Hudblekende og anti-rynkeeffekter av bioaktive forbindelser isolert fra peanøttskall ved bruk av ultralydassistert ekstraksjon

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 og Jin Woo Kim 1,2,3,*

Abstrakt:Responsoverflatemetodikk ble brukt for å optimalisere de ultralydassisterte ekstraksjonsforholdene (UAE) for samtidig optimalisering av avhengige variabler, inkludert DPPHradical scavenging-aktivitet (RSA), tyrosinaseaktivitetsinhibering (TAI) og kollagenaseaktivitetsinhibering (CAI) av peanøttskallekstrakter. Effektene av hovedvariablene inkludert ekstraksjonstid (5.0~55.0 min, X1), ekstraksjonstemperatur (26.0~94.0 ◦C , X2), og etanolkonsentrasjon (0.0 prosent ~99,5 prosent ,X3) ble optimalisert. Basert på eksperimentelle verdier fra hver tilstand, ble kvadratiske regresjonsmodeller utledet for prediksjon av optimale forhold. Bestemmelseskoeffisienten (R2) til den uavhengige variabelen var i området 0.89~0.96, noe som viser at regresjonsmodellen er egnet for prediksjonen. Ved å forutsi optimale UAE-forhold basert på overlagringsmetoden ble ekstraksjonstid på 31,2 minutter, ekstraksjonstemperatur på 36,6 ◦C og etanolkonsentrasjon på 93,2 prosent identifisert. Under disse forholdene ble RSA på 74,9 prosent , TAI på 50,6 prosent og CAI på 86,8 prosent spådd, noe som viste god samsvar med de eksperimentelle verdiene. En omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon viste at peanøttskallekstrakt reduserte mRNA-nivåer avtyrosinase-relaterte protein-1- og matrisemetalloproteinase-3-gener i B16-F0-celler. Derfor identifiserte vihudblekingog anti-rynkeeffekter av peanøttskallekstrakter på protein- og genuttrykksnivåer, og resultatene viser at peanøttskall er et effektivt kosmetisk materiale forhudblekingog anti-rynke effekter. Basert på denne studien kan peanøttskall, som ble ansett som et biprodukt, brukes til utvikling av sunn mat, medisiner og kosmetikk.

Nøkkelord:peanøttskall; optimalisering;hudbleking; anti rynke; antioksidant;tyrosinase; kollagenase; humant tyrosinase-relatert protein-1 (TRP-1); matrise metalloproteinase (MMP)

Klikk til organiskcistanche whitening hudpleieprodukter.

1. Introduksjon

Melanin er et brun- eller svartfarget polymerpigment som syntetiseres fra melanosomer av melanocytter i epidermis. Dens hovedfunksjon er å blokkere ultrafiolette (UV) stråler for å beskytte huden. Alternativt kan overdreven produksjon forårsake pigmentmørkninger, som melasma, føflekker og aldersflekker [1–3]. Tyrosinase er et hovedenzym som katalyserer autooksidasjons- og polymerisasjonsreaksjoner, gjennom hvilke tyrosin omdannes til dopakinon via dihydroksyfenylalanin og produserer melanin gjennom dopakrom under melaninbiosyntese [4]. Dermed er det mye brukt for å redusere eller dempe melaninproduksjonen gjennom hemming avtyrosinaseaktivitet for å øke blekingseffekten av kosmetikk [5]. Rask industrialisering og økt bruk av klorfluorkarboner skadet jordens beskyttende ozonlag alvorlig, og resulterte dermed i at en større mengde UV nådde bakken og eksponerte huden. Denne økningen i UV-stråling induserer følgelig aktiv generering av reaktive oksygenarter (ROS) i menneskekroppen, slik som superoksidanioner, hydrogenperoksider og hydroksylradikaler. Slike arter har fremmet kontinuerlig oksidasjon av tyrosin, noe som resulterer i økt produksjon av melanin. I denne forbindelse gjennomføres det aktivt studier på hemming avtyrosinaseaktivitet samt fjerning av ROS for å utvikle seghudblekingmidler [6]. Kollagen er en stor ekstracellulær matrise som omfatter 90 prosent av dermis. Kollagenbeskytter og gir elastisitet til huden og er involvert i hudens mekaniske stivhet, motstand, binding av bindevev og proliferasjon og differensiering av celler [7]. Proteiner som utgjør den ekstracellulære matrisen, slik som kollagen, dekomponeres av kollagenase, slik som matrix metalloproteinase (MMP), og forårsaker rynker, redusert delastisitet og slapp hud [8]. Ulike typer MMP-er som uttrykkes ved ROS, hydrolyserer kollagenkjeden, hudens bindevev og genererer dens unormale tverrbindinger for å øke kollagennedbrytningen og akselerere dannelsen av rynker [9]. Av denne grunn har hemming av melaninproduksjon og kollagennedbrytning gjennom reduksjon av ROS-generering vært hovedfokus for hudbleking og rynkeforebygging [10]. Arbutin, kojinsyre og linolensyre, som blekende kosmetikk og retinol, gallat, andadenosin, som anti -rynkekosmetikk, har vært mye brukt de siste årene. Imidlertid er bruken av disse materialene begrenset, gitt deres ustabilitet i nærvær av lys og varme, samt bivirkninger, inkludert hudirritasjon og kontaktdermatitt [11]. Økende interesse for naturlige antioksidanter for å overvinne manglene ved konvensjonelle blekings- og antirynkeingredienser, har planteavledede ekstrakter blitt aktivt brukt for å utvikle bioaktive forbindelser for hudvennlig og tryggblekingog anti-rynkekosmetikk [12,13].

