HLA-G er mye uttrykt av mastceller i regioner med organfibrose i lever, lunge og nyre
Feb 21, 2022
Abstrakt:Vi har tidligere vist at mastceller som uttrykker HLA-G er assosiert med områder med hepatitt C-virus-indusertleverfifibrose. Her hadde vi som mål å bestemme om HLA-G-ekspresjon i mastceller er spesifikt for viral etiologi,lever, eller til den generelle prosessen med fifibrose. Vi oppregnet HLA-G pluss-celler og mastceller ved immunhistokjemien til (i)leverblokkerer fra 41 tilfeller av alkoholisk skrumplever, (ii) 10 av idiopatisk pulmonal fifibrose (IPF), og (iii) 10 av renalfifibrose. Naturen til HLA-G pluss-cellene ble spesifisert ved multipleks immunofluorescens ved bruk av programvare. Mer enn halvparten av alle HLA-G pluss-celler var mastceller i fifibrotiske områder med alkoholisk cirrhose og IPF. Inyrer,utsatt for fifibrose, var HLA-G pluss-cellene faktisk mastceller, men kunne ikke telles. Dessuten, i visse tilfeller avleverog lunge, observerte vi en rekke cellulære noder, som var sekundære eller tertiære follikler, der HLA-G ble sterkt uttrykt av B-lymfocytter. Som konklusjon kunne HLA-G pluss mastceller observeres i de fifibrotiske områdene til alle organer som ble studert. Tidligere studier antyder en beskyttende rolle for HLA-G pluss mastceller mot betennelse og fifibrose. De observerte folliklene med B-lymfocytter som uttrykker HLA-G kan også forsterke deres antififibrotiske rolle.
Nøkkelord:fibrose; HLA-G; mastceller; follikler; B-lymfocytter; antifibrotisk; Nyre; Lever
IntroduksjonKroniske sykdommer som fører til organfifibrose er assosiert med betydelig dødelighet og sykelighet, og står for opptil 45 prosent av dødsfallene i utviklede land [1]. Forekomsten av fifibrotiske sykdommer øker stadig og er et viktig folkehelseproblem. Fibrotiske sykdommer kan ramme alle organer, som f.ekslever, nyrer, lunger og hjerte. Patologisk fifibrose er preget av overdreven avsetning av komponenter i den ekstracellulære matrisen (ECM), slik som kollagen. Slik ECM-akkumulering ødelegger organets normale arkitektur og fører til organdysfunksjon og svikt med endring av de spesialiserte funksjonene til hvert organ, dvs.lever, funksjonen av avgiftning, for lungen, funksjonen av gassutveksling, og fornyre,funksjonen til fifiltrering. I tillegg kan fifibrose fremme utviklingen av kreft. Transplantasjon for å erstatte det fifibrotiske organet representerer ofte det beste terapeutiske alternativet. Prosessen med fifibrose oppstår som respons på en skade eller vevsskade etter en vedvarende eller for sterk inflammatorisk respons. Fibrose, som i utgangspunktet er reversibel, kan utvikle seg til en irreversibel tilstand [2]. Deleverkan bli skadet av virus (hepatitt B, C, D, E), sopptoksiner, parasitter, autoantistoffer, et fettrikt kosthold og overdreven alkoholforbruk, som er en hyppig etiologi avleverfifibrose [3] og til og med den dominerende årsaken i visse land. Når fornærmelsene gjentas, villeverutvikler kronisk hepatitt med fifibrose etterfulgt av avansert fifibrose eller cirrhose, som er en disponerende tilstand for hepatocellulært karsinom (HCC).
I lungene representerer idiopatisk pulmonal fifibrose (IPF) den vanligste av en gruppe sykdommer som inkluderer overfølsomhetsfifibrose og revmatoid lunge. Denne kronisk progressive fifibroserende interstitielle lungesykdommen av ukjent opprinnelse er sjelden, og påvirker tre millioner mennesker over hele verden. Imidlertid er IPF assosiert med tidlig død. Faktisk fører IPF til avansert respirasjonssvikt og representerer også en uavhengig risikofaktor for lungekreft [4]. Lungetransplantasjon bør vurderes som et alternativ for unge pasienter med avansert sykdom.
Nyrefifibrose er den siste vanlige veien for mange progressivenyresykdommer.Forekomsten av kroniskenyresykdom, som fører til sluttfasennyresykdom, har økt betydelig, og påvirker 10 prosent av verdens befolkning, med høy dødelighet [5]. I tillegg pasienter med kroniskenyresykdomhar økt risiko for å utvikle segnyrekreft (opptil 10 ganger større enn den generelle befolkningen), med hyppige bilaterale og/eller multifokale skader [6].
