calvo, B.; Thornton, TM; Rincon, M.; Tranque, P.; Fernandez, M. Regulering av GSK3 ved Ser 389 fosforylering under nevral utvikling. Mol. Neurobiol. 2020, 58, 809–820. [CrossRef] [PubMed]

6. Thornton, TM; Hare, B.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Failure to Inactivate Nuclear GSK3 av Ser 389-Fosforylering fører til fokal nevronal død og langvarig fryktrespons. Nevropsykofarmakologi 2018, 43, 393–405. [CrossRef] [PubMed]

7. Hare, BD; Thornton, TM; Rincon, M.; Golijanin, B.; King, SB; Jaworski, DM; Falls, WA To uker med variabel stress øker gamma-H2AX-nivåene i musesengkjernen til stria terminalis. Nevrovitenskap 2018, 373, 137–144. [CrossRef]

8. Thornton, TM; Delgado, P.; Chen, L.; Salas, B.; Krementsov, D.; Fernandez, M.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; et al. Inaktivering av kjernefysisk GSK3beta ved Ser (389)-fosforylering fremmer lymfocyttegnethet under DNA-dobbeltrådbruddsrespons. Nat. Commun. 2016, 7, 10553. [CrossRef]

9. Pasparakis, M.; Vandenabeele, P. Necroptosis og dens rolle i betennelse. Natur 2015, 517, 311–320. [CrossRef]

10. Jope, RS; Cheng, Y.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. Stresset og betent, kan GSK3 beskyldes? Trender Biochem. Sci. 2017, 42, 180–192. [CrossRef]

11. Beutler, B.; Rietschel, ET Medfødt immunfornemmelse og dens røtter: historien om endotoksin. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 169–176. [CrossRef] [PubMed]

12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Dynamisk modulering av medfødt immunrespons ved å variere doser av lipopolysakkarid (LPS) i humane monocytiske celler. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584–21590. [CrossRef]

13. Lu, YC; Ja, WC; Ohashi, PS LPS/TLR4 signaltransduksjonsvei. Cytokine 2008, 42, 145-151. [CrossRef] [PubMed]

14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, SY GSK3-hemmerpeptid beskytter mus mot LPS-indusert endotoksinsjokk. Immunnett. 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]

15. Piazzi, M.; Bavelloni, A.; Cenni, V.; Faenza, I.; Blalock, WL Revisiting rollen til GSK3, en modulator av medfødt immunitet, i idiopatisk inkluderingskroppsmyositt. Cells 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]

16. Vines, A.; Cahoon, S.; Goldberg, I.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Ny antiinflammatorisk rolle for glykogensyntasekinase-3beta i hemming av tumornekrosefaktor-alfa- og interleukin-1beta-indusert inflammatorisk genuttrykk. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985–16990. [CrossRef]

17. Hoffmeister, L.; Diekmann, M.; Brand, K.; Huber, R. GSK3: En Kinase Balancing Promotion and Resolution of Inflammation. Celler 2020, 9, 820. [CrossRef]

18. Beurel, E.; Jope, RS Lipopolysakkarid-indusert interleukin-6-produksjon kontrolleres av glykogensyntase-kinase-3 og STAT3 i hjernen. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [CrossRef]

19. Wang, M.; Huang, H.; Chen, W.; Chang, H.; Kuo, J. Glykogensyntasekinase-3-inaktivering hemmer produksjon av tumornekrosefaktor i mikroglia ved å modulere nukleær faktor κB og MLK3/JNK-signaleringskaskader. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [CrossRef]

20. Priego, N.; Valiente, M. Potensialet til astrocytter som immunmodulatorer i hjernesvulster. Front. Immunol. 2019, 10, 1314. [CrossRef]

21. Vandenbark, AA; Offner, H.; Matejuk, S.; Matejuk, A. Microglia og astrocyttengasjement i nevrodegenerasjon og hjernekreft. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]