Det er ulike utvinningsmetoder som i dag brukes for utvinning av bioaktive forbindelser fra planter. Imidlertid har utvinningen av bioaktive forbindelser fra naturlige kilder, spesielt planter, hovedsakelig blitt utført gjennom løsningsmiddel-, varmtvanns- og Soxhlet-ekstraksjonsmetoder, som har vist forskjellige ulemper, inkludert lav ekstraksjonseffektivitet, ingrediensnedbrytning, lav stabilitet og høye driftskostnader. [14]. Dermed har ekstraksjonsmetoder nylig blitt testet, inkludert ultralydassistert, mikrobølgeassistert og superkritisk ekstraksjon [15]. Spesielt er ultralyd en lydbølge med en frekvens på omtrent 20 kHz eller mer, som resulterer i kompresjon, kavitasjon, andre refaksjon av væske, og derved maksimerer den molekylære bevegelsen på kort tid for å oppnå høy ekstraksjonseffektivitet [16]. Videre er ultralyd fordelaktig, ved at dens korte ekstraksjonstid minimerer nedbrytningen av bioaktive forbindelser, og den vurderes som en effektiv metode for å ekstrahere naturlige ingredienser med antioksidant,bleking, og anti-rynkeegenskaper fra mange planter og urter [17]. Optimalisering av ekstraksjonstilstand er avgjørende for å øke effektiviteten til ultralyd-assistert ekstraksjon (UAE), og optimaliseringsprosessen kan utføres enten ved eksperimentelle eller statistiske metoder. bare én faktor om gangen, har begrensninger i å bestemme de interaktive effektene hvis det er et multivariat eksperiment. På den annen side gir RSM statistisk informasjon om korrelasjonen mellom variabler i multivariate eksperimenter, sammen med effektive eksperimenter som bruker minimalt antall prøver, samt viktige matematiske og statistiske teknikker for å evaluere effektiviteten og egnetheten til regresjonsmodellen. For statistisk-basert optimalisering, ulike RSM-design, som full faktoriell design, Box-Behnken-design og sentral komposittdesign (CCD), har blitt mye brukt. Blant dem er CCD svært effektiv og gir derfor mye informasjon om eksperimentelle effekter og generelle eksperimentelle feil, med et minimum antall nødvendige kjøringer [18]. Derfor, i mange eksisterende studier, har CCD blitt mye brukt til å utvikle, forbedre og optimalisere prosessen betingelser for utvinning av ulike antioksidanter og andre metabolitter fra naturlige produkter.

Peanøtt (Arachis hypogaea) er en ettårig plante som tilhører belgfruktfamilien. Den dyrkes i mer enn 50 land rundt om i verden, inkludert Sør-Korea, India, Kina og USA [19]. Peanøtter er rike kilder til protein (25 prosent), lipider (47 prosent) og karbohydrater (16 prosent), samt mineraler, vitaminer, niacin, umettede fettsyrer og andolsyrer [20]. De konsumeres som enten ubearbeidede eller bearbeidede produkter, inkludert nøtter, smør og matolje. Det er anslått at verdens årlige peanøttproduksjon utgjør 4,1 millioner tonn totalt og at peanøttens skall utgjør 35 prosent ~40 prosent av den totale vekten til peanøtten [21]. Det er anslått at mer enn 1,5 millioner tonn peanøttskall kastes årlig som biprodukter. Men gitt at bare en del av peanøttskall brukes som dyrefôr og at de fleste av dem forbrennes eller deponeres, noe som forårsaker avhendingskostnader og miljøproblemer, er det nødvendig å produsere materialer med høy verdiøkning ved å bruke peanøttskall for å overvinne problemet med biprodukter [22 ]. Tidligere studier på antioksidanter har vist at anti-inflammatoriske og anti-fedmeaktiviteter av peanøtthudekstrakter er rapportert [23,24]. Men så langt er det ingen forskning på produksjon av funksjonelle kosmetiske materialer for forbedringblekingog anti-rynkeeffekter ved bruk av bioaktive forbindelser fra peanøttskall. Derfor ekstraherte denne studien bioaktive forbindelser fra et peanøttskall ved å bruke ultralydassistert ekstraksjon (UAE) for å bekrefte deres antioksidant-, blekings- og antirynkeeffekter og presenterte videre en optimal UAE-tilstand ved bruk av responsoverflatemetoden (RSM) og økte funksjonaliteten til ekstrakter for å bekrefte muligheten for bruk som mat, kosmetikk og medisinske ingredienser.