Uavhengig av organet som utvikler fifibrose, er det viktig å forstå mekanismene som er involvert i dens fremvekst for å utvikle terapier for å forhindre det. Spesielt fører kronisk betennelse tilleverellernyrefifibrose, og kontroll av den kan gjøre det mulig å begrense progresjonen og utbruddet av organsvikt eller kreft. Cytokiner og kjemokiner spiller en sentral rolle i både orienteringen av immunresponsen og vedlikeholdet av betennelse [7,8]. I tillegg til disse immunmolekylene har andre proteiner, som HLA-G, et klasse Ib HLA-molekyl som er godt kjent for sine immunmodulerende egenskaper, blitt undersøkt [9]. Vi har tidligere vist at HLA-G uttrykkes av mastceller som er assosiert med området med hepatitt C-virus-indusertleverfifibrose [10,11]. I denne studien undersøkte vi om HLA-G-ekspresjon i mastceller er spesifikk for viral etiologi,lever, eller prosessen med fifibrose, uavhengig av organet. Vi karakteriserte HLA-G-ekspresjon i mastceller og immunceller på paraffifinblokker av kohorter av 41 pasienter med alkoholindusert cirrhose, 10 med IPF og 10 mednyrefifibrose. Nøyaktig identifikasjon av HLA-G-uttrykkende celler ble utført ved bruk av firedobbel immunofluorescens på parafifinseksjoner og programvare som separat analyserer flfluorescensen og slår den sammen på tre tilfeller avleveralkoholindusert fifibrose og to av IPF.
Resultater
Kvantitativt uttrykk og naturen til HLA-G pluss-celler i alkoholindusert fibroseEn innledende immunhistokjemistudie ble utført på en serie alkoholinduserte fifibroseprøver (n=41), som muliggjorde opptelling av HLA-G pluss- og CD117 pluss-celler over hele lysbildene ved halvautomatisk opptelling ved bruk av HALO-programvare. Resultatene er oppsummert i tabell 1.
HLA-G pluss- og CD117 pluss-celler ble talt over hele overflaten av serielle lysbilder av 41 tilfeller av alkoholisk skrumplever ved bruk av HALO-programvare med passende algoritme etter immunhistokjemi med 4H84, som gjenkjenner HLA-G, og anti-CD117/c-sett. Gjennomsnitt, standardavvik og rekkevidde er indikert for HLA-G pluss- og CD117 plus-cellene: 555 ± 699 HLA-G pluss /(41–2686) og 200 ± 271 CD 117 pluss-celler (12–1113).
De morfologiske egenskapene til HLA-G pluss-celler i alkoholindusert skrumplever tilsvarer topografisk mastceller (figur 1A). I visse tilfeller ble dobbeltmerking for CD117 og humane mastceller utført og viste at de hepatiske CD117 pluss-cellene er mastceller i det fifibrotiske området (Figur 1A). Tre representative tilfeller av alkoholindusert skrumplever ble studert ved firedobbel immunofluorescens og Sirius Red-farging ved bruk av HALO-programvare for nøyaktig å identifisere HLA-G pluss-cellene. Det gjennomsnittlige arealet av fifibrose tilsvarte 19,4 prosent avlevervev. Identifiseringen av HLA-G-celler pluss viste at 51 prosent var mastceller (tabell 2; figur 1A, 1B1) definert av human mastcelletryptase pluss CD1177 fenotype eller human mastcelletryptase pluss co-farging for CD117. Mastceller som uttrykker HLA-G var lokalisert i de fifibrotiske områdene (figur 1B1). Motsatt var 49 prosent av HLA-G pluss-cellene ikke mastceller eller CD117 pluss-celler (tabell 3) og så generelt ut til å være gruppert sammen som noder (figur 1B2). Det ble således utført annen merking på de forskjellige sonene for å identifisere disse cellene (tabell 4). Fordelingen av de forskjellige typene HLA-G pluss-celler var forskjellig avhengig av området tillevervev undersøkt (tabell 3 og 4). Totalt sett så 63 prosent av HLA-G pluss-cellene i det fifibrotiske området ut til å være mastceller mot bare 3 prosent i nodene. I tillegg uttrykte 68 prosent av HLA-G pluss-cellene i nodene CD20, en markør for B-lymfocytter (Figur 1C1), og 3 prosent CD3 (Figur 1C2). HLA-G pluss CD117 mastcelletryptase HLA-G pluss CD117 HLA-G pluss CD117 mastcelletryptase pluss, og HLA-G pluss CD117 pluss mastcelletryptase pluss celler ble talt i tre representative tilfeller avleverfifibrose ved hjelp av HALO-programvare med riktig algoritme. Cellene ble talt i to forskjellige områder av prøven av alkoholisk skrumplever, dvs. fifibrotisk område og celleknute, i et representativt tilfelle avleverfifibrose ved hjelp av HALO-programvare med riktig algoritme. Ingen HLA-G pluss-celler uttrykker CD31, en markør for endotelceller, eller CD1a, en markør for dendrittiske celler.
