Hvordan Artemether lindrer nyreskade--Del I

for mer informasjon:ali.ma@wecistanche.com

Artemether forbedrer nyreskade ved å gjenopprette redoksubalanse og forbedre mitokondriell funksjon ved adriamycinnefropati hos mus

Peng xun Han, et al

Denyreer et organ med høy energibehov, spesielt rikt på mitokondriernyrerørformede celler. Nye bevis tyder på at mitokondriell dysfunksjon, redoksubalanse og nyreskade henger sammen. Artemether har biologiske effekter ved å målrette mot mitokondrier og viser potensiell terapeutisk verdi fornyresykdom. Imidlertid har de underliggende molekylære mekanismene ikke blitt fullstendig belyst. Denne studien ble utført for å bestemme effekten av artemether på Adriamycin-indusert nefropati, og de potensielle mekanismene ble også undersøkt. In vivo ble en Adriamycin nefropati musemodell etablert, og mus ble behandlet med eller uten artemether i 2 uker. In vitro ble NRK-52E-celler stimulert med TGF- 1 og behandlet med eller uten artemeter i 24 timer. Deretternyreskade og celleforandringer ble evaluert. Resultatene viste at artemether reduserte proteinutskillelsen i urinen, gjenopprettet podocyttforandringer, svekket patologiske endringer og lindretnyretubulær skade. Artemether nedregulerte også TGF- 1 mRNA-ekspresjonsnivåer, hemmet tubulær proliferasjon, gjenopprettet tubulære cellefenotyper og undertrykte proliferasjonsrelaterte signalveier. I tillegg artemether restaurertnyreredoksubalanse, økt mtDNA-kopiantall og forbedret mitokondriell funksjon. Oppsummert ga vi innledende bevis på at artemether forbedrer nyreskade ved å gjenopprette redoksubalanse og forbedre mitokondriell funksjon i Adriamycin nefropati hos mus. Artemether kan være et lovende middel for behandling av nyresykdom.

Kronisknyresykdom(CKD) er i ferd med å bli en global helsebelastning og er preget av urinavvik, morfologiske strukturendringer og svekketnyrefunksjon 1. Det haster med å utforske patogenesen av CKD og utvikle effektive medisiner som forsinker progresjonen.

Som et orgel med høyt energibehov, ernyreer rik på mitokondrier, spesielt inyrerørformede celler. Mitokondrier regnes som cellens kraftsenter og deltar i mange cellulære prosesser. Nye bevis tyder på at mitokondriell dysfunksjon spiller en sentral rolle inyre innjury2. I en lokalsamfunnsbasert populasjon ble det observert en negativ assosiasjon mellom mitokondrielt DNA (mtDNA) kopiantall i perifert blod og forekomsten av mikroalbuminuri3. En urinutskillelse metabolomics studie ognyregenekspresjonsanalyse avslørte at sitronsyresyklusaktiviteten er svekket hos CKD-pasienter4. Mitokondrier er det viktigste stedet for fettsyreoksidasjon. Hos mennesker og musemodeller med tubulointerstitiell fibrose ble defekt fettsyreoksidasjon påvist. Gjenoppretting av fettsyremetabolismen ved bruk av genetiske eller farmakologiske metoder forhindret betydelig progresjon av nyrefbrose5.

Oksidativt stress er definert som en ubalanse i genereringen av reaktive oksygenarter (ROS) som overskrider kapasiteten til celler/vev til å avgifte eller rense dem. Tallrike studier har vist at dysregulering avnyreredokstilstand fremmer fibrogene veier og fører til slutt tilnyrefeil6. Mitokondrier er en viktig kilde til cellulær ROS og regulerer redoksbalansen i samarbeid med andre organeller7. Redoksubalanse, mitokondriell dysfunksjon ognyreskadeer sammenkoblet. Imidlertid forblir de molekylære mekanismene som ligger til grunn for disse faktorene unnvikende.

Artemether er et derivat av artemisinin med forbedret biotilgjengelighet og er mye brukt i antimalariabehandling8,9. Tidligere studier har vist at artemisininderivater har antiviral, soppdrepende, antikreft og antidiabetisk aktivitet10–15. Flere studier har vist at de biologiske effektene av artemether er relatert til reguleringen av mitokondrier16–18. Imidlertid er de nøyaktige mekanismene ikke fullstendig forstått.