2. Resultater og diskusjon

2.1. Montering av RSM-modellene

I dette arbeidet ble ekstraksjonstemperatur, ekstraksjonstid og etanolkonsentrasjon valgt som hovedvariablene for CCD ved å bruke det foreløpige en-faktor-til-gangen-eksperimentet for å bestemme de signifikante variablene som påvirker UAE (tabell 1).

Deretter ble det konstruert 17 eksperimentelle kjøringer, inkludert 3 replikater ved senterpunktet ved bruk av 3-variabler og 5-nivå CCD. Eksperimentelle feil ble minimert ved å randomisere den eksperimentelle rekkefølgen for å minimere virkningen av uforklarlige variasjoner. De eksperimentelle og forutsagte resultatene for DPPH-radical scavenging-aktiviteten (RSA),tyrosinaseaktivitetshemming (TAI) og kollagenaseaktivitetshemming (CAI) er vist i tabell 2.

For å bestemme korrelasjonen mellom de 17 eksperimentelle kjøringene av CCD-eksperimentforhold og de eksperimentelle resultatene, ble flere regresjonsmodeller foreslått for å forutsi de optimale nivåene av disse 3 variablene. Ved å bruke multippel regresjonsanalyse på de eksperimentelle dataene, ble avhengige variabler (Y) og testede variabler relatert med følgende kvadratiske regresjonsligninger (tabell 3).

Variansanalyse (ANOVA) er en statistisk test for å analysere eksperimentelle data. Den deler inn den totale variasjonen i et datasett i komponentdeler som er assosiert med spesifikke variasjonskilder for å teste en hypotese om variablene til modellen eller for å estimere varianskomponenter [25]. Responsoverflateanalyse og ANOVA ble brukt for å bestemme koeffisientene, evaluere statistisk signifikans av modellbetingelsene og passe de matematiske modellene av eksperimentelle data som hadde som mål å optimalisere den generelle regionen for responsvariabler [26]. Som fastslått av modellen, var korrelasjonskoeffisientene (R2) som ble brukt for å bestemme forholdet mellom de eksperimentelle og predikerte svarene ved regresjonsmodeller i området 0.8862~0.9622. Dette antyder at de analyserte prosessvariablene forklarer mer enn 88,6 prosent av de uavhengige variablene. Design-Expert-programvaren ble brukt til å beregne koeffisientene til de kvadratiske regresjonsligningene, og modellens egnethet ble testet av ANOVA. I henhold til den monomiale koeffisientverdien til kvadratiske regresjonsligninger er oppført i tabell 4 og prioritetsrekkefølgen blant hovedeffekten til uavhengige variabler er etanolkonsentrasjon (X3) > ekstraksjonstemperatur (X2) > ekstraksjonstid (X1).

2.2. Effekt av utvinningsforhold på RSA

Tabell 2 viser eksperimentelle data for RSA i henhold til forskjellige UAE-forhold. RSA for peanøttskallekstrakt ble bestemt i området 7,6 prosent ~89,9 prosent. Den høyeste RSA ble identifisert under følgende ekstraksjonsbetingelser: ekstraksjonstid på 55,0 min, ekstraksjonstemperatur på 60.{{10}} ◦C og etanolkonsentrasjon på 5 0.0 prosent (kjør #10). Den laveste RSA på 7,6 prosent, under en ekstraksjonstid på 30.0 min, ekstraksjonstemperatur på 60,0 ◦C, og etanolkonsentrasjon på 0,0 prosent, ble identifisert som den eksperimentelle verdien (kjøring #13) . Ved å bruke multippel regresjonsanalyse ble de eksperimentelle dataene og responsene relatert til kvadratiske regresjonsligninger (tabell 3). Statistisk analyse avslørte at R2 for theregresjonsmodellen var 0,9308 (p=0.0027), noe som indikerer at denne ligningen kan forklare 93,0 prosent av resultatene fra eksperimentelle forhold, noe som antyder at modellen var svært signifikant og kunne brukes til å forutsi nøyaktig responsfunksjonen.