Figur 1. Naturen til HLA-G-celler på et representativt tilfelle avleverfifibrose. (A) I det første avsnittet viser de to bildene til venstre HLA-G og CD117 uttrykk på et representativt tilfelle avleverfifibrose av 41 tilfeller ved bruk av immunhistokjemi, med 4H84 som gjenkjenner HLA-G og CD117 antistoff som gjenkjenner c-kit-celler. Objektglassene ble motfarget med Mayer hematoxylin. Fibrosespenn er omgitt av en rød linje. Områdene i sirkler tilsvarer topografisk HLA-G og CD117 fargede lysbilder. Rektangelet viser en sterk forstørrelse av disse områdene som indikerer at de to HLA-G-cellene matcher de to CD117-cellene. Dessuten har de en morfologi som er kompatibel med en mastcelle. Bildet i dobbel flfluorescens (CD117/Mastcelletryptase) med de tre bildene til høyre som tilsvarer den enkle flfluorescensen (DAPI farger kjernene i blått, CD117 i grønt, mastcelletryptase i rødt) viser et flertall av cellene som er sammerket i gult. CD117-cellene er i stor grad mastceller. (B) Firedobbel immunoflfluorescens på et representativt tilfelle avleverfifibrose (av tre) ved bruk av DAPI med kjerner blå, HLA-G (med 4H84 antistoff) med grønn pseudo-farge, CD117 i cyan pseudo-farge, mastcelletryptase i rød pseudo-farge, og det sammensatte bildet eller flette. Til høyre er Sirius Red-farging representert. 1 og 2 tilsvarer to forskjellige områder avlever,henholdsvis fifibrosespenn og celleknute. Flertallet av HLA-G-celler uttrykker CD117 og mastcelletryptase i fifibrose (1). I motsetning til dette er flertallet av HLA-G-celler ikke co-uttrykkende mastceller, bortsett fra visse HLA-G-celler i periferien av celleknuten (2), nær eller i fifibrose. (C) Firedobbel immunoflfluorescens på nodecellene tilleverfifibrose vist i B2, med henholdsvis DAPI, HLA-G med grønn pseudo-farge, CD20 med fuchsia-rosa, eller CD3 med cyan pseudo-farge, i 1 og 2. Sirius Red-fargetilpasningen er til høyre. Firkanten viser et begrenset topografisk område som inneholder HLA-G positive celler og de tilsvarende cellene i den sonen. Det sammensatte bildet viser den rosa sammerkingen av HLA-G og CD20. Ingen co-farging er observert mellom HLA-G med grønn pseudo-farge og CD3 med cyan pseudo-farge.
Det absolutte antallet HLA-G pluss, CD3 pluss (T-lymfocytter), CD20 pluss (B-lymfocytter) og mastcelletryptase pluss (mastceller) celler ble bestemt ved bruk av HALO-programvare med passende algoritme på ett representativt tilfelle og uttrykkes per mm2.
Analyse av HLA-G pluss celler i IPFI den første studien utført på en serie med IPF (n=10) ved immunhistokjemi, som tidligere beskrevet, estimerte vi antallet HLA-G pluss-celler til å være 135 ± 62/mm2 og antallet CD117 pluss-celler til å være 227 ± 134/mm2 (tabell 5). HLA-G pluss-cellene samsvarte ikke med CD117-pluss-cellene i lungefifibrose (figur 2A). HALO-analyse av firedobbel immunofluorescens og Sirius Red-farging viste at naturen til HLA-G-celler var forskjellig avhengig av det histologiske området av lungen (tabell 6). Faktisk var 63 prosent av HLA-G pluss-celler i fifibrotiske områder mastceller (B1, C1), mens de bare utgjorde 7 prosent av HLA-G pluss-celler i nodene (B2, C2). De fleste av HLA-G pluss-cellene i nodene uttrykte CD20 samtidig (figur 2B).