I denne studien utforsket vi rollen til artemether i Adriamycin nefropati (AN) og undersøkte de underliggende mekanismene.

Cistancheer bra fornyreskade

Klikk for å Cistanche ekstrahere pulver for nyreskade

Resultater

Artemether reduserte proteinutskillelse i urin og gjenopprettet podocyttforandringer.

Proteinuri er en markør fornyreskadeog en uavhengig risikofaktor for progresjon av CKD. Som vist i fig. 1a, sammenlignet med kontrollgruppen, økte urinproteinutskillelsen i AN-gruppen signifikant og ble signifikant redusert ved artemeterbehandling. Podocytter spiller en viktig rolle i dannelsen av proteinuri. Derfor telte vi antall WT-1 positive celler (som indikerer podocyttnummer) og målte fotprosessbredde (FPW) i glomerulus. Resultatene avslørte at podocytttallet sank og FPW økte betydelig i AN-gruppemus (fig. 1b–e). Artemether-behandling gjenopprettet åpenbart disse podocyttforandringene (fig. 1b–e).

Figur 1. Artemether reduserte proteinutskillelse i urin og gjenopprettet podocyttforandringer. (a) Kvantifisering og statistisk analyse av urinproteinutskillelse i ulike grupper. n=6 per gruppe. (b) Telling av WT-1 positive celler per glomerulus i hver gruppe. n=6 per gruppe. (c) Måling av FPW i ​​forskjellige grupper. n=3 per gruppe. (d) Representative bilder av WT-1-immunfarging i hver gruppe. Målestokk, 20 μm. (e) Representative TEM-bilder som viser morfologiske endringer av fotprosesser. Målestokk, 500 nm. **P<0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="">

Cistancheer bra fornyreskade

Artemether svekket patologiske endringer og renal tubulær skade.

På slutten av denne studien var fokal segmentell glomerulosklerose (fig. 2a, j), tubulær skade (fig. 2b, k) og tubulointerstitiell fibrose (fig. 2c, l) fremtredende i AN-gruppemus. Artemether-behandling forbedret disse patologiske lesjonene betydelig (fig. 2a–c,j–l). I samsvar med de tubulære patologiske endringene, økte urin-Kim-1- og NGAL-nivåer, som er to biomarkører for tubulære skader, signifikant i AN-gruppen og ble signifikant redusert av artemeter (fig. 2d,e). I tillegg økte nivåene av fibrose-relatert mRNA (fibronektin: FN, -glattmuskelaktin: -SMA, kollagen: COL I og COL III) også betydelig i AN-gruppemus og ble nedregulert ved artemeterbehandling (fig. 2f–i) ). I samsvar med disse molekylære og patologiske endringene ble økt serumkreatinin og BUN i AN-gruppen signifikant redusert med artemether (fig. 9a,b).

Figur 2. Artemether attenuerte patologiske endringer ognyretubulær skade. Evaluering av (a) glomerulosklerose, (b) tubulær skade og (c) interstitiell fibrose i hver gruppe. Kvantifisering av urin (d)NGAL og (e) Kim-1 utskillelse i ulike grupper. Fastsettelse avnyremRNA-ekspresjonsnivåer av (f) FN, (g) -SMA, (h) COL I og (i) COL III i forskjellige grupper ved qPCR og normalisering mot husholdningsgenet -aktin. (j, k) Representative bilder av PAS-farging for glomeruli (skalastang, 20 μm) og tubuli (skalastang, 50 μm). (l) Representative bilder av Masson trikromfarging fornyretubulointerstitium. Målestokk, 50 μm. n=6 per gruppe. *P<0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="">

Artemether hemmet tubulær celleproliferasjon.

For å bestemme tilstanden til cellevekst inyre, utførte vi immunhistokjemi for celleproliferasjonsmarkørene proliferating cell nuclear antigen (PCNA) og Ki-67. Resultatene avslørte at PCNA- og Ki-67-positive tubulære celler økte betydelig i AN-gruppemus og ble signifikant redusert med artemether (fig. 3b–e). TGF- 1 er en kritisk regulator for celleproliferasjon. Sammenlignet med kontrollgruppemus, markert oppregulering av TGF- 1 mRNA inyrevev ble observert i AN-gruppemus, og det ble signifikant nedregulert ved artemeterbehandling (fig. 3a).