Effekten av en individuell UAE-variabel på faste nivåer av andre variabler på RSA er forutsagt og vist i figur 1a. RSA har en tendens til å øke og deretter avta etter hvert som alle UAE-variabler økte. Etanolkonsentrasjonen hadde størst effekt på RSA blant de tre UAE-variablene, mens ekstraksjonstid og ekstraksjonstemperatur hadde minst effekt på RSA. Dette resultatet stemmer overens med ANOVA-resultatene der etanolkonsentrasjonen viste en mer signifikant effekt (p=0.0002) på RSA som vist i tabell 4. Interaksjonseffekten mellom uavhengige variabler på RSA ble visualisert ved bruk av 3D respons overflatekurver. Ekstraksjonstemperaturen og ekstraksjonstiden ble endret samtidig ved det faste nivået av etanolkonsentrasjon (figur 2A). Etter hvert som de to variablene (ekstraksjonstemperatur og tid) økte, økte RSA til maksimumsnivået og senket igjen. Den høyeste RSA ble oppnådd ved en ekstraksjonstemperatur på 56,1 ◦C, som derfor antyder at utvinningen av bioaktive forbindelser med antioksidantpotensialer, som polyfenoler, øker med ødeleggelsen av planteveggkomponenter, som lignin, ved temperaturer opp til 56,1 ◦C; Ved høyere temperaturer ble imidlertid RSA redusert på grunn av nedbrytning eller polymerisering av antioksidantingredienser. Figur 2B, C viser at RSA ikke ble signifikant påvirket av ekstraksjonstid eller temperatur, mens RSA ble signifikant påvirket av etanolkonsentrasjon, som var høyest ved etanolkonsentrasjonen på 61,0 prosent og som også gikk ned igjen. Dette resultatet stemmer overens med det for varmtvannsekstraksjonseksperimentet til Lespedeza cuneata av Kim et al. der RSA var mer påvirket av etanolkonsentrasjon enn ekstraksjonstemperatur, og RSA var maksimum ved etanolkonsentrasjonsområdet på 60 prosent ~70 prosent [27]. Disse resultatene indikerer at ekstraksjonseffektiviteten til det binære løsningsmidlet (vann og etanol) er mer effektivt for enkelt løsningsmiddelekstraksjon i UAE av peanøttskall.

2.3. Effekt av utvinningsforhold på TAI

Tyrosinaseer et enzym som fremmer melaninproduksjonen ved å oksidere tyrosin i kjellerlaget av epidermis og hemming av dette enzymet er avgjørende for å forsterkehudbleking [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >ekstraksjonstemperatur (p < {0}}.0598) > ekstraksjonstid (p < 0.4329), som bekreftet at effekten av etanolkonsentrasjonen var den mest signifikante i TAI.

For å sammenligne effekten av UAE-forhold på TAI, ble forstyrrelsesplottet brukt for å evaluere effekten av individuelle variabler på TAI ved å fikse to variabler i midtpunktet. Som vist i figur 1b, viste TAI et annet mønster sammenlignet med det forrige RSA-eksperimentet; den økte etter hvert som etanolkonsentrasjonen økte, mens ekstraksjonstiden ikke påvirket TAI signifikant. Den betydelige proporsjonale økningen av TAI med etanolkonsentrasjon kan forklares av ANOVA-resultatene. TAI ble signifikant påvirket av primærleddet for etanolkonsentrasjon (X3), og (p < 0.05)="" den="" kvadratiske="" leddet="" er="" ikke="" statistisk="" signifikant,="" og="" viser="" derfor="" en="" sterk="" proporsjonal="" sammenheng="" mellom="" tai="" og="" etanolkonsentrasjon.="" 3d-responsoverflatekurven="" er="" den="" grafiske="" representasjonen="" av="" den="" kvadratiske="" regresjonsligningen="" og="" resultatene="" av="" tai,="" som="" påvirket="" av="" ekstraksjonstemperaturen="" (x1),="" ekstraksjonstid="" (x2)="" og="" etanolkonsentrasjon="" (x3).="" figur="" 3a="" visualiserer="" interaksjonseffekten="" av="" ekstraksjonstid="" og="" etanolkonsentrasjon="" på="" tai.="" resultatet="" bekreftet="" at="" ekstraksjonstiden="" ikke="" viste="" noen="" signifikant="" effekt="" på="" tai,="" mens="" etanolkonsentrasjonen="" hadde="" et="" sterkt="" proporsjonalt="" forhold="" til="" tai.="" tilsvarende,="" som="" vist="" i="" figur="" 3b,="" var="" tai="" mer="" avhengig="" av="" etanolkonsentrasjon="" enn="" av="" ekstraksjonstemperatur,="" og="" den="" høyeste="" tai="" ble="" oppnådd="" da="" etanolkonsentrasjonen="" økte="" til="" 99,5="" prosent.="" ved="" å="" utforske="" uae-forhold="" for="" maksimal="" tai,="" ble="" de="" maksimale="" tai-forholdene="" spådd="" til="" å="" være="" 3{{20}},0="" min,="" 26,3="" ◦c="" og="" 99,5="" prosent.="" dette="" resultatet="" ligner="" det="" som="" er="" rapportert="" av="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" i="" en="" studie="" på="" den="" biologiske="" aktiviteten="" til="" sitronblader,="" da="" 20,0="" prosent="" ~80,0="" prosent="" av="" etanol="" ble="" brukt="" som="" et="" ekstraksjonsløsningsmiddel,="" økte="" tai="" proporsjonalt="" som="" svar="" på="" økningen="" i="" etanolkonsentrasjon="" og="" viste="" maksimal="" verdi="" ved="" ekstraksjon="" ved="" bruk="" av="" 80="" prosent="" etanol.="" dette="" tyder="" på="" at="" bruk="" av="" en="" høyere="" konsentrasjon="" av="" etanol="" er="" fordelaktig="" ved="" ekstrahering="" av="" bioaktive="" forbindelser="">hudblekingeffekt fra peanøttskall eller andre planter.

