Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Klinisk effekt og transkriptomisk analyse av Congrong Shujing Granules (苁蓉舒痉颗粒) hos pasienter med Parkinsons sykdom av Shen (nyre) essensmangelsyndrom

CHEN Shi-ya1, XIAO Shao-jian1, LIN You-ning1, LI Xi-yu1, XU Qian2,

YANG Sha-sha2, HUANG Lian-hong3,4 og CAI Jing1,2

ABSTRAKTMål: Å evaluere den kliniske effekten og sikkerheten tilCongrong Shujing Granulat(苁蓉舒痉颗粒, CSGs) ved behandling av pasienter medParkinsons sykdom(PD) og kinesisk medisin (CM) syndrom av Shen (Nyre) essensmangel, og for å undersøke den potensielle mekanismen som involverer effekt gjennom en transkriptomsekvenseringstilnærming. Metoder: Kvalifiserte PD-pasienter med syndromet Shen essens-mangel ble tilfeldig fordelt til en behandlingsgruppe eller en kontrollgruppe ved hjelp av en tilfeldig talltabell, og ble behandlet med henholdsvis CSGs kombinert med vestlig medisin (WM), eller placebo kombinert med WM. Begge behandlingsforløpene varte i 12 uker. Det forenteParkinsons sykdomVurderingsskala (UPDRS)-poengsum, PD-spørsmål-39 (PDQ-39)-score, CM Syndrome Scale-score og legemiddelbruk for alle pasienter ble evaluert før og etter behandling. Sikkerheten ble evaluert ved kliniske laboratorietester og elektrokardiografer. Blodprøver fra 6 pasienter i hver gruppe ble samlet før og etter forsøket og brukt til transkriptomisk analyse ved genontologianalyse og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway-analyse. Differensielt uttrykte gener ble validert ved bruk av revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon. Resultater: Totalt 86 PD-pasienter ble valgt ut fra Third Affiliated People's Hospital ved Fujian University of Traditional Chinese Medicine mellom januar 2017 og desember 2017. Til slutt fullførte 72 pasienter studien, inkludert 35 i behandlingsgruppen og 37 i kontrollgruppen. Sammenlignet med kontrollgruppen etter behandling, viste pasienter i behandlingsgruppen signifikante reduksjoner i UPDRS sub-Ⅱ score, PDQ-39 score, CM syndrom score og Levodopa ekvivalent dose (P<0.05). during="" the="" treatment="" course,="" no="" significant="" changes="" were="" observed="" in="" safety="" indicators="" between="" the="" two="" groups="" (p="">0.05). En mulig mekanisme for klinisk effekt ble foreslått som involverte regulering av cellemetabolismerelaterte prosesser og ribosomrelaterte veier. Behandling med CSG har vist seg å påvirke relevante genloci for PD, inkludert AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, BCL2L11, FTH1P2, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7, TGFBR1, WIPF2 og COX7B. Konklusjoner: CSGs kombinert med WM kan brukes til å behandle PD-pasienter med CM-syndrom med Shen essens-mangel med god sikkerhet. Den mulige virkningsmekanismen og relevante genloki ble foreslått. (Registreringsnr. ChiCTR-IOR-16008394)

SØKEORD Congrong Shujing Granulat, Parkinsons sykdom, randomisert kontrollert studie, RNA-sekvensering, transkriptomikk, kinesisk medisin

Parkinsons sykdom(PD) er en nevrodegenerativ sykdom som forekommer i både middelaldrende og eldre populasjoner. Dens utbredelse, sykelighet og tilhørende økonomiske byrde har økt jevnt og trutt. I den generelle befolkningen er den estimerte prevalensen av PDn i industrialiserte land 0,3 prosent . I år 2030 forventes antallet pasienter med PD å nå 4 940000 i Kina og 8 670000 på verdensbasis. Den relative risikoen for død hos pasienter med PD er omtrent dobbelt så høy sammenlignet med den totale befolkningen. Nåværende behandlingsregimer kan imidlertid ikke hindre utviklingen av tilstanden. Med sykdomsprogresjon reduseres ofte den kliniske effektiviteten av medisineringsregimet, og daglig funksjon og sosial deltakelse blir betydelig kompromittert.) Langtidspleie av PD-pasienter medfører således en betydelig økonomisk byrde for enkeltpersoner, familier og samfunnet.

Levodopa, "gullstandarden" for PD-behandling, er generelt effektiv i 3–5 år. Etter det opplever pasienter ofte alvorlige motoriske komplikasjoner, inkludert fenomenet med slutten av dosen, morgenstivhet, frysing og dyskinesi. Behandling av PD medKinesiske medisiner(CM) kan forbedre pasienters kliniske symptomer, og tilsvarende bivirkninger, og dermed forbedre PD-pasienters livskvalitet.

Congrongjing Granulat(苁蓉精颗粒, CRJ) består hovedsakelig avHerba Cistanchesog Polygonatum sibiricum, som stammer fra den berømte klassiske CM-resepten Dihuang Decoction (地黄饮子) som ble brukt til behandling av PD. I våre tidligere eksperimentelle studier ble de gunstige effektene av CRJ bekreftet. Dataene viste at Polygonatum sibiricum ogHerba Cistanches, hovedkomponenten i CRJ, forbedret uttrykket av dopamin, reduserte innholdet av relaterte apoptosefaktorer (caspase-3, FasL), økte uttrykket av nevrotrofiske faktorer og reduserte apoptose av dopaminerge nerveceller. Studien viste også at CRJ beskyttet dopaminerge nevroner ved å regulere apoptose og gliacelle-avledet nevrotrofisk faktor. Alle disse nevnt ovenfor antydet at CRJ var en trygg og verdifull terapeutisk medisin for behandling av PD.

Basert på vår kliniske erfaring og eksperimentelle forskning, ble CRJ modifisert ved å legge til Radix Paeoniae Rubra, Cortex Moutan og Salvia miltiorrhiza Bge., dermedCongrong Shujing Granulat(苁蓉舒痉颗粒, CSGs) ble komponert. Denne studien observerte den kliniske effekten av CSGs på behandling av PD-pasienter med CM-syndrom av Shen (nyre) essensmangel og de genetiske endringene i perifert blod-mRNA hos pasienter. For å undersøke den underliggende virkningsmekanismen til CSG ved behandling av PD, ble en RNA-sekvensering (RNA-seq) tilnærming brukt for å analysere pasientenes gentranskripter før og etter forsøket, og for å identifisere og validere differensielt uttrykte gener (DEGs) .

METODER

Diagnostiske kriterier

Diagnosekriteriene for vestlig medisin (WM) refererte til de siste diagnostiske standardene for PD publisert av International Parkinson and Movement Disorder Society i 2015. CM-diagnosekriteriene for Shen essens deficiency syndrome refererte til de relaterte standardene publisert av China Press of Traditional Chinese Medisin.

Inkluderings- og eksklusjonskriterier

Pasienter som oppfylte de ovennevnte WM-diagnostiske kriteriene så vel som CM-syndrom-differensieringskriteriene for Shen-essensmangel, 50–80 år gamle, hadde en Hoehn-Yahr (HY) iscenesettelsesskala på 4, og signerte skriftlige informerte samtykker ble inkludert i studien . Pasienter som ble diagnostisert med alvorlige sykdommer, inkludert alvorlig organdysfunksjon, mentale eller nevrologiske sykdommer, alvorlige infeksjoner, svulster, encefalitt eller allergisk konstitusjon, fikk CM-behandling for PD innen 3 måneder, eller deltok i andre kliniske studier i løpet av de siste 3 månedene, ekskludert.

Kriterier for frafall og oppsigelse

Pasienter som frivillig trakk seg fra forsøket eller ikke ble kontaktet ble ansett som frafall. Pasienter som opplevde alvorlige bivirkninger eller plutselige alvorlige sykdommer og komplikasjoner, og som ikke var i stand til å fortsette studien, hadde dårlig etterlevelse av forsøkspersonen, mottok mindre enn 80 prosent eller mer enn 120 prosent av de angitte behandlingsdosene, brøt utprøvingsprotokoller, ga ufullstendig informasjon som påvirket evalueringen av effekt ble ekskludert fra studien.

Deltakere

Kvalifiserte PD polikliniske pasienter og innlagte pasienter fra Third Affiliated People's Hospital ved Fujian University of Traditional Chinese Medicine ble registrert. Den eksperimentelle planen, informert samtykke og saksrapportskjemaer mottok skriftlig godkjenning fra Medical Ethics Committee ved Third Affiliated People's Hospital ved Fujian University of Traditional Chinese Medicine (nr. 2017KS-6-1), og ble registrert ved Chinese Clinical Prøveregister (registreringsnr. ChiCTR-IOR-16008394).

Estimering av prøvestørrelse

Prøvestørrelsen ble beregnet basert på dataene presentert i den forrige studien, og utvalget• 414 • Chin J Integr Med 2020 Jun;26(6):412-419 størrelsesestimeringsmetode ble etablert av China Clinical Trials Statistical Working Gruppe. Ved å bruke prøveinnholdsdesignformelen for et fullstendig randomisert design, og tatt i betraktning en frafallsprosent på 20 prosent, ble det bestemt at behandlingsgruppen og kontrollgruppen skulle omfatte henholdsvis 43 forsøkspersoner.

Randomisering, tildelingsskjul og blinding

I denne studien ble en fullstendig randomisert dobbeltblindet metode benyttet. SPSS-programvare ble brukt til å tilfeldig tildele emner til de to gruppene, og for å generere en tilfeldig nummerert tabell. Farmasøyter utleverte legemidler i henhold til tabellen. Forsøkspersoner, leger og anmeldere ble alle blindet for tildeling av emner og medikamenter.

Narkotika

Hver dose av CSGs var sammensatt av ekstraktivet avHerba Cistanches6 g, Polygonatum sibiricum 12 g, Salvia miltiorrhiza Bge. 15 g, Radix Paeoniae rubra 12 g, og Cortex Moutan 10 g. Placeboen består av 5 prosent Radix Bupleuri med stivelse, dekstrin osv. Utseendet, lukten og smaken ligner på CSGs. Både CSG-er (batchnr. 16004691) og placebo (batchnr. 16004728) ble levert av Beijing Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (Beijing, Kina), og distribuert av Pharmacy Department of Third Affiliated People's Hospital ved Fujian University of Traditional Kinesisk medisin.

Behandling

Forsøkspersoner i behandlingsgruppen ble behandlet med WM kombinert med CSGs, mens forsøkspersoner i kontrollgruppen ble behandlet med WM kombinert med placebo. WM-ene ble valgt i henhold til retningslinjen. Blant dem var de mest brukte legemidlene Madopar (batch nr. H10930198, Shanghai Roche Pharmaceutical Co. Ltd., Kina) og Sifrol (Boehringer Ingelheim Pharma GmbH, Tyskland). I henhold til retningslinjene som ble gitt, ville primærleger under behandlingen justere medisindosen basert på pasientens tilstand. Hver dose CSG og placebo ble delt inn i to like pakker, tatt 0,5 timer etter henholdsvis frokost og middag i 12 påfølgende uker.

Utfallsmål

For utfallsmål, inkludert rangeringsskalaer for medikamentbruk, og relaterte indekser, ble forsøkspersoner fra begge grupper evaluert av trente leger både før studien og 3 måneder etter administrering av den første dosen.

Primære resultatmål

Unified Parkinsons Disease Rating Scale (UPDRS) ble satt sammen av score på Ⅰ (mental atferd, aktiv atferd og følelser), Ⅱ (daglige aktiviteter), Ⅲ (motorisk undersøkelse) og Ⅳ (motoriske komplikasjoner). Jo høyere poengsum, desto mer alvorlig er tilstanden.

Sekundære resultatmål

De sekundære utfallsmålene inkluderteParkinsons sykdomSpørsmål-39 (PDQ-39)-poengsum,(21) CM Syndrome Scale-poengsum og narkotikabruk av WM. PDQ-39 evaluerer kvaliteten på dagliglivet til PD-pasienter ved å score deres handlinger, følelser, dagligliv og sosial støtte. CM Syndrome Scale scorer de relaterte CM-syndromene til PD-pasienter, for å evaluere alvorlighetsgraden av sykdommen (vedlegg 1). Doseringen av WM ble beregnet som Levodopa-ekvivalentdose (LED). For legemidler relatert til behandling av PD og dens komplikasjoner som ikke var inkludert i LED-formelen (dvs. benzhexolhydroklorid), ble tilsvarende bemerkninger gjort.

Sikkerhetsvurdering

De kliniske laboratorietester inkluderer 3 hovedrutiner (blod/urin/avføring), leverfunksjon (aspartattransaminase (AST) og alaninaminotransferase (ALT)) og nyrefunksjon (blodureanitrogen (BUN) og serumkreatinin (Cr)) som elektrokardiograf (EKG) av pasienter ble evaluert før og etter forsøket. Eventuelle uønskede hendelser ble registrert med detaljer om timing, alvorlighetsgrad, symptomer, varighet, tiltak som ble tatt og utfall.

Statistisk analyse

SPSS versjon 24.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ble brukt for statistisk analyse. Normalfordelte måledata ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (x–± s), mens ikke-normalfordelte data ble uttrykt som median og interkvartilområde. Antallet ble uttrykt som absolutte tall og rater. Ved sammenligning av måledata mellom grupper ble t-testen med to utvalg brukt dersom dataene/transformerte data fulgte en normalfordeling. I andre tilfeller ble rang-sumtesten med to utvalg brukt. Ved sammenligning av måledata før og etter forsøket, ble en t-test med parvise utvalg brukt hvis dataene/transformerte data fulgte en normalfordeling, mens rangeringssumtesten for paret utvalg ble brukt. For sammenligning av telledata ble chi-kvadrat-testen brukt. P<0.05 was="" considered="" statistically="">

Transkriptomsekvenseringseksperimenter

RNA-seq Blodprøver fra 6 pasienter i hver gruppe ble tilfeldig valgt før og etter forsøket, og RNA ble ekstrahert, renset og evaluert. For å fullføre konstruksjonen av sekvenseringsprøvebiblioteket, gjennomgikk totalt RNA rRNA-fjerning, fragmentering, første-tråds cDNA-syntese, andre-tråds cDNA-syntese, terminal reparasjon, tillegg av A ved 3'-terminalen, leddforbindelse og anrikning. Det konstruerte biblioteket ble validert av Qubit® 2.0 Fluorometer og Agilent 2100. Sekvensering ble utført etter validering av biblioteket.

Bioinformatikk analyse

For bioinformatikkanalyse ble råavlesningene avledet fra sekvenseringsanalysen først renset for å oppnå rene avlesninger av høy kvalitet. Deretter ble en spleiset kartleggingsalgoritme av His ved 2 (versjon 2.04) brukt for genomkartlegging av de rene avlesningene. Antall avlesninger ble konvertert til fragmenter per kilo-base av eksonmodell per million (FPKM) kartlagte avlesninger ved bruk av Stringtie (versjon 1.3.0), og det trimmede gjennomsnittet av M-verdier metoder for å standardisere genuttrykk. Deretter ble foldendringen i differensielt genuttrykk beregnet fra FPKM. Gener med aq-verdi 0,05 og foldchange 2 ble ansett som DEG. Til DEGs fra den tilsvarende gruppen med klinisk effekt, genontologi (GO) funksjonsanrikingsanalyse og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway

anrikningsanalyse ble brukt. Etter å ha justert variasjonskriteriene, ble DEG-ene for hver gruppe før og etter forsøket valgt, som var effektgen-lociene tilCistanche deserticolaekstrakt. Utvalgte gener ble ytterligere validert ved revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR).

RESULTATER

Betingelser for ferdigstillelse av prøveperioden

A total of 86 PD patients were selected from the Third Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine between January 2017 and December 2017, 43 patients in each group. Finally, 72 patients completed the trial following the protocol, including 35 in the treatment group and 37 in the control group. The study flow diagram is presented in Figure 1. Between groups, no statistically significant difference was observed in age, disease stage, and H-Y stage (P>0.05, tabell 1).

Sammenligning av UPDRS-score mellom de to gruppene

There was no significant difference between the two groups before treatment in UPDRS total score and subsection score (P>0.05). Sammenlignet med skårene før behandling, ble UPDRS-totalskåren og sub-Ⅱ-skåren signifikant redusert i behandlingsgruppen etter behandling (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" updrs="" sub-ⅱ="" score="" was="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05). however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" updrs="" total="" score="" between="" the="" two="" groups="" after="" treatment="" (p="">0.05, tabell 2).

Sammenligning av PDQ-39-poeng, CM-syndromscore og narkotikabruk mellom de to gruppene

There was no significant difference between the two groups before treatment in PDQ-39 scores, CM syndrome scores, and drug dosage (P>0.05). Sammenlignet med før behandling var PDQ-39-skårene, CM-syndromskårene og LED signifikant redusert i behandlingsgruppen etter behandling (P<0.05). moreover,="" when="" compared="" with="" the="" control="" group="" after="" treatment,="" the="" pdq-39="" score,="" cm="" symptom="" score="" and="" led="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" treatment="" group=""><0.05, table="">

Sikkerhetsvurdering

During the trial, 2 cases in the treatment group with adverse events were observed. Both adverse reactions were light in grade and occurred on day 4 after the start of the trial, with symptoms of internal heat, thirsty, and dryness heat. One of them was not willing to continue the trial and dropped out. One week after terminating the CM granules, the symptoms reduced and then disappeared. Regarding the other subject, after Paeoniae Rubra and Salvia Miltiorrhiza were added to the CSGs, symptoms reduced after 4 days and disappeared. No changes were observed in the clinical laboratory tests and ECG that were directly related to the trial. In addition, no statistically significant differences were observed between the two groups in any of the indices before and after the trial (P>0.05).

Genom sammenligning

Av de seks prøvene i hver gruppe var rekkevidden av antall avlesninger i referansegenet 74452867–117774869. Kartleggingsforhold for prøvetranskriptomsekvensene var 87,30 prosent –96,14 prosent.

Funksjonell analyse av DEG GO Analyse av DEG
DEGs av behandlingsgruppen før og etter forsøket ble gruppert i 47 funksjonelle klynger (figur 2). I tillegg ble DEGs mellom behandlingsgruppen og kontrollgruppen etter forsøket gruppert i 35 funksjonelle klynger (figur 3). DEG-ene var hovedsakelig relatert til celleregulering og metabolismeprosesser.

KEGG berikelsesanalyse av DEG
Baneanrikningsanalyse ved bruk av den offentlige KEGG-databasen over DEG-er fra den tilsvarende gruppen med klinisk statistisk signifikans av P<0.05 of="" the="" efficacy="" evaluation="" indices="" above="" suggested="" that pd-related="" degs="" were="" likely="" to="" be="" enriched="" in="" the="" following="" 4="" signaling="" pathways:="" (1)="" ribosome-related signaling="" pathways,="" (2)="" endocytosis-related="" signaling="" pathways,="" (3)="" foxo="" signaling="" pathways,="" and="" (4)="" were="" identified.="" moreover,="" 1="" up-regulated="" gene="" and="" 12="" down-regulated="" genes="" were="" identified="" in="" the="" control="" group.="" according="" to="" the="" quantitative="" analysis="" of="" degs,="" 13="" highly="" degs="" related="" to="" csgs="" had="" an="" effect="" in="" the="" pd="" patients="" screened,="" including="" aida,="" ankrd36bp2,="" bcl2a1,="" bcl2l11,="" fth1p2,="" gch1,="" hprt1,="" nfe2l2,="" rmrp,="" rps7,="" tgfbr1,="" wipf2,="" and="">

RT-PCR-analyse
Genene nevnt ovenfor ble validert ved hjelp av RT-PCR-analyse. Blant dem var AIDA, ANKRD36BP2, BCL2A1, GCH1, HPRT1, NFE2L2, RMRP, RPS7 og COX7B oppregulerte gener, mens TGFBR1 ble nedregulert (vedlegg 3). Dessuten var det ingen signifikant forskjell i endringen av de tre andre genene.

DISKUSJON

Totalt er 95 prosent av PD-pasientene mellom 40 og 70 år. Debutalderen er stort sett rundt 50 år og forekomsten øker med alderen. I tidligere studier ble det antydet at aktive ingredienser i CSGs reduserte oksidasjonsrelaterte skader av PD og reduserte apoptose av dopaminneuroner. Resultatene av denne studien indikerte at CSG reduserte medisindosen og forbedret livskvaliteten til PD-pasienter. I denne studien fullførte totalt 72 av 86 forsøkspersoner forsøket. Fullføringsraten var bare 83,7 prosent , som var relativt lav sammenlignet med andre lignende kliniske studier. Årsakene kan omfatte de to settene med omfattende tester av forsøkspersonene før og etter studien, kompliserte spørreskjemaer og vanlig 3-månedsoppfølging -up besøk for dosejustering. Ytterligere innsats er nødvendig for å forbedre etterlevelsen av fag og fullføringsgraden av forsøk.

Det er imidlertid flere spørsmål å besvare. Kan CSG-er erstatte medisiner, som dopamin, i det tidlige stadiet av PD-behandling og forsinke medisininntaket? Til hvilket stadium av PD har CSG en signifikant effekt på å redusere dosen av medisiner? Kan CSG-er forlenge den effektive perioden med medisinering? For å løse disse spørsmålene er ytterligere innsats, inkludert ytterligere casestudier, lengre behandlingsperioder, utvidet oppfølging etter behandling, økt detaljert alvorlighetsgrad og aldersstratifisering og mer omfattende statistisk analyse nødvendig.

Basert på observasjonen av effektiviteten til CSG-er i behandlingen av PD-pasienter, undersøkte vi i denne studien den mulige mekanismen for den kliniske effekten av CSG-er og relaterte gener gjennom RNA-seq-teknologi. Transkripsjonen, GO-funksjonsanalyseresultatene relatert til den kliniske effekten, KEGG-baneanalyseresultatene og de fungerende genlociene i CSGs behandling på PD ble oppnådd. Det vil imidlertid være behov for ytterligere innsats for å identifisere den primære veien som er involvert i CSGs aktivitet, de aktive ingrediensene og monomerene i CSGs for behandling av PD, og ​​de tilsvarende symptomene på genloci som CSGs virker på. Framtid
studier bør fokusere på å integrere CM-teorier med bioinformatikk og moderne molekylærbiologi for å undersøke effekten og virkningsmekanismen til Shen-forsterkende terapi på behandling av PD.

Oppsummert indikerte funnene at CSG-er var effektive for å forbedre livskvaliteten, lindre CM-symptomer og redusere medikamentdosen hos PD-pasienter med Shen essens-mangelsyndrom. Ingen alvorlige bivirkninger ble observert under forsøket. Vår studie indikerte at CSG-er kan være et potensielt nytt medikament for behandling av PD. Imidlertid er en større prøvestørrelse, multisenterstudier nødvendig for å bekrefte disse funnene, som er innenfor vår fremtidige forskningsplan.

Utdrag fra: Clinical Efficacy and Transcriptomic Analysis of Congrong Shujing Granules (苁蓉舒痉颗粒) in Patients with Parkinsons Disease of Shen (Kidney) Essence Deficiency Syndrome By CHEN Shi-ya1 etc.

------Chin J Integr Med 2020 Jun;26(6):412-419