GTP energiavhengighet av endocytose og autofagi i den aldrende hjernen og Alzheimers sykdom

Abstrakt

Økt interesse for aldring ogAlzheimers sykdom(AD)-relaterte svekkelser i autofagi i hjernen reiser viktige spørsmål om regulering og behandling. Siden mange trinn i endocytose og autofagi avhenger av GTPaser, er nye mål på cellulære GTP-nivåer nødvendig for åevaluere energiregulering ved aldring og AD. Den nylige utviklingen av ratiometriske GTP-sensorer (GEVALS) og funnene om at GTP-nivåer ikke er homogene inne i cellene økernye spørsmål om regulering av GTPaserav den lokale tilgjengeligheten av GTP. I denne anmeldelsen fremhever vimetabolisme av GTPi forhold til Rab GTPasene involvert i dannelsen av tidlige endosomer, sene endosomer og lysosomal transport for å utføre autofagisk nedbrytning av skadet last. Spesifikke GTPaser kontrollerer makroautofagi (mitofagi), mikroautofagi og chaperonemediert autofagi (CMA). Ved slutning vil lokale GTP-nivåer kontrollere autofagi, om ikke i overkant. Ytterligere nivåer av kontroll pålegges av redokstilstanden til cellen, inkludert tioredoksininvolvering. Gjennom denne anmeldelsen legger vi vekt påaldersrelaterte endringerdet kunnebidra til underskudd i GTP og AD. Vi konkluderer med utsikter for å øke GTP-nivåer og reversere aldersrelaterte oksidative redoksskifter for å gjenopprette autofagi. Derfor kan GTP-nivåer regulere de mange GTPasene som er involvert i endocytose, autofagi og vesikulær trafficking. Ved aldring kan metabolsk tilpasning til en stillesittende livsstil svekke mitokondriefunksjonen og generere mindre GTP og redoksenergi for sunn håndtering av amyloid ogtau proteostase, synaptisk funksjon, ogbetennelse.

Nøkkelord GTP · Energi · Autofagi · Mitofagi ·Endocytose· Lysosomer ·Alzheimers · Aldring

Klikk her for å få urte-cistanhe for anti-Alzheimers sykdom

GTP, den andre energivalutaen, i aldring og AD

Syntese av høyenergimolekylene ATP og GTP er begge avhengige av redokstilstanden til NAD pluss /NADH og deres tilstrekkelige konsentrasjoner. ATP-syntese fra glykolyse er først og fremst drevet av den oksidative kraften til NAD pluss som virker på å redusere sukker. ATP-syntese ved oksidativ fosforylering i mitokondrier drives av NADH-generering i TCA-syklusen for reduksjon av pyruvat, glyserol eller fettsyrer med oksygen som den terminale elektronakseptoren i elektrontransportkjeden. Våre etikettfrie studier i levende rotte- eller mushippocampale nevroner indikerer en aldersrelatert uttømming av NAD og NADH, som kan svekke syntesen av ATP og GTP [1–4]. Denne uttømmingen ble ytterligere forverret i nevroner fra mus som bar transgener for human beta-amyloid og tau. Videre indikerte postmortem-analyse av TCA-syklusenzymer opp til 40 prosent svekkelse i TCA-syklusenzymene fra AD-hjerner sammenlignet med alderstilpassede kontroller [5]. Således kan aldersrelatert energisk uttømming av NAD pluss og NADH på toppen av AD-relatert mitokondriell svekkelse i aktiviteten til TCA-enzymer lokalt påvirke ATP- og GTP-nivåer, selv om deres bulkkonsentrasjoner var minimalt påvirket.