Figur 2. Naturen til HLA-G-celler på et representativt tilfelle av IPF. (A) I det første avsnittet viser bildet til venstre Sirius Red-fargen av ett representativt tilfelle av ti IPF, det midterste bildet viser motfargen av Mayer hematoxylin ved bruk av immunhistokjemi. Områdene i sirkler er topografisk samsvarende på HLA-G- og CD117-fargede objektglass med 4H84 som gjenkjenner HLA-G og CD117-antistoff som gjenkjenner c-kit-celler. Rektanglene viser en sterk forstørrelse av disse områdene, noe som indikerer at HLA-G-celler ikke matcher CD117-celler. (B) Firedobbel immunoflfluorescens på et representativt tilfelle avleverfifibrose av to ved bruk av DAPI med nuclei blue, HLA-G (med 4H84 antistoff) med grønn pseudo-farge, CD117 i cyan pseudo-farge, mastcelletryptase i rød pseudo-farge, og det sammensatte bildet eller flette. Til høyre er Sirius Red representert; 1 og 2 tilsvarer to forskjellige områder av lungen, henholdsvis fifibrosespennet og celleknuten. (C) Femdobbel immunofluorescens med DAPI, HLA-G med grønn pseudo-farge, tryptase med rød pseudo-farge, CD3 med cyan pseudo-farge, CD20 med fuchsia rosa pseudo-farge, på samme tilfelle av IPF vist i (B) . (C1) tilsvarer (B1)-området. I (C1) tilsvarer flertallet av HLA-G-celler mastceller i fifibroseområdet, mens svært sjeldne mastceller er HLA-G i noden vist i (C2). Flertallet av cellene i noden er CD20. HALO-analyse viste at de fleste av HLA-G pluss-cellene var B-lymfocytter.
HLA-G pluss og CD117 pluss celler ble talt for de 10 tilfellene ved bruk av HALO programvare med passende algoritme, etter immunhistokjemi. Gjennomsnitt, standardavvik og rekkevidde er angitt.
Analyse av HLA-G pluss celler i nyrefibroseI studien av en serie på 10 tilfeller avnyrefifibrose ved immunkjemi fant vi 133 ± 102 HLA-G pluss celler/mm2 og 426 ± 207 CD117 pluss celler/mm2 (tabell 7). Det var ingen samsvar mellom HLA-G pluss- og CD117 plus-cellene (figur 3A).
Figur 3. Naturen til HLA-G-celler på et representativt tilfelle avnyrefibrose. (A) I det første avsnittet viser bildet til venstre Sirius Red-fargen, det midterste bildet viser motflekken av Mayer hematoxylin ved bruk av immunhistokjemi. Områdene i sirkler tilsvarer topografisk HLA-G- og CD117-fargede lysbilder, med 4H84 som gjenkjenner HLA-G og CD117 som gjenkjenner c-kit-celler. Røde piler er positive celler. Rektanglene viser en sterk forstørrelse av disse områdene som indikerer at HLA-G-celler ikke matcher CD117-celler. (B) Firedobbel immunfluorescens på et representativt tilfelle avleverfibrose ved bruk av DAPI med nuclei blue, HLA-G (med 4H84 antistoff) med grønn pseudo-farge, CD117 i cyan pseudo-farge, mastcelletryptase i rød pseudo-farge, og det sammensatte bildet eller flette. Til høyre er Sirius Red representert. Celler farget gult på sammenslåingen tilsvarer HLA-G pluss mastceller. (C) Områdene farget cyan tilsvarer mange tubuli som bare uttrykker CD117. Celler farget gult på sammenslåingen tilsvarer HLA-G pluss mastceller.
HLA-G pluss og CD117 pluss celler ble talt for 10 tilfeller avnyrefifibrose ved hjelp av HALO-programvare med passende algoritme, etter immunhistokjemi. Gjennomsnittet, standardavviket og området er indikert for HLA-G pluss- og CD117 pluss-celler. Firedobbel merking med HALO-programvare koblet til Sirius Red og morfologianalyse viste betydelig heterogenitet av merkingen på en del avnyrei henhold til ikke bare den anatomiske regionen, men også innenfor det samme anatomiske rommet (Figur 3B, C). Dermed var opptelling og beregning av prosentandelen av HLA-G pluss-celler ikke relevant i dette organet. Faktisk, mikroskopisk undersøkelse viste sterk farging av omkretsen av tubuli med CD117 som ikke sammerkte med mastceller (figur 3C). HLA-G pluss-cellene er mastceller og er lokalisert i det inflammatoriske interstitium (figur 3B,C).