22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Hen, R.; Avila, J. Redusert kjernefysisk beta-catenin, tau-hyperfosforering og nevrodegenerasjon i GSK-3beta betingede transgene mus. EMBO J. 2001, 20, 27–39. [CrossRef] [PubMed]

23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, K.; Roa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, M.; Velasco, CD; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, P.; Saez, MA; et al. Inhibering av Gsk3b reduserer Nfkb1-signalering og redder synaptisk aktivitet for å forbedre Rett-syndrom-fenotypen i Mecp2-knockout-mus. Celle. Rep. 2018, 23, 1665–1677. [CrossRef] [PubMed]

24. Martin, M.; Rehani, K.; Jope, RS; Michalek, SM Toll-lignende reseptor-mediert cytokinproduksjon er differensielt regulert av glykogensyntase kinase. Nat. Immunol. 2005, 6, 777–784. [CrossRef]

25. Rippin, I.; Eldar-Finkelman, H. Mekanismer og terapeutiske implikasjoner av GSK-3 ved behandling av nevrodegenerasjon. Celler 2021, 10, 262. [CrossRef]

26. Androulidaki, A.; Iliopoulos, D.; Arranz, A.; Doxaki, C.; Schworer, S.; Zacharioudaki, V.; Margioris, AN; Tsichlis, PN; Tsatsanis, C. Kinasen Akt1 kontrollerer makrofagrespons på lipopolysakkarid ved å regulere mikroRNA. Immunitet 2009, 31, 220–231. [CrossRef]

27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, M.; Obermeier, F.; Ruemmele, P.; Kitani, A.; Brunner, SM; Haimerl, M.; Geissler, EK; Strober, W. IL -13 orkestrerer oppløsning av kronisk tarmbetennelse via fosforylering av glykogensyntase kinase-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969–3980. [CrossRef]

28. Nagao, M.; Hayashi, H. Glykogensyntasekinase-3beta er assosiert med Parkinsons sykdom. Neurosci. Lett. 2009, 449, 103–107. [CrossRef]

29. Nadri, C.; Kozlovsky, N.; Agam, G.; Bersudsky, Y. GSK-3 parametere i lymfocytter hos schizofrene pasienter. Psykiatri Res. 2002, 112, 51–57. [CrossRef]

30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glykogensyntase-kinase-3 (GSK3): Betennelse, sykdommer og terapi. Neurochem. Res. 2007, 32, 577–595. [CrossRef]

31. Calvo, B.; Rubio, F.; Fernandez, M.; Tranque, P. Dissosiasjon av hjernen hos nyfødte og voksne mus for samtidig analyse av mikroglia, astrocytter og infiltrerende lymfocytter ved flowcytometri. IBRO Rep. 2020, 8, 36–47. [CrossRef] [PubMed]

32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, A.; Arbour, N. En optimalisert metode for å behandle mus CNS for samtidig å analysere nevrale celler og leukocytter ved flowcytometri. J. Neurosci. Metoder 2015, 247, 23–31. [CrossRef] [PubMed]

33. Batiuk, MY; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, T.; Saido, T.; Fiers, M.; Belgard, TG; Holt, MG En immunoaffinitetsbasert metode for isolering av ultrarene voksne astrocytter basert på ATP1B2-målretting av ACSA-2-antistoffet. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874–8891. [CrossRef] [PubMed]

34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP Bruken av flowcytometri for å evaluere tidsmessige endringer i inflammatoriske celler etter fokal cerebral iskemi hos mus. Brain Res. 2002, 932, 110–119. [CrossRef] [PubMed]

35. Kantzer, CG; Boutin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninkovic, J.; et al. Anti-ACSA-2 definerer et nytt monoklonalt antistoff for prospektiv isolering av levende neonatale og voksne astrocytter. Glia 2017, 65, 990–1004. [CrossRef]

36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, A.; Colomer, T.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Genekspresjonsanalyse av astrocytt og mikroglia endocannabinoid signalering under autoimmun demyelinisering. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]

