Høyfosforholdig diett induserer oppregulering av Bmp2 og Spp1 MRNA-ekspresjon i rottenyre

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

For å avklare mekanismen for utviklingen av nefrokalsinose indusert av en høyfosfor (P) diett, fokuserte vi på beinrelaterte proteiner som beinmorfogenetisk protein 2 og osteopontin. Denne studien undersøkte effekten av en høy-P diett på mRNA-ekspresjonen av Bmp2 og Spp1 hos rotternyre. Wistar-rotter ble delt inn i to grupper og matet en kontrolldiett (kontrollgruppe) eller en høy-P-diett (høy-P-gruppe).Nyrekalsium- og P-konsentrasjoner var signifikant økt i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. mRNA-ekspresjonen av både Bmp2 og Spp1 ble betydelig økt i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Disse resultatene indikerer at en høy-P diett induserer oppregulering av Bmp2 og Spp1 mRNA inyre.

Nøkkelord: høyfosfor diett, nefrokalsinose, Bmp2, Spp1,nyre, rotte

For mer informasjon vennligst kontakt:emily.li@wecistanche.com

cistanche for å behandle nyresykdom

Introduksjon

Nefrokalsinose er en lidelse preget av kalsium (Ca) avleiringer i nyreparenkymet. Fosfor (P) i kosten er spesielt en sentral faktor i utviklingen av denne lidelsen. Administrering av en høy-P diett har vist seg å resultere i økt Ca-konsentrasjon inyreog Ca-avleiringer i nyreparenkymet1-6）. Selv om effekten av en høy-P-diett på utviklingen av nefrokalsinose har vært fokus for pågående studier, er lite kjent om mekanismen som er ansvarlig for utviklingen av denne lidelsen. Derfor er det nødvendig med en rettidig løsning på dette problemet.

Vi rapporterte at ved histologisk undersøkelse ved bruk av transmisjonselektronmikroskopi ble det observert hydroksyapatittlignende nåleformede krystaller i nyretubuli hos rotter som ble matet med en høy-P-diett6, 7）. Røntgenmikroanalyse indikerte at Ca-avleiringer indusert av en høy-P-diett hovedsakelig består av Ca og P7）. Disse resultatene avslørte at Ca-avleiringer indusert av en høy-P-diett er en form for hydroksyapatitt. Basert på dette funnet, postulerer vi at utviklingen av nefrokalsinose styres av en mekanisme som ligner på bendannelse. Derfor fokuserte denne studien på beinassosierte proteiner som beinmorfogenetisk protein 2 (BMP2). BMP2 er en osteogen faktor som viser osteogenese-induserende aktivitet8, 9）. Det er bemerkelsesverdig at BMP2 ble identifisert som en faktor som induserer ektopiskbeinformasjon10, 11）. Derfor antok vi at hvis BMP2 spiller en viktig rolle i utviklingen av nefrokalsinose, vil uttrykket av dette proteinet inyreville bli oppregulert av en høy-P diett. Den nåværende studien hadde som mål å bestemme om en høy-P-diett påvirker mRNA-ekspresjonen av Bmp2 inyre.

I mellomtiden rapporterte vår tidligere studie at en høy-P-diett øker osteopontin (OPN)-ekspresjonen i nyretubuli ved bruk av immunhistokjemisk analyse, noe som tyder på at OPN kan være implisert i utviklingen av Ca-avleiringer indusert av en høy-P-diett12）. Derfor undersøkte vi endringene i Spp1 mRNA-uttrykk inyreogså.

Resultatene av denne studien kan gi verdifull innsikt i mekanismen som er ansvarlig for utviklingen av nefrokalsinose indusert av en høy-P diett.

Materialer og metoder

Dyr og dietter.

Denne studien ble godkjent av Animal Use Committee ved Tokyo University of Agriculture, og alle dyr ble vedlikeholdt i henhold til universitetets retningslinjer for stell og bruk av forsøksdyr (Godkjenning nr. 300049).

Det er viktig å merke seg at hunnrotter utvikler nefrokalsinose lettere enn hannrotter13, 14）. I tillegg rapporterte vi at en høy-P-diett øker OPN-uttrykk i nyretubuli hos hunnrotter12）. Den nåværende studien brukte deretter hunnrotter som forsøksdyr. Fire uker gamle Wistar-hunnerrotter (Clea Japan, Tokyo, Japan) ble holdt i individuelle bur av rustfritt ståltråd. I løpet av forsøksperioden ble burene plassert i et rom med kontrollert belysning under en 12-h lys: mørke syklus (lys, 0800-2000 t), temperaturen på 22 ± 1 grad og relativ fuktighet på 60 prosent til 65 prosent.