2.4. Effekt av utvinningsforhold på CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >etanolkonsentrasjon (p=0.0240) > ekstraksjonstid (p=0.8505), noe som indikerer at effekten av ekstraksjonstemperatur og etanolkonsentrasjon var signifikant på CAI.

Figur 1c viser et forstyrrelsesplott der to variabler er fiksert og det visualiserte effekten av en enkelt variabel på CAI. Effektene av alle tre variablene på CAI ble vist å være like, og de tre variablene viste signifikante effekter og økte og deretter reduserte CAI etter hvert som hver uavhengig variabel økte. I vår studie ble 3D-overflateresponskurver utviklet for å visualisere interaksjonen mellom to uavhengige variabler i CAI ved bruk av kvadratiske regresjonsligninger (figur 4). Når etanolkonsentrasjonen ble fiksert ved senterpunktet, ble effekten av ekstraksjonstid og temperatur på CAI evaluert i figur 4A. Ettersom de to variablene endret seg samtidig, økte CAI til 33,4 min og 76,8 ◦C og reduserte igjen etter en maksimal CAI på 92,8 prosent. Som vist i figur 4B, C, hadde CAI den høyeste verdien ved etanolkonsentrasjonen på 64,3 prosent, og viser gradvis avtagende tendens etterpå, noe som antyder at et binært løsningsmiddel bestående av 64,3 prosent etanol er mer egnet som et ekstraksjonsløsningsmiddel. Dette resultatet stemmer overens med tidligere forskning som rapporterte at et binært løsningsmiddel av vann og etanol viste en høyere CAI enn vann ved utvinning av bioaktive forbindelser fra Orostachys japonica, noe som antyder at 50 prosent etanol ville være mer fordelaktig ved ekstraksjonhudblekingingredienser [34]. Maksimal CAI for peanøttskallekstraktet forutsagt av kvadratisk regresjonsmodellen var 94,5 prosent, som ble oppnådd under forhold med ekstraksjonstid på 45,1 minutter, ekstraksjonstemperatur på 93,6 ◦C og etanolkonsentrasjon på 42,3 prosent. CAI-verdien som ble oppnådd i vår studie var 94,5 prosent, som er mer enn dobbelt så stor som effekten av 39,4 prosent og 40,3 prosent av CAI-verdiene av grønn teekstrakter rapportert av Oh et al. [35].

2.5. Optimale utvinningsforhold

Antioksidant,hudblekingog anti-rynke effekter er alle viktige funksjoner for kosmetikk, og det er nødvendig å utlede forhold som kan maksimere disse tre funksjonene samtidig for å optimalisere UAE forhold. Figur 5 viser en optimaliseringsprosedyre som samtidig kan maksimere RSA (Y1), TAI (Y2) og CAI (Y3) ved å overlappe hver optimal tilstand til en konturgraf utledet gjennom en kvadratisk regresjonsligning. Utvalget av uavhengige variabler for optimalisering av tre variabler var begrenset til utvinningstiden på 5.0~55.0 min, ekstraksjonstemperatur på 26.{{10}}~94 .0 ◦C, og etanolkonsentrasjon på 0,0 prosent ~99,5 prosent (tabell 5). I henhold til individuelle optimale ekstraksjonsforhold var optimale UAE-forhold 31,2 minutter ekstraksjonstid, 36,6 ◦C ekstraksjonstemperatur, 93,2 prosent av etanolkonsentrasjonen, og, under forholdene ovenfor, RSA på 74,9 prosent, TAI på 50,6 prosent og CAI på 86,8 prosent ble spådd. Når de predikerte RSA-, TAI- og CAI-verdiene ble sammenlignet med de som ble oppnådd fra eksperimentet for validering, var verdiene fra valideringstesten lik de for de predikerte verdiene, der verdiene var henholdsvis 78,2 prosent, 52,3 prosent og 87,7 prosent.

2.6. Sammenligning av SE og UAE

For å bekrefte ekstraksjonseffektiviteten til UAE, sammenligner vi RSA, TAI og CAI av peanøttskallekstrakt produsert ved bruk av UAE og Soxhlet ekstraksjonsteknikker (SE). Når SE ble utført under generelle SE-forhold ved bruk av 99,5 prosent etanol ved 70 ◦C i 4 timers ekstraksjonstid, ble RSA, TAI og CAI funnet å være 75,5 prosent, 60,2 prosent og 74,4 prosent, som ikke var mye forskjellig fra resultatene oppnådd under optimale UAE-forhold. Men når SE-forholdene ble satt lik UAE-optimalforholdene på 31,2 min og 93,2 prosent etanol, reduserte RSA, TAI og CAI med henholdsvis 62,0, 28,3 og 45,6 prosent. sammenlignet med UAE under optimale forhold. Fordelen med ultralyd ved å produsere nyttige materialer fra peanøttskall ble evaluert som en prosess egnet for høy produktivitet og industrialisering på grunn av lavt forbruk av løsemidler og kort utvinningstid.