Figur 3. Artemether nedregulerte TGF- 1 mRNA-ekspresjonsnivåer og hemmet tubulær proliferasjon. (a) Bestemmelse av nyre-TGF- 1 mRNA-ekspresjonsnivåer i hver gruppe. (b, c) Telling av PCNA og Ki-67 positive rørformede celler per mm2 i ulike grupper. (d, e) Representative bilder av PCNA- og Ki-67-immunfarging i hver gruppe. Målestokk, 20 μm. n=6 per gruppe. **P<0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.01 and=""><0.001 versus="">

Artemether gjenopprettet den tubulære celle-fenotypen og undertrykte spredningsrelaterte signalveier.

Som en representativ epitelfenotypemarkør ble E-cadherin (phospho S838 pluss S840) redusert betydelig i AN-gruppen og ble oppregulert av artemether (fig. 4a,b,f,j). De spredningsrelaterte signalene Erk1/2, p38 og S6RP ble aktivert i AN-gruppemus og ble hemmet av artemether (fig. 4a,c–e,g–i,k). For å finne ut om effekten av artemether på tubulære celler ble mediert av TGF- 1, utførte vi en in vitro-studie. NRK-52E-celler ble inkubert med 10 ng/ml TGF- 1 i kombinasjon med eller uten artemeter i 24 timer. Sammenlignet med den ubehandlede gruppen økte TGF- 1 cellelevedyktigheten signifikant (fig. 5a) og induserte Erk1/2- og S6RP-aktivering (fig. 5b,e,h,c,f,i). Te coincubation av artemether doseavhengig redusert cellelevedyktighet (fig. 5a) og hemmet Erk1/2 og S6RP aktivering ved en konsentrasjon på 200 μM (fig. 5b,e,h,c,f,i). P38-signalet ble litt aktivert av TGF- 1-stimulering, men ikke i signifikant grad. Artemether-intervensjon hadde heller ingen effekt på p38-signalering (fig. 5d,g,j).

Figur 4. Effekter av artemether på tubulær cellefenotype og spredningsrelaterte signalveier. (a–i) Western blot-bånd og kvantitativ analyse av pE-cadherin (S838 pluss S840), E-cadherin, p-Erk1/2 (Tr202/Tyr204), Erk1/2, p-p38 MAPK (Tr180/Tyr182), p38 MAPK, p-S6RP (Ser235/236) og S6RP inyrei hver gruppe. (j, k) Representative immunhistokjemiske fargebilder av pE-cadherin (S838 pluss S840) og p-S6RP(Ser235/236) inyre. Bilder viste at disse proteinene hovedsakelig kommer til uttrykk i nyretubuli. Målestokk, 20 μm. n=6 per gruppe. *P<0.05 and=""><0.01 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001versus>

Figur 5. Effekter av artemether på cellelevedyktighet og spredningsrelaterte signalveier in vitro. (a) Cellelevedyktighet ble analysert ved MTT-analyse etter behandling med TGF- 1 og forskjellige konsentrasjoner av artemeter i 24 timer. n=6 per gruppe. *P < 0.05="" vs.="" tgf-="" 1:0="" pluss="" art:="" 0="" gruppe;=""><0.001 vs.="" tgf-β1:(10+dmso)="" +="" art:="" 0="" group.="" (b–d)="" representative="" western="" blot="" bands="" of="" p-erk1/2="" (tr202/tyr204),="" erk1/2,="" p-s6rp="" (ser235/236),="" s6rp,="" p-p38="" mapk="" (tr180/tyr182),="" and="" p38="" mapk="" after="" treatment="" with="" the="" indicated="" amount="" of="" artemether="" and="" tgf-β1.="" (e–j)="" bar="" graphs="" present="" the="" fold="" change="" of="" these="" proteins="" after="" normalization="" to="" β-actin.="" n="3" per="" group.=""><0.05 versus="" tgf-β1:0+art:="" 0="" group;=""><0.05 versus="" tgf-β1:10+art:="" 0="">

Cistancheer bra fornyreskade

Effekter av artemether på nyreredoksbalansen.

Sammenlignet med kontrollgruppen ble de redoksassosierte enzymene inkludert katalase, superoksiddismutase 2 (SOD2) og glutationperoksidase 1 (GPX1), alle redusert betydelig i AN-gruppen og ble signifikant økt ved artemeterbehandling (fig. 6a–d). . Immunhistokjemisk farging avslørte at disse enzymene hovedsakelig ble uttrykt i nyretubuli og sjelden uttrykt i glomeruli. Deres fordeling i tubuli viste også et spesifikt mønster. Catalase ble hovedsakelig uttrykt i cortico-medullær overgang, SOD2 ble hovedsakelig uttrykt i medulla, og GPX1 ble hovedsakelig uttrykt i cortex (fig. 6f–h). I tråd med redoksubalansen inyre, urinH2O2-utskillelsen økte betydelig i AN-gruppen og ble redusert med artemeter (fig. 6e). Artemether økte mitokondriell masse og forbedret mitokondriell funksjon. Hos AN-gruppemus ble det observert tap av spenningsavhengig anionkanal (VDAC), translokase av den ytre mitokondriemembranen 20 (TOM20), cytokrom c-oksidase IV (COX IV) og mitokondriell transkripsjonsfaktor A (Tfam), og disse effektene ble observert. økt ved artemeterbehandling (fig. 7a–e). Fordi Tfam-protein spiller en viktig rolle i vedlikeholdet av mtDNA-kopinummer, målte vi mtDNA-kopinummer i hver gruppe. I samsvar med reduksjonen i Tfam ble mtDNA-kopitallet også redusert i AN-gruppen og økt med artemether (fig. 7g–l). I tillegg ble det observert en lavere renal mitokondriell H2O2-frigjøringshastighet i AN-gruppen, som ble økt ved artemeterbehandling (fig. 7f).

Figur 6. Effekter av artemether pånyreredoksbalanse og urin H2O2 utskillelse. (a) Western blot-bilder som viser nyreproteinnivåer av katalase, SOD2 og GPX1 i hver gruppe. (b–d) Søylediagrammer viser foldendringen til disse proteinene etter normalisering til -aktin. n=4 per gruppe. (e) H2O2-utskillelse i urin i ulike grupper. n=6 per gruppe. (f–h) Representative immunfargingsbilder av renal katalase, SOD2 og GPX1 i hver gruppe. Målestokk, 200 μm. *P<0.05 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05 and=""><0.001 versus="">

Artemether regulert protonlekkasje og AMPK-signalering.

For å utforske den direkte effekten av artemether på mitokondrier, utførte vi en mitokondriell stresstest ved å bruke Seahorse XF-analysatoren. Sammenlignet med den ubehandlede gruppen, påvirket ikke TGF- 1-stimulering protonlekkasje eller ATP-produksjon (fig. 8a–c). I motsetning til dette økte artemeterbehandling betydelig protonlekkasje og reduserte ATP-produksjonen (fig. 8a–c). Som vist i fig. 8d,e ble AMPK-signalet aktivert av artemeter. Dessuten viste in vivo-studien at mRNA-nivåer av frakobling av protein (UCP2) inyreble betydelig oppregulert av artemether (fig. 8f).

Figur 8. Effekter av artemeter på protonlekkasje og AMPK-signalering. (a) Cellulær mitokondriell respirasjon ble målt med en Seahorse XF24 ekstracellulær fluksanalysator etter at celler ble behandlet med den angitte mengden artemeter og TGF- 1 i 24 timer. (b, c) Søylediagram viser beregningen av protonlekkasje og ATP-produksjon i ulike grupper i henhold til produsentens protokoll. n=5 per gruppe. (d, e) Representative western blot-bilder og kvantitativ analyse av p-AMPK (Tr172) fold endring etter TGF- 1 og artemether-behandling i 24 timer. n=3 per gruppe. (f) Det renale mRNA-ekspresjonsnivået til UCP2 i hver gruppemus normaliserte seg mot husholdningsgenet -aktin. n=6 per gruppe. #P<0.05 and=""><0.001 versus="" tgf-β1:10+art:="" 0="" group;=""><0.05 versus="">

Klikk her for del II

Fra: 'Artemether forbedrernyreskadeved å gjenopprette redoksubalanse og forbedre mitokondriefunksjonen ved adriamycinnefropati hos musPeng xun Han, et al

---Vitenskapsrapporter|(2021) 11:1266