DiskusjonEkspresjonen av HLA-G-proteiner ble først demonstrert i cytotrofoblaster ved føtal-mor-grensesnittet [12]. Under basale forhold er uttrykket i stor grad begrenset til spesifikke vev, slik som hornhinnen [13], thymus [14] og øyer i bukspyttkjertelen [15]. Imidlertid er visse typer celler også i stand til å uttrykke det, for eksempel bronkiale epitelceller [16], mesenkymale celler [17], celler av monocytisk avstamning [18–20], og erytroide og endoteliale forløpere [21], under spesielle forhold . Vi har tidligere vist at mastceller kan uttrykke HLA-G i basal tilstand, med økt uttrykk i visse cytokinrike miljøer, spesielt fifibrotisklevervev.Vi undersøkte om HLA-G kan uttrykkes av mastceller assosiert medleverfifibrose fra en annen etiologi eller fifibrose i et annet organ ved å studere 41 tilfeller av alkoholindusertleverskrumplever, 10 av IPF og 10 avnyrefifibrose.
Infeksjoner, toksiske og metabolske skader og idiopatiske inflammatoriske sykdommer kan fremme utviklingen av fifibrose fordi kronisk skade induserer en apoptose av parenkymceller som frigjør profifibrogene og inflammatoriske cytokiner som TGF-. De kollagenproduserende cellene skiller seg fra de fastboende mesenkymalcellene som respons på skaden. Epitel til mesenkymal overgang er et fenomen med celletransdifferensjon som observeres for kolangiocytter ilever, pneumocytter i lunge og tubulære epitelceller inyre[22]. Apoptotiske celler induserer en økning i konsentrasjonen av TGF- i alle organer. Imidlertid kan spesifikke trekk ved fifibrogenese skilles i de forskjellige organene. Ilever,apoptose gjelder hepatocytter, mens det påvirker epitelceller i lunge ognyre[22]. Dermed innbygger fifibroblasternyreog lunge aktiveres til en myofifibroblast som uttrykker a-SMA, kollagen1, menslevermyofifibroblast beholder sine nevrale-spesifikke markører [23].
Ilever,leverstjernecellene bidrar med mer enn 80 prosent av alle kollagenproduserende celler. I lungene er skaden på pneumocytter assosiert med apoptose av endotelceller. Rollen til betennelse i IPF er kontroversiell. Typisk IPF viser ikke en tilstrømning av inflammatoriske celler, men noen forfattere antyder en rolle av betennelse i differensieringen av pulmonale fifibroblaster til ECM-produserende myofifibroblaster [24]. Gjentatte alveolære epitellesjoner av ukjent etiologi og alveolær epitelial apoptose er involvert i IPF [25]. Inyreoglever,myelomonocytiske celler rekrutteres fra benmargen og representerer henholdsvis 14 til 15 prosent og 8 til 12 prosent av myofifibroblastene. Ingen reversibilitet av fifibrose er observert i lungen i motsetning tilleverognyrei fravær av skade og dersom punktet for ingen retur ikke er nådd. Faktisk er inflammatoriske prosesser begrenset i IPF, spesielt i den tidlige fasen av sykdommen, mens gjentatte alveolære epitellesjoner av ukjent etiologi og alveolær epitelial apoptose kan fremme spredning og aktivering av pulmonale fifibroblaster eller myofifibroblaster [25].
Når det gjelderleverfifibrose, en mislykket sårhelingsprosess avnyrevev etter kronisk, vedvarende skade fører til produksjon og utskillelse av proinflammatoriske cytokiner, samt TGF-, som spiller en nøkkelrolle i den fifibrotiske prosessen. For eksempel ileverfifibrose, TGF-, som uttrykkes som en liten mengde i hvilende HSC, produseres raskt av denne typen celler etterleverskade.I tillegg til HSC, er andre kilder til TGF- blitt beskrevet som blodplater, makrofager, hepatocytter og også mastceller [26]. TGF- 1 lagres i matrisen i sin latente form, og når den først er aktivert, fremmer den overgangen fra fifibroblast til myofifibroblast, som er grunnleggende for fifibroseprosessen. I tillegg hemmer det ECM-nedbrytning ved å undertrykke metalloproteaser og fremme en naturlig hemmer TIMP. Dermed induserer det produksjonen av ECM gjennom SMAD3-avhengige eller ikke-SMAD-assosierte mekanismer [27]. Det eksisterer faktisk en gjensidig interaksjon mellom mastceller og TGF-. TGF- er et kraftig lokkemiddel for mastceller; faktisk er de patologiske prosessene mediert av TGF- ofte assosiert med mastcelleakkumulering [28]. I tillegg er mastceller en av de primære kildene til IL-17 som driver TGF- -avhengig fifibrose [29]. TGF- har også blitt rapportert å fremme eller undertrykke mastcellefunksjoner. Faktisk hemmer TGF- ekspresjonen av IgE-reseptoren Fc1RI med høy affifinitet, som aktiverer mastceller [30]. På den annen side hemmer det mastcelleproliferasjon, degranulering og produksjon av flere effektormolekyler som histamin og TNF- [31]. Gitt økningen i MC i fifibrose, kan effekten av TGF- på MC-funksjoner være viktig i reguleringen av inflammatoriske responser som opprettholder fifibroseprosessen.