2.7. mRNA-uttrykk av MMP-3 og TRP-1

I pattedyrmelanocytter styres melanogenese og kollagenhydrolyse av henholdsvis TRP- og MMP-gener, og TRP{{0}} og MMP-3 er kjent som hovedgenene for regulering av melanogenese og kollagenhydrolyse; derfor ble RT-PCR-analyse på helcellelysater av B16-F0-celler utført og effekten av peanøttskallekstrakt produsert fra UAE under optimale forhold (31,2 min, 36,6 grader, 93,2 prosent) på mRNA-ekspresjon av MMP-3 og TRP-1 ble studert. Som figur 6 viser, nedregulerte peanøttskallekstrakt uttrykket av MMP-3 og TRP-1 i B16-F0-celler betydelig når genekspresjonseksperimentene ble utført med en peanøtt konsentrasjonsområde for skallekstrakt på 0~1 mg/ml. Peanøttskallekstraktet reduserte MMP-3- og TRP-1-uttrykket med henholdsvis 6.1- og 8.7- ganger ved 1.0 mg /ml. Disse resultatene tyder på at peanøttskallekstrakt hemmer kollagennedbrytning i B16F0-celler ved inaktivering av MMP 3 til inaktivering av MMP-1 og forstyrrer samarbeidet til MMP-9 [36]. Eksisterende studier har vist at behandling med planteekstrakter hemmet uttrykket av mikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor (MITF) ved å fosforylere ekstracellulær signalregulert proteinkinase (ERK). Således tilskrives den hemmende effekten av melaninproduksjonen av peanøttskallekstrakt hemming avtyrosinaseaktivitet gjennom ekspresjonshemming av ERK og MITF [37]. Således reduserte peanøttskallekstrakter mRNA-ekspresjonsnivåer av TRP-1 og MMP-3, noe som indikerer at peanøttskallekstrakt har sterke hemmende aktiviteter på kollagenolyse og melanogenese, noe som gjør det til et utmerket kosmetisk materiale medhudblekingog anti-rynke effekter.

3. Materialer og metoder

3.1. Materialer og reagenser

Peanøttskall ble kjøpt fra Nonghyup mart (Gochang, Jeonbuk, Korea) i 2. mars019 og skjellene ble tørket ved 60 ◦C ved bruk av tørrovn (FC 49, Lab House, Seoul, Korea) i 24 timer til tørrvekten forble konstant. Tørkede peanøttskall ble pulverisert ved hjelp av en foodprosessor (Hanil HMF-3800, Seoul, Korea) og deretter ført gjennom en 600 µms sikt. Etanol ble kjøpt fra Samchun Chemical (95,0 prosent v/v, Seoul, Korea). Folin-Ciocalteu-reagens, gallussyre (97 prosent) og quercetin ble kjøpt fra Merck (Kenilworth, NJ, USA). 2,2-difenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), askorbinsyre og 3,4-dihydroksy-L-fenylalanin (L-DOPA) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle andre kjemikalier som ble brukt i dette eksperimentet var av analytisk kvalitet og kjøpt fra Sigma-Aldrich. Alle stamløsningene ble fremstilt med renset avionisert vann ved bruk av aMilli-Q rensesystem (Millipore, Burlington, VT, USA).

3.2. Ultralydassistert ekstraksjon og Soxhlet-ekstraksjon

Pulverisert peanøttskall (1 g) ble plassert i et ekstraksjonsbeholder, hver med 10 mL løsemiddel og blandet ved bruk av vortex-mikser (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) for 1 minutt. Ekstraksjon ble utført ved å sirkulere vann i ultralydekstraktoren (250 W,SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) ved bruk av en ekstern nedkjølt badesirkulator (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Korea) ) med en digital timer og en temperaturkontroller. Ekstraksjonen ble utført med ultralydenheten utstyrt med en digital timer og en temperaturkontroller. Prøven ble sonikert i forskjellige eksperimentelle varigheter og temperaturer ved en arbeidsfrekvens på 40 kHz. Deretter ble ekstraktet sentrifugert ved 10,000 rpm i 10 minutter (236R, Labogene, Seoul, Korea). Etter sentrifugering ble prøvevolumene fylt opp til 5 ml og filtrert gjennom et 0,2 µm membranfilter før analyse. For Soxhlet-ekstraksjonen ble det pulveriserte peanøttskallet (5 g) kontinuerlig ekstrahert med 100 ml ved bruk av 99,5 prosent etanol i 4 timer (8 sykluser) ved en maksimal temperatur på 70 ◦C i et Soxhlet-apparat. Den ultralydassisterte ekstraksjonsteknikken viste seg å være svært effektiv i utvinningen av olje fra druefrø, fordelen med ultralyd, sammenlignet med de konvensjonelle ekstraksjonsmetodene både for olje og polyfenoler, var lik siden olje/polyfenolutbytte oppnådd med lavere løsemiddelforbruk og kortere utvinningstid.