Sammensetningen av de eksperimentelle diettene er vist iTabelle 1. Eksperimentelle dietter ble utarbeidet med henvisning til AIN{{0}}G-dietten15). De eksperimentelle diettene inneholdt to forskjellige P-konsentrasjoner (kontrolldiett, 0,3 prosent; høy-P-diett, 1,5 prosent). P-konsentrasjonen i høy-P-dietten ble satt til 1,5 prosent siden våre tidligere studier observerte at en diett P-konsentrasjon på 1,5 prosent induserer

alvorlig nefrokalsinose6, 7, 12, 14) og høyt OPN-uttrykk12). Alle eksperimentelle dietter hadde samme konsentrasjon av Ca (0,5 prosent ). P- og Ca-konsentrasjoner, bestemt ved analyse av de eksperimentelle diettene, er vist iTabelle 1. Før studiestart ble alle rottene akklimatisert i 7 dager, hvor de fikk fri tilgang til kontrolldietten og avionisert vann. Etter akklimatiseringsperioden ble rottene tilfeldig delt inn i to grupper med tilsvarende gjennomsnittlig kroppsvekt og matet enten kontrolldietten (kontrollgruppen) eller høy-P dietten (høy-P-gruppen) i 14 dager. Rotter fikk fri tilgang til de tildelte eksperimentelle diettene og avionisert vann gjennom hele forsøksperioden. Ved slutten av forsøksperioden ble rotter avlivet ved intraperitoneal injeksjon av anestesiblandingen (medetomidin, midazolam og butorfanol), og blod ognyreprøver ble samlet inn for analyse. Blodprøver ble sentrifugert og supernatanter ble brukt som serumprøver. Nyrer ble fjernet og nyrekapselen ble kastet. Serumet ognyrePrøvene ble lagret ved -80 grader til de ble nødvendige for analyse. Den høyre nyren ble brukt til kvantitativ analyse av Bmp2 og Spp1 mRNA, og den venstrenyreble brukt for analyse av Ca- og P-konsentrasjoner.

Mineralanalyse.

Prøver av eksperimentelle dietter ognyrerble forasket ved 550 grader i 48 timer i en muffelovn, og mineraler ble ekstrahert i 1 mol/L HCl for analyse. Ca-konsentrasjoner i forsøksdiettene ognyrerble bestemt ved atomabsorpsjonsspektrofotometri16）. P-konsentrasjoner i forsøksdiettene ognyrerble analysert ved å bruke metoden til Gomori17）.

Kvantitativ analyse av Bmp2 og Spp1 mRNA.

Totalt RNA ble isolert fra den homogeniserte nyren ved å bruke TRIzol-reagens (Life Technologies, CA, USA) i henhold til produsentens spesifikasjoner. Mengden og renheten til RNA ble vurdert ved bruk av en NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). cDNA ble syntetisert ved bruk av SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (Life Technologies) og deretter utsatt for kvantitativ sanntids RT-PCR ved bruk av SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Spesifikke primere18-20) ble brukt for analysen av Bmp2 (forover, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; revers, 5'-TTCCTGCATTTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (forover, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; revers, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3'), og Gapdh (fremover, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; revers, 5'-GCAT-CACCCCATTTGATGTT{{26} }'). Sanntids PCR-reaksjonen ble utført ved bruk av et StepOne Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, CA, USA), og mRNA-ekspresjonsnivåer ble normalisert til Gapdh mRNA-nivåer. Verdien av kontrollgruppen ble vurdert til å være 1,00.

Statistisk analyse.

Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM for hver gruppe på 6 rotter. Etter å ha gjennomført en F-test for å bestemme variansens homogenitet, ble en Students t-test brukt for å bestemme signifikante forskjeller mellom de to gruppene. Hvis homogeniteten til variansene ikke var lik, ble Welchs t-test brukt i stedet for Studentens t-test. Forskjeller ble ansett som signifikante på p ＜ 0.05

Resultater

Kroppsvekt, matinntak og serumanalyse.

Endelig kroppsvekt og matinntak ble signifikant redusert i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (Bord 2). Nyrevekt og mineralkonsentrasjoner.Nyrevåte og tørre vekter var signifikant økt i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (Bord 3). NyreCa- og P-konsentrasjoner ble også signifikant økt i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen.

Renal Bmp2 og Spp1 mRNA uttrykk.

Bmp2 mRNA-nivåer i høy-P-gruppen var signifikant økt sammenlignet med kontrollgruppen (Fig.1A). mRNA-ekspresjon av Spp1 ble også betydelig økt i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 1B).