Som ved hepatitt C-virusindusertleverfifibrose, fant vi at halvparten av HLA-G pluss-cellene i alkoholindusert skrumplever var mastceller (tabell 2) og bare 34 prosent av mastcellene uttrykte HLA-G, med høy individuell variasjon vist ved standardavviket (tabell 1) . I tillegg observerte vi en distinkt fordeling i henhold til regionen ilever,der 63–92 prosent av HLA-G pluss-cellene i fifibrotiske regioner var mastceller, mens bare 3–23 prosent var mastceller i cellulære noder (tabell 3). Tilsvarende observeres et annet mønster for mastceller, siden 92 prosent av mastcellene i fifibrotiske områder uttrykte HLA-G, mens bare 23 prosent uttrykte HLA-G i cellulære noder (data ikke vist). Dermed er uttrykket av HLA-G ikke begrenset til den virale etiologien tilleverskrumplever. Faktisk fikk vi et lignende resultat for lunge. I IPF var 63 prosent av HLA-G pluss-celler i fifibrotiske regioner mastceller, mens bare 7 prosent av de i noder var mastceller (tabell 6). Sakene avnyrefifibrose var spesielle. Som et resultat av det store antallet tubuli var det ikke mulig å telle cellene i de fifibrotiske områdene riktig fordi mastceller hadde infifiltrert tubuli. Kun kvalitativ mikroskopisk observasjon kunne utføres, som viste at et antall HLA-G pluss-celler var mastceller, uten å kunne differensiere tubuli fra fifibrotiske regioner (Figur 3). Dermed ser det ut til at HLA-G blir uttrykt av mastceller ved fifibrotisk sykdom gjennom celleoverflaten og intra-cytoplasmatiske molekyler, uavhengig av organet. Vi har tidligere vist at humane mastceller i kultur var i stand til å produsere løselige HLA-G-former i det kondisjonerte mediet ved basal tilstand og at sekresjonen økte etter stimulering med cytokiner, inkludert IL-10 [10].
Den høyere prosentandelen av mastceller (mer enn halvparten) som uttrykker HLA-G ileverog lunge kan forklares av de inflammatoriske komponentene i fifibrose. Faktisk, som medfødte immunceller, øker antallet mastceller ved inflammatoriske tilstander, og de kan også frigjøre proinflammatoriske mediatorer [32]. Antall mastceller er forhøyet ved fifibrotiske sykdommer. Faktisk er mastcelletettheten høyere i lungene til pasienter med IPF enn de med andre lungepatologier [33] og normal lunge. På samme måte menneskelignyresykdommerer ledsaget av en økning i antall mastceller inyrecortex, spesielt i området av fifibrose [34], da mastceller sjelden observeres hos friskenyrer.
Tidligere publikasjoner uttalte at mastceller er fraværende fra eller bare finnes sparsomt i normal menneskelig lever, lunger ognyrer[35]. Fremgangen i kunnskapen om mastceller har vist at mastceller som medfødte immunceller kan observeres i alle vev, men de er mer rikelig på steder som er utsatt for miljøet. Dessuten viser de et stort repertoar av reseptorer som lar dem reagere på stimuli og samhandle med andre celler [36].Nyremastceller ligner funksjonelt på de i lungene. Motstridende data er rapportert for rollen til mastceller i fifibrose. En rekke forfattere har foreslått at mastceller er involvert i fifibrose fordi de spiller en rolle i akutt og kronisk betennelse, som initierer den. I tillegg er mastceller i stand til å skille ut histamin, heparin og IL-4, som øker spredningen av fifibroblaster. Imidlertid har andre [37,38], inkludert oss [39], vist at mastceller spiller en antififibrotisk rolle: for eksempel i dyremodeller, slik som mastcellemangelfulle Ws/Ws-mus og rotter. Okazaki et al. viste at indusert fifibrose var mer alvorlig hos rotter med mastcellemangel enn hos villtyperotter [38].