Energien tilgjengelig fra GTP-hydrolyse er den samme som ATP-hydrolyse, men GTP brukes til andre formål enn ATP på grunn av selektiviteten til spesifikke enzymer. GTP-konsentrasjoner i celler er i gjennomsnitt ti ganger lavere enn millimolar ATP. GTP er en viktig regulator av flere energiavhengige cellulære prosesser for proteinsyntese og vesikulær trafficking som involverer endocytose og autofagi. Den estimerte totale cellulære GTP-konsentrasjonen i pattedyrceller er i området 250–700 μM [6], men fri GTP i kreftcellefremspring er nærmere 30 μM [7]. Hovedproteiner drevet av GTP inkluderer dynaminer for membranfisjon og fusjon, de små regulatoriske GTPasene og mikrotubuli som beskrevet nedenfor. Foruten de novo syntese fra inosin av IDMPH2 og xanthosin av GMPS, er cellulære kilder til GTP primært lokaliserte nukleosid-difosfatkinaser (NDPK) fra de ikke-metastatiske genene (NME; noen ganger kalt NM23) som konverterer ATP til GTP [8]. Det er minst ti medlemmer av NME-genfamilien, men bare de fire første har nukleosid-difosfatkinaseaktivitet. I følge Allen Brain Atlas er NME1 til 4 sterkt og selektivt uttrykt i mus og menneskelig hippocampus der hukommelsen er svekket i AD. NME1–3 er cytoplasmatisk, mens NME4 er mitokondriell. Siden begge distinkte prosesser med endocytose og autofagi påvirkes i aldring og AD, antar vi at endringer oppstrøms påvirker begge, muligens alderen og AD-relaterte konsekvensen av å begrense GTP-nivåer på disse amyloid-kritiske funksjonene.

Måling av GTP-nivåer

Selv om GTP regulerer flere avgjørende prosesser for cellulær overlevelse, er det vanskelig å måle GTP-nivåer i den levende cellen under fysiologiske og patologiske forhold på grunn av den høye omsetningen og eksistensen av både en proteinbundet og fri tilstand. Bianchi-Smira glia et al. [9] beskrev en ny genetisk kodet GTP-sensor (GEVAL) basert på et gult fluorescerende protein som oppdager forholdsmessige endringer i GTP-fri og GTP-bundet konsentrasjon in vitro og in vivo. Nylig rapporterte den samme gruppen en mekanisme for regulering av GTPase Rac1 i celleinvasjon av en human melanomcellelinje drevet av lokal GTP-produksjon [7] og gjennomgikk deres metodikk [10]. Som vi vil se i denne anmeldelsen, spiller GTP en avgjørende rolle under endocytose og autofagi-relatert til amyloidbehandling. For tiden studerer vi de aldersrelaterte GTP-endringene i behandlingen av A i primærkulturer av hippocampale nevroner fra den trippel transgene 3xTg-AD-musen og dens effekt på endringer i autofagi. Figur 1 viser de foreløpige resultatene av GEVAL530-transfeksjon til primære voksne nevroner fra denne AD-musemodellen sammenlignet med ikke-transgene museneuroner. Som observert av Bianchi-Smiraglia et al. [7], ser vi en ujevn fordeling av GTP i prosessene og kantene av somaen ved måling av fritt GTP (fig. 1Aa), med lavere frie GTP-nivåer i 3xTg-AD-neuronene (fig. 1Ac). Som beskrevet i avsnitt 10, økte forbehandling av disse nevronene med en NAD pluss-forløper, nikotinamid, de frie GTP-nivåene (fig. 1Ab, d). 530-µM Kd for GEVAL530 brukt i disse eksperimentene antyder at den lokale frie GTP-konsentrasjonen er innenfor noen få ganger 530 µM. I fig. 1B undersøkte vi bundet GTP som ser ut til å være lokalisert i vesikler og økt med nikotinamid (fig. 1Bf, h), spesielt i 3xTg AD-neuronene. Foreløpige bevis indikerer at nevroner behandlet med NME1 siRNA senker deres frie GTP-nivåer (Santana Martinez, upublisert). Ytterligere studier med voksne nevroner på tvers av aldersspekteret vil bestemme aldersavhengigheten til GTP-underskudd og evnen til å utbedre dem med NAD pluss -forløpere. Gitt den essensielle rollen til GTP i vesikulære handelsprosesser av endocytose og autofagi og dette foreløpige beviset for endringer i GTP med AD-lignende genetikk, gir de følgende avsnittene detaljer om disse prosessene og effekten av aldring og Alzheimers sykdom på dem. Resultatet av denne gjennomgangen fremhever behovet for nye metoder som GEVAL-sonder for direkte å måle endringer i bundet og fri GTP og totale GTP-konsentrasjoner.