37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Kubes, P. Splenic Ly6Ghigh modne og Ly6Gint umodne nøytrofiler bidrar til utryddelse av S. pneumoniae. J. Exp. Med. 2017, 214, 1333–1350. [CrossRef]

38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, X.; Lee, B.; Chew, V.; Li, H.; Tan, B.; Lim, S.; et al. Immunhistokjemisk skåring av CD38 i tumormikromiljøet forutsier respons på anti-PD-1/PD-L1-immunterapi ved hepatocellulært karsinom. J. Immunother. Kreft 2020, 8, e000987. [CrossRef]

39. Okuyama, S.; Makihata, N.; Yoshimura, M.; Asakura, Y.; Yoshida, T.; Nakajima, M.; Furukawa, Y. Oenothein B undertrykker lipopolysakkarid (LPS)-indusert betennelse i musehjernen. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 9767–9778. [CrossRef]

40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, I.; Cifelli, G.; Madonna, M.; Cocozza, G.; Frati, A.; Carullo, P.; Carnevale, L.; et al. Rollen til nevroinflammasjon i hypertensjon-indusert hjerneamyloidpatologi. Neurobiol. Aldring 2012, 33, e19–e205. [CrossRef]

41. Zhang, J.; Xue, B.; Jing, B.; Tian, ​​H.; Zhang, N.; Li, M.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, H.; Chen, Y. LPS aktiverer nevroinflammatoriske veier for å indusere depresjon i Parkinsons sykdom-lignende tilstand. Front. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4

2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Y.; Sheridan, JF; Quan, N. Nevrale og atferdsmessige responser på lavgradig betennelse. Oppførsel. Brain Res. 2012, 235, 334–341. [CrossRef] [PubMed]

43. Kang, J.; Park, D.; Shah, M.; Kim, M.; Koh, P. Lipopolysakkarid induserer neuroglia-aktivering og NF-KB-aktivering i hjernebarken til voksne mus. Lab. Anim. Res. 2019, 35, 19. [CrossRef]

44. Khan, MS; Ali, T.; Abid, MN; Jo, MH; Khan, A.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Kim, MO Litium forbedrer lipopolysakkarid-indusert nevrotoksisitet i cortex og hippocampus i den voksne rottehjernen. Neurochem. Int. 2017, 108, 343–354. [CrossRef] [PubMed]

45. Paxinos, G.; Franklin, KB Musehjerne i stereotaksiske koordinater. 2001. Tilgjengelig på nettet: https://books.google.es/books/ about/The_Mouse_Brain_in_Stereotaxic_Coordinat .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (åpnet 1. mars 2022).

46. ​​Bronte, V.; Pittet, MJ Milten i lokal og systemisk regulering av immunitet. Immunitet 2013, 39, 806–818. [CrossRef]

47. Liu, T.; Zhang, L.; Joo, D.; Sun, S. NF-KB-signalering ved betennelse. Signaloverføring. Mål. Ther. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]

48. Balic, JJ; Albargy, H.; Luu, K.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baschuk, N.; Louis, C. STAT3 serin-fosforylering er nødvendig for TLR4 metabolsk omprogrammering og IL-1-uttrykk. Nat. Commun. 2020, 11, 3816. [CrossRef]

49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET Wnt-poolen av glykogensyntasekinase 3beta er kritisk for trofisk-deprivasjon-indusert nevronal død. Mol. Celle. Biol. 2008, 28, 1515–1527. [CrossRef]

50. Eom, T.; Jope, RS Blokkert hemmende serin-fosforylering av glykogensyntase kinase-3 / svekker in vivo neural forløpercelleproliferasjon. Biol. Psykiatri 2009, 66, 494–502. [CrossRef] 5

1. Franceschi, C.; Campisi, J. Kronisk betennelse (betennelse) og dens potensielle bidrag til aldersassosierte sykdommer. J. Gerontol. Ser. En Biomed. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [CrossRef]

52. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA En rolle for umodne myeloidceller i immun-senescens. J. Immunol. 2011, 186, 697–707. [CrossRef] [PubMed]

53. Tang, Y.; Le, W. Differensielle roller til M1 og M2 mikroglia i nevrodegenerative sykdommer. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 1181–1194. [CrossRef] [PubMed]

54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Systemisk betennelse og mikroglial aktivering: Systematisk gjennomgang av dyreforsøk. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]

55. Furube, E.; Kawai, S.; Inagaki, H.; Takagi, S.; Miyata, S. Hjerneregionavhengig heterogenitet og doseavhengig forskjell i forbigående mikrogliapopulasjonsøkning under Lipopolysakkarid-indusert betennelse. Sci. Rep. 2018, 8, 2203. [CrossRef]

56. Brandi, E.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, A.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Hjerneregionspesifikk mikroglial og astrocytisk aktivering som respons på systemisk eksponering av lipopolysakkarider. Front. Aldrende Neurosci. 2022, 14, 910988. [CrossRef]

57. Radulovic, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaya, B.; Steinert, A.; Niess, JH Injeksjoner av lipopolysakkarid i mus for å etterligne inngangen til mikrobielle avledede produkter etter brudd på tarmbarrieren. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [CrossRef]

58. Fink, MP Dyremodeller av sepsis. Virulens 2014, 5, 143–153. [CrossRef]

59. Zhou, H.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Rolle til endotelial TLR4 for nøytrofil rekruttering til sentralnervesystemets mikrokar ved systemisk betennelse. J. Immunol. 2009, 183, 5244–5250. [CrossRef]

60. Beurel, E. HDAC6 regulerer LPS-toleranse i astrocytter. PLoS ONE 2011, 6, e25804. [CrossRef]

61. Yao, L.; Li, P.; Chen, Q.; Hu, A.; Wu, Y.; Li, B. Beskyttende effekter av endotoksintoleranse på perifer lipopolysakkarid-indusert nevroinflammasjon og dopaminerg nevronal skade. Immunopharmacol. Immunotoksikol. 2022, 44, 326–337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, X.; Ivashkiv, LB Tumornekrosefaktor induserer GSK3-kinasemediert krysstoleranse for endotoksin i makrofager. Nat. Immunol. 2011, 12, 607–615. [CrossRef] [PubMed]

63. Yamawaki, Y.; Shirawachi, S.; Mizokami, A.; Nozaki, K.; Ito, H.; Asano, S.; Oue, K.; Aizawa, H.; Yamawaki, S.; Hirata, M. Phospholipase C-relatert katalytisk inaktivt protein regulerer lipopolysakkarid-indusert hypothalamus betennelse mediert anoreksi hos mus. Neurochem. Int. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]

64. Shah, SA; Khan, M.; Jo, M.; Jo, MG; Amin, FU; Kim, MO Melatonin stimulerer SIRT 1/Nrf2-signalveien som motvirker lipopolysakkarid (LPS)-indusert oksidativt stress for å redde postnatal rottehjerne. CNS Neurosci. Ther. 2017, 23, 33–44. [CrossRef] [PubMed]

65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Kinetikk av proinflammatoriske cytokiner etter intraperitoneal injeksjon av tribromoethanol og en tribromoethanol/xylazin-kombinasjon i ICR-mus. Lab. Anim. Res. 2011, 27, 197–203. [CrossRef] [PubMed]

66. Posel, C.; Møller, K.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Isolering og flytcytometrisk analyse av immunceller fra den iskemiske musehjernen. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]

67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, I.; Calvo, S.; Cano, E.; Tranque, P. Respons av transkripsjonsfaktor NFATc3 på eksitotoksiske og traumatiske hjernefornærmelser: Identifikasjon av en underpopulasjon av reaktive astrocytter. Glia 2011, 59, 94–107. [CrossRef]

68. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, P.; Calvo, S. Selenoprotein S uttrykk i reaktive astrocytter etter hjerneskade. Glia 2011, 59, 959–972. [CrossRef]