Dessuten har mastceller vist seg å være polarisert i kreft, på samme måte som makrofager [40]. Antiinflammatoriske mastceller uttrykker cytokiner, slik som IL-10, og antallet deres er omvendt assosiert med alvorlighetsgraden av betennelsen, mens proinflammatoriske mastceller tilsvarer en proinflflammatorisk setting. Det er sannsynlig at antiinflammatoriske mastceller uttrykker HLA-G, spesielt fordi (i) en assosiasjon er vist i flere modeller mellom IL-10-nivåer og HLA-G-ekspresjon og (ii) HLA-G har en anti-inflammatorisk virkning. HLA-G-uttrykkende mastceller kan være tilstede på et tidlig stadium av sykdommen, under den inflammatoriske fasen, for å motvirke betennelse, som er den første reaksjonen på lesjonen. I litteraturen ble det rapportert at Il-10, ved å redusere inflammatorisk respons, kan hemme spredningen og kollagensyntesen av myofifibroblastene [41]. Faktisk kan IL-10 spille en beskyttende rolle for alkoholikereleversykdom[42]. I motsetning til dette ble høyere serumnivåer av IL-10 funnet hos pasienter med IPF enn normale forsøkspersoner, og det høyeste nivået av IL-10 i bronkoalveolær lavage ble påvist hos pasienter med IPF sammenlignet med sarkoidose eller hypersensitivitetspneumonitt [43]. Vi kan forklare det med den mindre viktige inflammatoriske komponenten. Inyrefifibrose, ble det påvist i en musemodell at mangel på IL-10 forverretnyrebetennelse og fifibrose [44]. Hos mennesker forbedrer behandling med lokal IL-10-immunterapi assosiert med TGF-antagonist kronisknyresykdom [45].
Et annet relevant resultat er observasjon av HLA-G pluss-celler i celleknuter, nær de fifibrotiske regionene i sjeldne tilfeller av alkoholisk skrumplever. Disse cellene er morfologisk karakterisert av en klynge av lett gjenkjennelige celler av liten til middels størrelse, noe som tyder på et lymfoid aggregat. Deres morfologiske egenskaper tyder på follikler, som er strukturer som hovedsakelig dannes av B-lymfocytter. Firedobbel immunofluorescens i nodene bekreftet denne hypotesen, da 68 prosent av HLA-G pluss-cellene co-uttrykte CD20, som er en spesifikk markør for B-lymfocytter (tabell 3). Lignende strukturer ble også observert i IPF, med et lignende resultat, som viste at 76 prosent av HLA-G pluss-celler i noder var B-lymfocytter (tabell 6). Lymfoid neogenese er rapportert ved fifibrose. Under visse patologiske forhold, slik som vedvarende inflammasjon, kan celleaggregatene utvikle seg til en svært organisert struktur som ligner sekundært lymfoidt vev, dvs. tertiære lymfoide organer eller ektopiske lymfoide follikler [46]. Slike lymfoide follikler inneholder T-cellerike områder og distinkte B-cellefollikler med germinale sentre [47]. Mekanismen som infifiltrerende B-celler organiserer den ektopiske follikkelen og germinalsenteret kontrolleres av lymfotoksin- 1 2 og lymfoide kjemokiner, slik som CC-kjemokinligand 19 (CCL19), CCL21, CXC-kjemokinligand 12 (CXCL12), og CXCL13, som regulerer lymfocytt homing. I tillegg til lymfotoksin og kjemokiner, kreves også antigen stimulering for å indusere og opprettholde follikkeldannelse. Slike follikler ble ikke observert i vår kohort av hepatitt C-virusindusertleverfifibrose og ble bare funnet i ett av tre tilfeller av alkoholindusertleverfifibrose, noe som tyder på et distinkt stadium av sykdommen. Faktisk er funksjonen til ektopiske lymfoide organer og deres korrelasjon med betennelse og fifibrose ennå ikke klar. En rekke studier har vist en ny og overraskende rolle for B-celler i regulering av fifibroblaster i fifibrose, der deres profifibrotiske effekt er analog med den til TGF- og også forsterket av B-celleaktiverende faktor (BAFF) [48].
Relevansen av den cellulære kilden til HLA-G i fifibrose er ikke bare beskrivende, men også funksjonell. HLA-G har en hemmende effekt på funksjonen til alle typer lymfocytter [49] og dendrittiske celler [20,50] gjennom sine spesifikke reseptorer, som ILT2 og ILT4. Tilstedeværelsen av HLA-G på disse immuncellene, i tillegg til å være en markør for betennelse, er også et tegn på en passende immunreaksjon ved også å redusere betennelsen. Faktisk er HLA-G kjent for å spille en beskyttende rolle mot overdrevne betennelsesreaksjoner, som tidligere vist ved septisk sjokk [51]. I tillegg studerte vi tidligere den gjensidige interaksjonen mellom mastceller og hepatiske stellatceller og viste at det fører til tiltrekning av mastceller og en betydelig reduksjon i kollagenproduksjon av HSC-celler gjennom HLA-G-produksjon [39]. I tillegg kan uttrykket av HLA-G av B-celler i ektopiske follikler også bidra til å motvirke den profifibrotiske effekten av B-lymfocytter på myofifibroblaster ved å hemme B-celler via en autokrin mekanisme.