Diskusjon

En av de velkjente fysiologiske effektene av en høy-P-diett er utviklingen av nefrokalsinose. I denne studien ble Ca- og P-konsentrasjoner i nyrene økt i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen, noe som stemmer overens med resultatene fra de tidligere studiene1-6）. Tidligere studier rapporterte at histologiske skårer for nefrokalsinose var positivt korrelert med Ca- og P-konsentrasjoner i nyrene4, 21）. Selv om ingen histologisk observasjon av nyren ble utført i denne studien, indikerer økte Ca- og P-konsentrasjoner i nyrene at nefrokalsinose ble indusert av høy-P-dietten.

Fordi Ca-avleiringer indusert av en høy-P-diett generelt antas å være en form for hydroksyapatitt6, 7), antok vi at utviklingen av nefrokalsinose kontrolleres av en mekanisme som ligner på osteo-genese. Dermed undersøkte vi effekten av en høy-P-diett på Bmp2 mRNA-ekspresjon i nyrene. Resultatene

viste at nyre-Bmp2-mRNA-ekspresjon ble økt i høy-P-gruppen og at høy-P-diett induserer oppregulering av Bmp2-mRNA-ekspresjon i nyrene. Dette funnet kan bidra til å forklare mekanismen for utvikling av nefrokalsinose indusert av en høy-P diett. Selv om definitive bevis som støtter hypotesen vår mangler, er en mulighet at uttrykket av osteogene transkripsjonsfaktorer er forhøyet i forkalkede områder i nyrene. BMP2 induserer osteoblastdifferensiering og beindannelse ved å regulere osteogene transkripsjonsfaktorer som Osterix, Runx2 og Msx28, 9）; dermed kan BMP2 fremme nefrokalsinose via regulering av slike osteogene transkripsjonsfaktorer. For tiden er den detaljerte rollen til BMP2 i utviklingen av nefrokalsinose fortsatt uklar. I tillegg, siden bare Bmp2 mRNA-ekspresjonen ble målt i denne studien, er det ikke kjent om det er en forskjell i BMP2-proteinekspresjonen. Imidlertid antyder resultatene våre en mulig mekanisme der endringer i BMP2-ekspresjon spiller en potent rolle i patogenesen av høy-P diett-indusert nefrokalsinose.

Den nåværende studien fokuserte på Spp1 mRNA-ekspresjon i tillegg til Bmp2 mRNA-ekspresjon. Vår forrige studie ved bruk av immunhistokjemisk analyse indikerte høye nivåer av OPN-ekspresjon i nyretubuli hos rotter matet med en høy-P-diett12）. Den nåværende studien fant at Spp1 mRNA-ekspresjon ble økt med omtrent 10- ganger i høy-P-gruppen. Resultater av nåværende og tidligere studier viser at en høy-P-diett induserer OPN-uttrykk i nyrene. På den annen side har andre forskere vist at OPN som steinmatrise er en viktig faktor i dannelsen av urinstein22, 23）; derfor antydet vår forrige rapport at OPN kan ha en rolle som en matrisekomponent i dannelsen av Ca-avsetninger indusert av en høy-P-diett12). Imidlertid, Paloian et al. nylig rapportert at OPN spiller en rolle i forebygging av høy-P diett-indusert nefrokalsinose hos OPN KO-mus24）. Den fysiologiske rollen til OPN på høy-P diett-indusert nefrokalsinose ser ut til å være undertrykkelse snarere enn en fremme av forkalkning inyre. Dessuten er tidligere rapporter beskrevet at OPN-nivåer øker for å oppveie ytterligere patologisk ektopisk forkalkning inyreog vaskulatur da OPN er oppregulert på stedet for patologisk forkalkning.

Som nevnt ovenfor antydet den nåværende studien viktigheten av BMP2 og OPN i høy-P diett-indusert nefrokalsinose. Det er bemerkelsesverdig at effekten av BMP2 og OPN på utviklingen av nefrokalsinose antas å være regulert av forskjellige mekanismer. Disse mekanistiske forskjellene kan indikere at den underliggende mekanismen for nefrokalsinose er komplisert. Det neste punktet å vurdere er at vekstinhibering kan ha påvirket Bmp2 og Spp1 mRNA-ekspresjon inyrefordi den nåværende studien observerte en reduksjon av endelig kroppsvekt i en høy-P-gruppe. Observasjoner i våre tidligere12） og nåværende studier kan bidra til å forklare dette punktet. Vi rapporterte tidligere økt OPN-proteinuttrykk i nyretubuli hos rotter hvis vekst

ble ikke hemmet av en høy-P-diett12）. Dessuten viste denne studien vekstinhibering i høy-P-gruppen, men høye nivåer av Spp1 mRNA-ekspresjon i nyrene. Basert på disse observasjonene ser den nåværende studien ut til å ha liten effekt av vekstinhibering av Bmp2 og Spp1 mRNA-ekspresjon. Imidlertid forblir detaljene i forholdet mellom vekstinhibering og Bmp2 og Spp1 genuttrykk uklare. Det er derfor behov for ytterligere undersøkelser for å belyse dette punktet.