Fig. 1 Ratiometriske GTP-målinger i primære musehippocampale nevroner fra middelaldrende mus transfektert med GEVAL530-sensor Falskfargede piksel-for-piksel-ratiometriske bilder av nevroner viser uensartede fordelinger av GTP. (a) Overskudd av fri-GTP/bundet-GTP av middelaldrende (14 mnd.) ikke-transgent (NTg) ved kanter og apikal dendritt sammenlignet med (c) middelaldrende (10 mnd.) 3xTg-AD-neuron. (b, d) Økning i fritt GTP i nevroner behandlet med 2 mM nikotinamid med 24 timer. (e, g) Ubehandlede nevroner viser vesikulært bundet GTP som økes i (f, h) nevroner behandlet med 2 mM nikotinamid innen 24 timer

Endocytose: GTP-avhengighet ved aldring og AD

I endocytoseprosessen internaliserer cellen makromolekyler og ligandbundne reseptorer og overflateproteiner inkludert amyloidforløperproteinet (APP) [11] (fig. 2A). Av de to viktigste endocytiske veiene skjer plasmamembraninnstøpt APP-opptak hovedsakelig gjennom clathrin-mediert opptak (fig. 2B.1) i stedet for caveola-mediert fra cholesterolrike flekker (fig. 2B.2). Imidlertid deler hydrofob A , inn i kolesterolrike flekker av lipidflåter i plasmamembranen med påfølgende opptak av caveolabanen [12] (Fig. 2B.2). I begge tilfeller samles dynamin GTPase-komplekser ved invaginasjonen for å katalysere GTP-avhengig membrankrumning for endelig fusjon og frigjøring av modne vesikler fra plasmamembranen [13–15]. Lokal GTP-drivstoff katalyseres av NME1- og 2-nukleotidfosfatkinaser som binder seg til dynamin [16]. Tidlig endosom Rab5 GTPase-beslutning mot eksocytose og reseptorresirkulering eller transformasjon til sen endosom Rab7 GTPase for nedbrytning.

Rab5 GTPase regnes som en markør for det tidlige endosomet [17]. Rab5-protein er tilstede i plasmamembranen, i clathrin-belagte vesikler og tidlige endosomer (fig. 2). I celle- og fy-modeller av Huntingtons sykdom, deltar Rab5 i autophagosomdannelse for å regulere autofagi og eliminere giftig mutant huntingtin [18]. Hemming av Rab5 reduserer autofagi-regulerende proteaser Atg5-Atg12-konjugering, noe som resulterer i redusert autofagosomdannelse. Atg12-Atg5-konjugatet fremmer lipideringen av Atg8, og lipidert Atg8 letter autofagosomerdannelse og selektiv lastgjenkjenning under autofagi [19].

En annen medvirkende faktor til Rab5-mediert autofagi er fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K). PI3-kinasekompleks hemmer autofagi ved å aktivere Akt/mTOR-signalveien [20]. P110-underenheten til PI3K-komplekset regulerer den katalytiske aktiviteten til Vps34-komplekset for å fremme PI3P-generering [21]. Dette trinnet er avgjørende for autophagosomdannelse. P110 fremmer overgangen fra Rab5- BNP til Rab5-GTP. P110-overuttrykk reduserer autofagisk mangel etter aktivering av det makromolekylære komplekset som består av Rab5, Vps34 og Beclin1, som igjen fører til autofagosomdannelse [22]. Målretting mot disse spesifikke proteinene kan belyse terapeutiske veier for å dempe AD-patologi.

Fig. 2 Endocytose av amyloid-forløperproteinet (APP). Den N-terminale delen av APP-proteinet med 770 rester med grønn skyggelegging av den aggregeringsutsatte A krever spaltning av BACE- og Gamma-peptidaser. B Endocytose av APP. (1) Dannelse av den indre knoppen fra plasmamembranen orkestrert av clathrin med endoproteasene BACE og 훾-sekretase. Endocytose støttet av dynamin mottar lokal GTP av NME1. (2) Mikrodomener anriket på kolesterol (lipidflåter) binder APP behandlet til A eller A adsorbert fra parenkymet. (3) Tidlig endosom tiltrekker seg GTPase Rab5 som gjenkjennes av en annen GTPase, Rab11, for å mediere (4) endocytisk resirkulering av reseptorer tilbake til plasmamembranen. Alternativt (5) medierer Rab7 segregering tidlig til sene endosomer, noe som tillater videre prosessering av APP og akkumulering av A . (6) Sen endosomfusjon med (7) lysosom for å bryte ned innhold. Noe aggregert A kan være motstandsdyktig mot fordøyelsen, og med endosomavbrudd kan A akkumuleres i cytosolen.