Pasienter og metoder
PasienterEn kohort på 41levertransplanterte pasienter med alkoholindusert skrumplever ble studert. Pasientene ble informert om protokollen, og fravær av motstand ble innhentet (Sykehusets etiske komité, melding nr. 16.47). Ti paraffifinblokkprøver avnyrefifibrose og 10 av IPF (Hospital Ethics Committee, notis nr. 16.123), fullstendig og irreversibelt anonymiserte, ble studert i samsvar med prinsippene i Helsinki-erklæringen. De kliniske og biologiske egenskapene til de tre kohortene er henholdsvis oppsummert i tabell 8–10.
Metodikk
Immunhistokjemi og immunfluorescensVev ble avledet fra eksplantertleverognyreeller lungebiopsi. Parafifin-innstøpte seriesnitt (4 µm tykke) ble preparert, og standard histologisk farging, dvs. HES-farging og Sirius Red-merking av kollagen, ble utført. Parallelt ble immunhistokjemi og immunofluorescens utført på serielle seksjoner av parafifin-innstøpte seksjoner fra samme blokk etter deparaffifinisering og en antigenhentingsprotokoll. Primære antistoffer (mAbs) var som følger: monoklonalt muse-anti-humant HLA-G (Exbio, 4H84 2 µg/mL eller 1:100, Vestec, Tsjekkia), polyklonalt kanin-anti-humant CD117/c-sett , gjenkjenner myeloid- og mastceller (Dako, 1:200, Coppenhagen, Danmark), mus monoklonal anti-human (hum) mastcelletryptase (klon AA1, Dako, 1:1000), spesifikk for mastceller, monoklonal anti-human CD3 (Thermo Scientifics, SP7, 1:500, Waltham, MA, USA), spesifikk for T-lymfocytter, og monoklonal anti-human CD20 (Dako, M0755, 1:600), spesifikk for B-lymfocytter.
Kort fortalt ble lysbilder for immunhistokjemi inkubert med primært antistoff i et Discovery Ultra (Roche, Meylan, Frankrike) automatisert system. Bundet primært antistoff ble avslørt ved bruk av et biotinylert geit-anti-muse- eller anti-kanin-IgG-sekundært antistoff (Vector, ABCYS, les Ulis, Frankrike, 1:700) og diamino-benzidin (DAB MAP-deteksjonssett, Roche , Meylan, Frankrike), etterfulgt av Mayer hematoksylinfarging. For nøyaktig å bestemme naturen til HLA-G pluss-cellene, trippel (DAPI, CD117, mastcelletryptase), firedobbel (DAPI, HLA-G, CD117, mastcelletryptase) og femdobbel (DAPI, HLA-G, CD3, CD20, mastcelletryptase) immunofluorescensfarging ble deretter utført på tre representative tilfeller av alkoholindusert cirrhose og to representative tilfeller av IPF. Åpenbaring ble utført ved bruk av Discovery FAM, rhodamine, DCC og Cy5-sett (Ventana Medical systems, Illkirch, Frankrike). Etter farging ble et bilde av hele overflaten av seksjonen digitalisert med 20× eller 40× forstørrelse ved bruk av en konfokal skanner (Pannoramic Scanner, 3DHistech, Budapest, Ungarn). Immunhistokjemi og multipleks immunofluorescensfarging ble analysert ved bruk av HALO digital analyseprogramvare (V3.0.311). Programvaren ble opplært til å gjenkjenne fifibrose (Sirius Red) ved å bruke Area Quantifification (V2.1.3)-modulen, mens Fish-IF-modulen (v1.2.2) ble opplært for prøvene merket med fargestoffer. Hele deler av hver prøve ble valgt for analyse med den tilsvarende algoritmen. Data ble trukket ut til et regnearkprogramvare for analyse.
KonklusjonDette arbeidet knyttet til våre tidligere dataeksperimenter om den anti-beskyttende rollen til mastcellene via HLA-G-ekspresjon [39] antyder at mastceller spiller en antififibrotisk og beskyttende rolle via ekspresjonen av HLA-G i fifibrotiske situasjoner. Denne rollen forsterkes av B-lymfocytter som uttrykker HLA-G i ektopiske follikler. Samlet sett antyder disse funnene en beskyttende rolle for HLA-G uttrykt av mastceller i fifibrotiske organer.