3.3. Eksperimentelt design

Det eksperimentelle designet ble utført ved bruk av CCD, en type RSM for å minimere antall eksperimentelle kjøringer og studere interaksjonen mellom faktorene. TheDesign-Expert®-programvaren 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) ble brukt til utforming av eksperimenter, dataanalyse og optimalisering av ekstraksjonsbetingelser for å maksimere utvinningen av bioaktive forbindelser med antioksidanter,hudbleking, og antirynkeeffekter fra peanøttskall. Eksperimentene ble designet i henhold til CCD, verdier for rekkevidde og senterpunkt for tre uavhengige variabler som ble presentert, var basert på resultatene av foreløpige eksperimenter (tabell 1). CCD ble brukt for å forutsi de optimale UAE-forholdene for maksimering av responser inkludert RSA, TAI og CAI fra peanøttskall. Som uavhengige variabler var de tre variablene som ble valgt ekstraksjonstid (X1), ekstraksjonstemperatur (X2) og etanolkonsentrasjon (X3). Totalt 17 eksperimentelle kjøringer ble generert med tre replikasjoner på de sentrale punktene for å estimere reproduserbarheten. Den kvadratiske regresjonsmodellen ble brukt for å passe de eksperimentelle dataene og brukes til å forutsi responsvariablene, som vist i ligning (1):

Y= 0 pluss 1X1 pluss 2X2 pluss 3X3 pluss 11X12 pluss 22X22 pluss 33X32 pluss 12X1X2 pluss 13X1X3 pluss 23X2X3 (1)

hvor Y er den forutsagte responsen; 0 er konstanten (skjæringspunktet); 1, 2 og 3 er regresjonskoeffisientene for de lineære effektleddene; 11, 22 og 33 er kvadratiske effektledd; og 12, 13 og 23 er henholdsvis interaksjonseffektleddene. En responsoverflateanalyse og ANOVA ble brukt for å bestemme regresjonskoeffisientene og statistisk signifikans av modellbegrepene og for å passe til de matematiske modellene til det eksperimentelle [38].

3.4. DPPH Radical Scavenging Activity (RSA)

RSA for peanøttskallekstraktet var som beskrevet av Pereira-Caro et al. [39]. Løsning av 0.01 mM DPPH i metanol (95 prosent) ble fremstilt og 1,25 ml ble tilsatt til 0,25 ml fortynnet ekstrakt. RSA ble bestemt til å måle absorbansen ved 517 nm ved bruk av UV-Visspektrofotometer (UV1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japan) etter 20 minutters inkubering. Blank ble fremstilt ved bruk av destillert vann og RSA ble beregnet i henhold til nedenstående (ligning (2)):

RSA ( prosent )={1 −Abs (prøve) /Abs (kontroll) }× 100 (2)

3.5. Tyrosinaseaktivitetshemming (TAI)

TAI ble utført i henhold til den modifiserte metoden ved bruk av L-DOPA som substrat av Jo et al. [40]. Prøver ble blandet med 200 µL L-DOPA og 200 µL kaliumfosfatbuffer (pH 6,8) og 200 µL avtyrosinase(125 U/mL) ble tilsatt i reagensrøret og inkubert ved 37 ◦C i 20 min. Prøveabsorbansen ble målt ved 475 nm ved bruk av et UV-Vis spektrofotometer, og resultatene ble sammenlignet med kontrollen. For hver konsentrasjon ble enzymaktiviteten beregnet som en prosentandel sammenlignet med den for analysen ved bruk av en buffer uten noen inhibitor, og TAI ble beregnet basert på følgende formel. (Ligning (3)):

TAI ( prosent )={1 −Abs (kontroll) − Abs (prøve) /Abs (kontroll)}× 100 (3)

hvor Abs (kontroll) er absorbansen av buffer pluss kollagenase; Abs (prøve) er absorbansen til buffer pluss kollagenase pluss prøve/standard.

3.6. Kollagenaseaktivitetshemming (CAI)

Målingen av CAI av ekstrakter ble utført ved å modifisere metodene til Wünsch og Heindrich [41]. Substratet, 4-fenylazobezyloksylkarbonyl-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), ble oppløst i 10 ml buffer til 1,2 mg/ml og deretter ble 125 µL løsning tilsatt og inkubert i 60 minutter ved 37 ◦C. Kollagenase ble oppløst i bufferen til 0,4 mg/ml, og 75 µL enzymløsning ble tilsatt bufferløsning. Enzym-substratblandingen ble inkubert i et vannbad ved 37 ◦C i 30 minutter og reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 75 µL 20 prosent sitronsyre (vekt/volum). Etter tilsetning av 1,5 ml etylacetat ble etylacetatlaget separert og absorbansen ble målt ved 320 nm. Prosenten av inhibering ble beregnet i henhold til følgende formel.