Membranbundet Rab5 er en nøkkelfaktor for direkte å fremme Mon1-Ccz1-avhengig Rab7-aktivering og Rab7-avhengig membranfusjon [23]. Mon1-Ccz1 er et heterodimer guanin-nukleotidutvekslingsfaktor GEF-kompleks som aktiverer Rab5. Mon1-mediert forskyvning av Rab5 GEF resulterer i forskyvning av Rab5 med Rab7. C-Vps-komplekset fungerer som en GEF for Rab7 og fremmer Rab7 som går fra GDP-bundet til GTP-bundet tilstand for Rab7-aktivering. Ultrafiolett strålingsresistens-assosiert gen (UVRAG) stimulerer Rab7-aktivering ved UVRAG-C-Vps-interaksjon gjennom GDP/GTP-utveksling av Rab7 [24]. Et annet regulatorisk punkt i den autofagiske prosessen er homotypisk fusjon og vakuolproteinsortering (HOPS) kompleks som aktiverer den vakuolære gjæren Ypt-Rab GTPase under membranfusjon [25]. En av de 6 underenhetene til HOPS-komplekset er det vakuolære proteinsorteringskomplekset i klasse C (C-Vps) som inneholder Vps11, Vps16, Vps18 og Vps33. Rab7 sene endocytiske vesikler smelter deretter sammen med lysosomer for lastnedbrytning (fig. 2).

Endringer i Rab 5 og Rab 7 endosomal handel i musemodeller og i AD

I musemodeller av AD med mutasjoner i amyloid-forløperproteinet (APP) eller A-produserende presenilin, ser endosom-autophagosom-lysosom-banen ut til å være dysregulert delvis på grunn av svekket forsuring av lysosomer som ikke klarer å aktivere protease og lipaser tilstrekkelig [26]. I musemodeller av AD, store perinukleære legemer som inneholder A aggregater merkes med autophagosommarkøren LC3 kolokalisert med Rab7 og sene endosomale og lysosomale komponenter. Dette kan skyldes mislykket beskyttende oppregulering eller patologisk svekkelse. I nevroner dyrket fra 3xTg-AD-mus over hele aldersspennet fant vi at aggregert vesikulær A økte 30–50 ganger med alderen, mest fremtredende i Rab5-merkede tidlige endosomer og mitokondrier, men også i Rab{{9} }merket sene endosomer og autofagosomer [27]. Den snøballlignende akkumuleringen av A 42 og A 45 antyder at gamle nevroner ikke var i stand til å fullføre autofagisk nedbrytning av disse lengre aggregatene av A . Vi antar at nedsatt energiproduksjon i gamle nevroner begrenser den energiske kapasiteten for fullføring av autofagi. Sammenlignet med nivåene i den unge hippocampus og cortex, i 7–12-måneder gamle APP/PS1 musehippocampus, sank Rab7-nivåene sammen med reduksjoner i Beclin1- og Rubicon-aktivatorer og en økning i Rubicon-hemmeren [28]. I den yngre hippocampus og alle aldre i cortex aktiverer Beclin1 Rab7, mens Rubicon hemmer aktiveringen av Rab7 via undertrykkelse av UV-strålingsresistensassosiert genprotein (UVRAG) -vakuolært proteinsorteringsgen (Vps) interaksjon. Rab7-mangel i gjær- og fruktfluer resulterer i en massiv akkumulering av autofagosomer [29]. Rab7 knockdown inaktiverer også mTORC1/S6K1, og lokaliseringen av mTOR i sene endosomer [30]. Interessant nok endrer ikke hemmingen av andre stadier av endocytisk handel aktiviteten til mTORC1, noe som tyder på at intakte sene endosomer er avgjørende for mTORC1-signalering i autofagi. Dette er en viktig grunn til at målretting mot mTOR kanskje ikke bremser aldring eller AD.