Avslutningsvis, for å klargjøre mekanismen for utviklingen av nefrokalsinose indusert av en høy-P-diett, bestemte denne studien effekten av en høy-P-diett på Bmp2 og Spp1 mRNA-ekspresjon inyre. Nyre Ca- og P-konsentrasjoner var signifikant økt i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Videre ble mRNA-ekspresjon av Bmp2 og Spp1 signifikant økt i høy-P-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Disse resultatene indikerer at en høy-P diett fremmer oppregulering av Bmp2 og Spp1 mRNA-ekspresjon inyre.

Referanser

1） Hitchman AJ, har noen SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: Fosfatindusert nyreforkalkning hos rotte. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2） Parker HE: Innbyrdes forhold mellom magnesium og fosfor ved tilstrekkelig til overdreven fosfornivåer i kosten. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3) Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Fosfor-indusert nefrokalsinose og nyrefunksjon hos hunnrotter. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4） Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Konsentrasjonene og forholdet mellom kalsium og fosfor påvirker utviklingen av nefrokalsinose hos hunnrotter. J Nutr 132: 252-256, 2002

5） Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Effekter av kosttilskudd av kalsium på benmetabolisme, nyremineralkonsentrasjoner og nyrefunksjon hos rotter som er matet med en diett med høyt fosfor. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6） Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: Høyfosfor diett induserer raskt nefrokalsinose og proksimal tubulær skade hos rotter. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Effektiviteten av tradisjonell kinesisk medisin, Wulingsan, for å undertrykke utviklingen av nefrokalsinose indusert av et kosthold med høyt fosfor hos unge rotter. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Målrettet forstyrrelse i murine celler avslører et variabelt krav til Smad4 for å transformere vekstfaktorrelatert signalering. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 regulerer Osterix gjennom Msx2 og Runx2 under osteoblastdifferensiering. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10） Urist MR: Ben: Dannelse ved autoinduksjon. Science 150: 893-899, 1965

11) Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Nye regulatorer av beindannelse: Molekylære kloner og aktiviteter. Science 242: 1528-1534, 1988

12) Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: kosthold med høyt fosfor induserer osteopontinekspresjon av nyretubuli hos rotter. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13） Kusiner FB, Geary CPM: En kjønnsbestemt nyreforkalkning hos rotter. Nature 211: 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Kjønnsforskjeller i nyremineralkonsentrasjoner og utskillelse av albumin i urin hos rotter som får høyfosfor. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15） Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 rensede dietter for laboratoriegnagere: Sluttrapport fra American Institute of Nutrition ad hoc-skrivekomité om reformulering av AIN-76A rodent diet . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16） Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Bestemmelse av kalsium og magnesium i serum, urin, kosthold og avføring ved atomabsorpsjonsspektrofotometri. Clin Chem 13: 204-214, 1967

17）Gomori G: En modifikasjon av den kolorimetriske fosforbestemmelsen for bruk med det fotoelektriske kolorimeteret. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: Prenylgruppen bidrar til aktiviteter av fytoøstrogen 8-prenynaringenin for å øke beindannelsen og hemming av benresorpsjon in vitro. Endocrinology 154: 1202-1214, 2013

19） Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: Væskestrøm stimulerer ekspresjon av osteopontin og bensialoprotein av benmargsstromaceller på en tidsavhengig måte. Bone 36: 1047-1055, 2005

20) Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Karakterisering av rotte onkostatin M-reseptorkomplekset som ligner det menneskelige, men skiller seg fra den murine cytokinreseptoren. PLoS One 7: e43155, 2012

21） Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Påvirkning av kosttilskudd kalsium: fosfor-forhold på mineralutskillelse og nefrokalsinose hos hunnrotter. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Molekylær kloning og sekvensering av cDNA som koder for et urinsteinsprotein, som er identisk med osteopontin. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23）Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Struktur og uttrykk for mRNA som koder for urinsteinsprotein (Osteopontin). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24) Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontin protesterer mot høy fosfatindusert nefrokalsinose og vaskulær forkalkning. Kidney Int 89: 1027-1036, 2016

25) Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontin er forhøyet under neointima-dannelse i rottearterier og er en ny komponent i menneskelig aterosklerotisk plakk. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993