CAI ( prosent )={1 − [Abs (kontroll) − Abs (prøve)] /Abs (kontroll)}× 100 (4)

hvor Abs (kontroll) er absorbansen av buffer pluss kollagenase; Abs (prøve) er absorbansen til buffer pluss kollagenase pluss prøve/standard.

3.7. Vedlikehold og dyrking av cellelinjer

Melaninproduserende B16-F0 melanomcelle ble hentet fra Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Korea) og ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med føtalt bovint serum (FBS, 10 prosent , Welgene, Gyeongsan, Korea) og antibiotikaoppløsning av penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA) ble brukt til trypsinisering av celler. Alle materialer som ble brukt var av cellekulturkvalitet.

3.8. Omvendt transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR)

RT-PCR ble utført for å måle endringer i MMP-3- og TRP-1-genekspresjonsnivåer assosiert medblekingog anti-rynkeeffekter ble B16-F0-celler dyrket i en 24-brønnplate behandlet med de forskjellige konsentrasjonene av peanøttskallekstrakt i serumfritt DMEM, og inkubert i 24 timer. Den ubehandlede cellekontrollen ble opprettholdt under de samme forholdene som den testede gruppen under eksperimentet. RNA-isolering fra celler ble utført ved bruk av AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, Korea). Komplementær DNA ble syntetisert ved å bruke AmfiRiert Platinum cDNA-syntese MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). RT-PCR-analyse ble utført ved å bruke CFX 96 touch PCR-systemet (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) for å bestemme mRNA-nivåer. Primerne som ble brukt var som følger: MMP-3 sense, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 og antisense, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; og TRP-1 sense, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 og antisense, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Et passende sett med primere nevnt ovenfor ble brukt til å amplifisere respektive gener ved å bruke følgende syklusbetingelser: 94 ◦C i 5 minutter, etterfulgt av 25 sykluser ved 95 ◦C i 5 s, 60 ◦C i 30 s (forMMP-3) , og 60 ◦C i 30 s (for TRP-1), og 72 ◦C for 30 s forlengelse. PCR-produktene ble elektroforert på en 1 prosent agarosegel, farget med etidiumbromid og visualisert ved bruk av Gel Doc TM XR pluss System og Quantity One programvare 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Et husholdningsprotein, -aktin, ble brukt som en belastningskontroll med antagelsen om at ekspresjonsnivåene til disse proteinene forblir konstante.

4. Konklusjoner

I denne studien ble den komplementære tilnærmingen brukt for utvinning og bruk av bioaktive stoffer fra landbruksbiprodukter av peanøttskall for å utvikle ingredienser med merverdi med flere bruksområder. Først av alt forsøkte vi å øke utvinningseffektiviteten til bioaktive forbindelser med antioksidant-, hudblekings- og antirynkeeffekter ved å optimalisere UAE-prosessen. Derfor benyttet denne studien UAE for effektiv produksjon av bioaktive forbindelser medhudblekingog anti-rynkeeffekter fra peanøttskall og anvendt statistisk-basert optimalisering for å maksimere RSA, TAI og CAI samtidig. UAE-forholdene ble optimalisert ved bruk av CCD og det ble bekreftet at valg av løsningsmiddel og konsentrasjon bør vurderes ved ekstraksjon av bioaktive forbindelser fra peanøttskall. Ved å overlappe responsflatene, ble kurver av tre avhengige variabler, en ekstraksjonstid på 31,2 minutter, ekstraksjonstemperatur på 36,6 ◦C og etanolkonsentrasjon på 93,2 prosent bestemt til å være de optimale forholdene for UAE. Det er bekreftet at RSA for peanøttskallekstrakter er svært høy og kan forventes å øke i TAI og CAI, som er indikatorer påhudblekingog anti-rynke effekter, henholdsvis. Optimaliseringen av UAE-forholdene bekreftet en økning i produksjonen av bioaktive stoffer i peanøttskall, og bleking og anti-rynkeaktiviteter av peanøttskallekstrakt gjennomtyrosinaseog nedreguleringer av kollagenaseaktivitet. Basert på dette ble effekten av peanøttskall på ekspresjonsnivåene av MMP og TRP evaluert for å vurdere om de har blekende og anti-rynkeeffekter på genekspresjonsnivå. Whitening og anti-rynkeeffekter av peanøttskallekstrakter ble bekreftet gjennom nedreguleringen av mRNA-uttrykk samt hemming av proteinuttrykk av MMP-3 og TRP-1. Derfor har peanøttskallekstrakt vist seg å være effektivtblekingog rynkeforbedring ved proteinuttrykk og gennivåer. Peanøttskallekstrakt, ved bruk av UAE, har høy antioksidantaktivitet og utmerket hudblekende og anti-rynkeeffekter, noe som gir peanøttskall et stort potensial som en naturlig kosmetikk og matingrediens. Videre antas det at produksjonen av bioaktive forbindelser ved bruk av UAE kan brukes til kommersialiseringsprosessen for produksjon av kosmetikk, mat og farmasøytiske materialer, gitt høyere produksjonsutbytte og reduserte prosesseringskostnader sammenlignet med konvensjonelle prosesser.