Regionalt selektiv oppregulering av Rab 5- og Rab7-proteiner og mRNA-er i AD, antyder selektive bidrag til sykdomspatologi eller en utilstrekkelig beskyttelsesmekanisme [31]. A akkumuleres hovedsakelig i Rab7-positive sene endosomer og autofagiske vakuoler av nevronale celler [32] på en aldersrelatert måte [27] og forårsaker internalisering av A og påfølgende økning av Rab7 som utløser nevronal degenerasjon [33]. Blokkering av den sene endocytiske banen ved Rab7-undertrykkelse induserer en avhengig amyloidfibrilldannelse på celleoverflaten som forårsaker endosomal utvidelse [34] som resulterer i akselerert resirkulering av Rab7 og endocytisk trafikk av A til lysosomer for nedbrytning [35]. Hemming av Iysoso mal-proteolyse kan også påvirke den aksonale retrograde transporten av autofagiske organeller som forårsaker AD-lignende aksonal dystrofi [36]. Praktiske inngrep for å fremme Rab7-mediert autofagi kan imidlertid forsinke eller reversere AD-progresjon. Eksempler inkluderer et skifte fra en stillesittende tilstand til trening, et middelhavskosthold og energiforsterkende forbindelser som NAD-forløpere for å skape et redoksskifte [4] (avsnitt 10). En annen vei er den merkelige oppdagelsen at nivåer av guanosinmonofosfatreduktase 1 (NADPH-avhengig GMPR1) økes i AD-hjerner som i seg selv kan senke GTP-nivåer og øke AMP-signalering [37]. Nevrofibrillære floker av tau ble senket når denne aktiviteten ble hemmet i AD-mus.

Med progresjon fra mild kognitiv svikt til AD, ble både endosomale Rab5- og Rab7-uttrykk oppregulert i hippocampale CA1-nevroner målt ved transkripsjonell mikroarray [31]. Forstørrelse av Rab5-positive endosomer var assosiert med nevrofibrillære floker og amyloidavsetning. Nevrotrofiske faktorer som nervevekstfaktor (NGF) binder seg til Trk-reseptorene deres og internaliseres i Rab5-positive endosomer for å initiere nedstrøms signalering [38]. Det er interessant å merke seg at signalendosomet beholdes som Rab5 tidlige endosomer og går ikke videre til Rab7 sene endosomer under deres transitt i de lange aksonene [39]. Denne forskjellen skiller reseptormediert signallevering fra endosombehandling mot autofagi [40]. Etter aktivering av NGF, rekrutterer TrkA en Rab5-GAP for raskt å konvertere GTP-Rab5 til GDP-Rab5 for å holde nivået av GTP-Rab5 i sjakk, noe som forhindrer Rab5- til Rab7-konverteringen som resulterer i hemming av NGF/TrkA-signalering og for tidlig nedbrytning.

Rab5-funksjonen er kompromittert i de tidlige fasene av AD [41]. Vedvarende hyperaktivering av Rab5 fremmet den endocytiske veien mot sene endosomer, lysosomfusjon og autofagi, noe som resulterte i for tidlig nedbrytning av signalering av nevrotrofisk faktor og nevronal atrofi. Vps35 og Vps26, to nøkkelretromerproteiner, ble også redusert i AD-hjerner [42]. Vps26 binder seg til SorLA som er en sorteringsreseptor som kontrollerer APP-trafikk fra endosomer til Golgi. En reduksjon i Vps-retromerproteiner fører til unormalt Vps-SorLA-kompleks som hindrer APP-handel med APP-akkumulering i endosomene der det er utsatt for beta-sekretase. Imidlertid kan etterligning av APP-fosforylering ved S655, innenfor det APP 653YTSI656 basolaterale motivet, forbedre APP-uthenting i en retromer-mediert prosess som forårsaker redusert APP lysosomal målretting og redusert Abeta-produksjon [43]. En økning i full-lengde APP og APP fragment -CTF kan i sin tur heve Rab5 GTPase aktivitet som induserer utvidelse av tidlige endosomer [44]. Interessant nok kunne nevronal atrofi indusert av APP-CTF-ene reddes av en dominant-negativ Rab5-mutant både in vitro [39] og in vivo [45].

Nettoresultatet av aldring er uttømming av sene endosomer, sen endocytisk dysfunksjon og svekket lysosomal fusjon. I AD øker endocytose av A til forstørrede Rab5 tidlige endosomer. Rollen til Rab7 i AD er ennå ikke klart belyst, da både tidlig oppregulering og sen nedregulering av Rab7 har blitt observert som påvirker nevronal helse i begge retninger. Som understreket av Bianchi-Smiraglia et al. [7], total cellulær GTP som måles i homogenater tillater ikke vurdering av gratis GTP tilgjengelig lokalt for Rab GTPasene. Gratis GTP-mål er ikke rapportert ennå, så deres mulige rolle i alder og AD-relaterte svekkelser i endocytose er uutforsket. Derfor vil det være viktig å måle fritt GTP i levende celler og effekten av variasjoner i fritt GTP på endocytose som funksjon av alder og AD-modeller.

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf: pluss 86 15292862950

BUTIKK:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop