Identifikasjon og funksjonell analyse av en bifavon som en ny hemmer av transient reseptorpotensial Vanilloid 4-avhengige aterogene prosesser
Feb 22, 2022
Vær så snill og kontaktoscar.xiao@wecistanche.comå vite mer
Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman
Aterosklerose, en progressiv inflammatorisk sykdom i store arterier, utgjør den fremste bidragsyteren til den økende byrden av hjerte- og karsykdomsrelatert dødelighet og sykelighet globalt1. Den sentrale initierende hendelsen som fører til aterosklerose involverer retensjon av modifiserte low-density lipoprotein (oxLDL)-partikler i de subendoteliale aorta-intimalrommene, primært i arterielle grenpunkter2. Under tidlig aterogenese, etter endotelial dysfunksjon, transmigrerer sirkulerende blodmonocytter inn i intimaområdene og differensierer til vevsmakrofager3. I aorta-intimalrom skaper binding og opptak av oxLDL av makrofager hjulpet av scavenger-reseptorer som SRA og CD36 en feedforward atero-inflammatorisk løkke som resulterer i utvikling av lipidladede skumceller, en kritisk prosess i aterosklerose2–8. Kaskader av inflammatoriske hendelser fremprovosert av skumceller fører til dannelsen av en tidlig fettstrie og til slutt utseendet på avanserte ateroskleroselesjoner preget av tilstedeværelsen av fibrøs hette, forkalket vev, immunceller, matriseproteiner og lipider2–10. Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) fra TRPV-underfamilien, en ikke-selektiv, polymodal kationkanal som er permeabel for Ca2 pluss, uttrykkes allestedsnærværende i forskjellige celletyper inkludert makrofager11–24. Tidligere kjent som en osmosensor, er TRPV4 nå kjent for å reagere på mangfoldige biokjemiske og biomekaniske stimuli inkludert varme, matrisestivhet, osmolaritet, vekstfaktorer, pH og 4 phorbolestere11–24. TRPV4 er rapportert å mediere flere fysiologiske funksjoner som smertefølelse ved inflammasjon og nevropatier18,22,23, myofibroblastdifferensiering og migrasjon 17,25,26 og osteoklastdifferensiering i beinet27. TRPV4-mutasjoner har vært assosiert med flere kanalopatier28–31. Nylige studier av vår gruppe og andre har implisert en mulig rolle for denne kanalen i utallige patologiske tilstander som lungeskader22,32, skumcelledannelse14,16, vevsfbrose17,33, fremmedlegemerespons13 og kreft34,35. Tidligere ble en aterobeskyttende rolle til TRPV4 vist, der kjemisk agonist-indusert TRPV4-funksjon i endotelceller ble vist å være assosiert med aktivering av eNOS og hemming av monocyttadhesjon til endotelceller36. I motsetning til dette har mangler i TRPV4-funksjoner vært knyttet til en rekke ateroinflammatoriske responser, inkludert endotelial dysfunksjon, redusert generering av makrofagskumceller og vaskulære sykdommer14,16,37–39. Vårt laboratorium har nylig identifisert en proatherogen rolle for TRPV4 der den regulerer oxLDL-indusert makrofagskumcelledannelse. Mekanistisk viste vi at TRPV4 påvirker opptaket, men ikke bindingen av oxLDL i makrofager på en CD-36-uavhengig måte14. I en annen studie rapporterte vi en TRPV4-avhengig forverring av oxLDL-indusert skumcelledannelse i nærvær av lipopolysakkarid og økende matriksstivhet, og ga dermed en sammenheng mellom mekanosensing og risiko for aterosklerose16. Betraktet samlet, antyder disse funnene TRPV4 som et attraktivt mål i åreforkalkning og andre sykdommer, og stimulerer dermed oppdagelsen av små molekylhemmere av TRPV4 som kan oversettes til klinisk effektive terapier. Bruken av naturlige forbindelser i terapeutiske midler har fått fremtredende plass, først og fremst drevet av behovet for kostnadseffektive og biokompatible forbindelser sammenlignet med de for tiden eksisterende syntetiske stoffene. Naturlige forbindelser som f.eksflavonoider, alkaloider,polyfenoler, og curcuminoider, påvirker hjerte- og karsykdommer via ulike mekanismer som hemming avproinflammatorisksignaler, insulinsensibilisering og forbedring av blodlipidprofiler ved å målrette AMPK-, COX1/2-, eNOS- og Nrf2-banene40–45. Nylige studier av flere grupper har identifisert to flavonoider, berberin og apigenin, som potensielle modulatorer av TRPV4-aktivitet46,47. Vi har utviklet og brukt en semi high-throughput screeningmetode for å identifisere potensielle antagonister av TRPV4 fra et bibliotek av naturlige forbindelser ved å bruke en Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR)-basert Ca2 pluss influx assay. Her rapporterer vi identifisering og funksjonell analyse av Linkedin, et flavon, som en ny hemmer av TRPV4-avhengige aterogene prosesser i makrofager, og legger dermed grunnlaget for videre studier av denne naturlige forbindelsen som en naturlig anti-aterosklerotisk liten molekylforbindelse. Linkedin har blitt rapportert å vise nevrobeskyttende,anti-kreftfremkallende, oganti-inflammatoriskroller 48,49. Vi rapporterer virkningsmekanismen til Linkedin mot TRPV4 i innstillingen av makrofagskumcelledannelse ved bruk av en rekke biokjemiske og cellulære analyser.
Materialer og metoder Dyre- og cellekultur
Vi kjøpte medfødte C57BL/6 villtype (WT) mus fra Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). University of Maryland Animal Care and Use Committees retningslinjer ble fulgt for alle dyreforsøk, og forfatterne fulgte retningslinjene for ARRIVE. For isolering av tioglykolat-induserte murine residente makrofager (MRM), ble peritoneal lavage samlet etter 4 dager med intraperitoneal tioglykolatinjeksjon, og cellene ble holdt i 10 prosent føtalt bovint serum (FBS) inneholdende DMEM7,14,16. En murin makrofagcellelinje (RAW264.7) og humane dermale fibroblaster (HDF) ble kjøpt fra ATCC (Manassas, VA), og ble dyrket henholdsvis med DMEM eller MEM (Gibco, Waltham, MA). Murine benmargsavledede makrofager (BMDM) ble høstet fra 6- til 7-uke gamle mus, som tidligere beskrevet14,50,51. Kort fortalt ble femur fra WT- og TRPV4 KO-mus samlet, og benmarg fra lårben ble spylt ut med komplett DMEM-medium med 10 prosent FBS. De suspenderte benmargscellene ble filtrert gjennom en 70 µm sil (BD bioscience), sentrifugert og opprettholdt i DMEM-medium supplert med M-CSF (25 ng/ml) i 7–8 dager ved 37 grader for å tillate differensiering til makrofager.
Reagenser
Linkedin og GSK1016790A (GSK101) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), og FLIPR Calcium 6-analysesettet ble oppnådd fra Molecular Device (Sunnyvale, CA). Humant naturlig LDL (VLDL) ble kjøpt fra Stemcell Technologies (Vancouver, Canada). Vi inkuberte LDL med 5 µM CuSO4 i 12 timer ved 37 grader for å fremstille kobberoksidert LDL (oxLDL) 7,14,16. Fluorescerende fargestoff-merket, DiI-oxLDL, ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA), og MCSF fra R&D (Minneapolis, MN). Antistoffer for FACS-analyse var: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4 og TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). PE-konjugerte sekundære antistoffer var fra R&D (Minneapolis, MN), og PE-konjugerte isotypekontroller var fra BD (Franklin Lake, NJ). For kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) brukte vi RNeasy-settet fra QIAGEN (Redwood City, CA). Alle primere ble kjøpt fra Bio-Rad (Hercules, CA). Cellekulturmedier, cellekulturrelaterte produkter og western blot-reagenser ble oppnådd fra Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).
Cistanche for anti-fatigue
Semi high-throughput screening
Vi foretok en semi-high-throughput-screening for antagonister av Trpv4 fra et bibliotek med 2000 naturlige forbindelser (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) ved bruk av en fluorometrisk bildeplateleser (FLIPR)-basert kalsiumtilstrømningsanalyse14,17. Vi identifiserte ginkgetin (GGT), som en ny antagonist til TRPV4. Den primære og sekundære screeningen ble utført med RAW264.7, HDF og BMDM for å vurdere evnen til Linkedin og andre kandidater til å hemme TRPV{10}}fremkalt Ca2 pluss infux14,17. Som kontroller brukte vi A23187, en kalsiumionofor, TRPV4 null BMDMs og GSK219, en selektiv TRPV4-antagonist17. Etter den sekundære screeningen identifiserte vi seks forbindelser som viste mer enn tre ganger hemming av TRPV4-mediert Ca2 pluss tilstrømning sammenlignet med vehikelkontroll. Linkedin ble identifisert som den mest potente hemmeren av TRPV4-aktivitet. BMDM-er (5×104 celler/brønn) ble sådd inn i kollagenbelagte (10 µg/ml) 96-brønnklare svarte plater og inkubert ved 37 grader, 5 prosent CO2. På dagen for eksperimentet ble cellene lastet med kalsium 6-fargestoff i HBSS, 20 mM HEPES, 2,5 mM probenecid og inkubert i 45 minutter ved 37 grader. Etter inkubering ble bibliotekforbindelser tilsatt til hver brønn til en sluttkonsentrasjon på 2 uM. Platene ble inkubert i ytterligere 45 minutter ved 37 grader. Ca2 pluss tilstrømning ble indusert ved tilsetning av 10 nM TRPV4-agonist GSK1016790A i vehikel- eller forbindelsesforbehandlede celler og registrert ved å måle ΔF/F (Max-Min), som tidligere beskrevet17. Data er vist som relative fluorescensenheter (RFU).
Immunoblots
Tioglykolat-utløste peritoneale makrofager ble sådd i 10 prosent FBS inneholdende DMEM og inkubert over natten. Uvedheftede celler ble vasket av, og 1 prosent bovint serumalbumin (BSA) inneholdende DMEM ble tilsatt til platen og inkubert i 3 timer før Linkedin-behandling. For å bestemme ekspresjonen av CD36-, TRPV4-, TLR2-, TLR4-, TLR6- og GAPDH-proteiner ble helcellelysater fremstilt fra celler behandlet over natten med Linkedin (1 og 5 µM) eller bærer i nærvær eller fravær av oxLDL (25 µg/ml) ). For å bestemme ekspresjonsnivåene av LPS-utløst p-JNK og JNK, ble celler forbehandlet med Linkedin (5 og 10 µM) i 3 timer og deretter stimulert med E. coli LPS i 30 minutter. Helcellelysater ble fremstilt fra to ganger vaskede celler (iskald PBS) ved bruk av RIPA-buffer med tilsatt proteaseinhibitorcocktail (Thermo Scientific, MA). Blotter ble undersøkt med kanin anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerusalem, Israel), anti-mus CD36 (R&D, Minneapolis, MN), kanin anti-TLR4, kanin anti-TLR6, kanin anti-JNK og kanin anti-p- JNK primære antistoffer (Cell Signaling, Danvers, MA) etterfulgt av anti-kanin og anti-mus HRP-konjugerte sekundære antistoffer (FoU, Minneapolis, MN). Blottene ble strippet og re-probet med anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) for belastningskontroll.
Dannelse av skumceller.Tioglykolat-utløst MRM ble sådd på dekkglass i en 12-brønns plate med DMEM, 10 prosent FBS og inkubert ved 37 grader, 5 prosent CO2 i 2 timer. GGT (1 eller 10 µM) ble tilsatt til cellene, og etter 3 timers inkubering ble oxLDL (50 µg/ml) tilsatt, og kulturer ble inkubert over natten ved 37 grader. Nativt LDL (50 ug/ml) ble tilsatt kontrollgruppebrønner og inkubert over natten. Celler ble fiksert i 4 prosent paraformaldehyd etterfulgt av Oil Red O-farging for å kvantifisere skumcellegenerering.
Adenovirus vektortransduksjon.Vi samlet inn Adenovirus-konstruksjoner for å uttrykke Ad(RGD)-mus TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), og adenovirus blank vektor, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), fra Vector Biolabs, Malvern, PA. Vi brukte 1 × 108 pfu/ml for alle eksperimenter. For studier av generering av skumceller ble peritoneale makrofager fra mus inkubert med Ade-TRPV4 eller Ade-Vec i DMEM-medier i 72 timer før tilsetning av oxLDL for å generere makrofagskumceller.
Binding og opptak av okse-LDL.For å vurdere binding ble peritoneale makrofager behandlet med to doser (1 eller 10 µM) Linkedin eller bærer i 3 timer og inkubert med DiI-oxLDL ved 4 grader i én time. Etter forbehandling med Linkedin eller bærer ble cellene inkubert med DiI-oxLDL ved 37 grader i 30 minutter for å vurdere opptak. Bilder ble tatt med fluorescensmikroskopi (63x), og bilde J ble brukt til å kvantifisere resultater.
Flowcytometrianalyse.Tioglykolat-utløste peritoneale makrofager ble dyrket i DMEM, 10 prosent FBS i 24 timer. Uvedheftede celler ble vasket av, serumfritt medium ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 2 timer etterfulgt av tilsetning av 5 µM GGT eller bærer, og inkubasjonen ble fortsatt i 3 timer. Behandlede celler ble skrapet av platen og resuspendert i PBS, 2 prosent BSA. Celler ble inkubert med primære antistoffer i 45 minutter etterfulgt av 30 minutter inkubasjon med PE-konjugert sekundært antistoff. Et FACSCantoII flowcytometer (BD Bioscience, Ontario, Canada) ble brukt til å innhente data. Alle data ble behandlet med FlowJo-programvare.
qRT-PCR.Tioglykolat-induserte makrofager ble behandlet med 5 µM Linkedin eller bærer i 3 timer; 25 ug/ml oxLDL ble tilsatt til bæreren eller Linkedin-behandlede celler, og inkubasjonen ble fortsatt over natten. RNeasy Micro Kit (#74 004) fra QIAGEN ble brukt til å ekstrahere totalt RNA, og et Universal SYBR Green One-Step Kit fra Bio-Rad ble brukt til å reversere transkribere RNA. En C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) ble brukt til å innhente data. Ekspresjon av et gen ble bestemt som mengden av genspesifikk mRNA i forhold til GAPDH mRNA ved bruk av den komparative CT-metoden beskrevet i Bio-Rad qRT-PCR-systemets brukerbulletin.
Statistisk analyse.Data presenteres som gjennomsnitt±SEM av biologiske triplikater. GraphPad Prism 7.0-programvare ble brukt, og beregninger ble utført ved å bruke Students t-test for to grupper eller enveis ANOVA for flere grupper.
Etisk godkjenning.Alle eksperimenter på mus ble utført i samsvar med retningslinjer fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og ble godkjent av University of Maryland-College Park Review Committee.
Resultater in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>tre ganger; s<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">
Figur 1. Semi high-throughput screening-basert identifikasjon av Linkedin som en ny TRPV4-hemmer fra et bibliotek av naturlige forbindelser. (A) Flytskjema som viser arbeidsflyten som resulterer i identifisering av ginkgetin som en potensiell TRPV4-hemmer fra et bibliotek med 2000 naturlige forbindelser. (B) Representativ FlexStation 3-opptak som viser den hemmende effekten av 6 naturlige forbindelser på TRPV4-agonist (GSK1016790A)-indusert Ca2 pluss tilstrømning i kalsium 6 fargestoff-belastede BMDMer under sekundær screening. Forbehandling med alle 6 forbindelsene viste hemmende effekter på TRPV4-avhengig Ca2 pluss tilstrømning sammenlignet med celler forbehandlet med bærer (negativ kontroll; bærer pluss GSK1016790A (10 nM)) eller kalsiumionofor (A23187, 2 μM). Vi brukte selektiv TRPV4-antagonist, GSK2193874 (10 nM), som en negativ kontroll. Alle eksperimenter ble gjentatt tre ganger i fire eksemplarer. RFU: relativ fluorescensenhet.
TRPV4-hemming av GGT opphever oxLDL-indusert makrofagskumcelledannelse.Våre tidligere studier viste at TRPV4-fremkalt Ca2 pluss tilstrømning er involvert i oxLDL-mediert skumcelledannelse 14,16. Derfor evaluerte vi muligheten for at skumcelledannelse ble hemmet av GGT-mediert antagonisering av TRPV4-aktivitet. Villtype murine peritoneale makrofager ble inkubert med oxLDL for å indusere skumcelledannelse i nærvær eller fravær av GGT, og analysert ved Oil Red O-farging. Som forventet fant vi at generasjonen av skumceller økte med fem ganger i oxLDL-behandlede makrofager sammenlignet med naturlig LDL (fig. 2A, B). Imidlertid reduserte behandling av makrofagene med GGT (1 eller 10 µM) før stimulering med oxLDL signifikant prosentandelen av skumceller (fig. 2A, B). Samlet antyder disse funnene en hemmende effekt av GGT på dannelse av makrofagskumceller, muligens målrettet mot TRPV{12}}utløst Ca2 pluss tilstrømning. Videre overuttrykte vi TRPV4 i TRPV4 nullmakrofager ved å bruke adenoviruskonstruksjon og induserte deretter skumcelledannelse ved å bruke oxLDL i nærvær av GGT. Vi fant at overekspresjon av TRPV4 økte skumcelledannelsen som ble blokkert da vi forbehandlet cellen med GGT, noe som tyder på at hemming av den proatherogene skumcelledannelsen av GGT er TRPV4-avhengig (fig. 2C, D).
GGT blokkerer ikke det basale ekspresjonsnivået av TRPV4 og inflammatoriske reseptorer.Scavenger-reseptor CD36 spiller en viktig rolle i opptak og binding av oxLDL, og skumcelledannelse, kritiske prosesser i aterosklerose4–7,54,55. Nylig har en økende mengde bevis tyder på involvering av tolllignende reseptorer i aterosklerose2,4,56. For å undersøke om GGT blokkerte skumcelledannelsen ved å påvirke uttrykket av CD36, TLR4, TLR6 og TRPV4, utførte vi immunoblotanalyse ved to konsentrasjoner av GGT (1 eller 5 µM). Vi fant lignende ekspresjonsnivåer av CD36, TRPV4, TLR6 og TLR4 sammenlignet med den ubehandlede kontrollen (fig. 3A-D). Flowcytometrisk analyse avslørte heller ingen signifikant forskjell i celleoverflateekspresjonen av proteinene med eller uten GGT-behandling (fig. 3E–H, I–L). Tatt i betraktning alt sammen tyder disse resultatene på at GGT blokkerer dannelse av makrofagskumceller uten å hemme de basale nivåene av overflateekspresjon av TRPV4, CD36, TLR4 og TLR6.
Figur 2. Inhibering av TRPV4 av Linkedin opphever oxLDL-indusert makrofagskumcelledannelse. (A) Tioglykolat-induserte murine peritoneale makrofager ble behandlet over natten med 50 µg/ml oxLDL, etterfulgt av en 3 timers preinkubering med bærer eller 1 eller 10 µM Linkedin. Celler ble behandlet med 50 ug/ml naturlig LDL (VLDL) som kontroll. Original forstørrelse: 40x. (B) Kvantifisering av resultatene er vist i (A). n=500 celler/tilstand. Elevens t-test; ***s<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>
Opptak av oxLDL, men ikke binding av makrofager undertrykkes av GGT. Fordi TRPV4 tidligere har vist seg å ha en rolle i opptak av oxLDL og skumcelledannelse14,16, evaluerte vi om behandling med GGT forårsaket svekkelse i bindingen av oxLDL på makrofagoverflaten. WT peritoneale makrofager ble behandlet med GGT før inkubering med DiI-oxLDL ved 4 grader, og binding ble vurdert. Resultatene indikerer at bindingen av oxLDL på makrofagoverflaten ikke ble signifikant hindret av GGT (1 eller 10 µM) behandling sammenlignet med vehikelkontroll (fig. 5A–C). Etter å ha fastslått at GGT ikke hemmer bindingen av oxLDL, tok vi sikte på å bestemme om opptak av oxLDL i makrofager ble svekket av GGT-behandling. Interessant nok indikerte resultatene våre at det var signifikant hemming i opptak av oxLDL i makrofager i GGT-forbehandlede celler sammenlignet med den bærerbehandlede gruppen (fig. 6A, B). Tatt i betraktning alt sammen tyder disse resultatene på at GGT blokkerer opptak av oxLDL, men ikke bindende, i makrofager.
GGT blokkerer oxLDL-indusert ekspresjon av TRPV4 i makrofager.
Ettersom våre tidligere publiserte studier viste at TRPV4-fremkalt Ca2 pluss spiller en rolle i oxLDL-mediert makrofagskumcelledannelse14,16, forsøkte vi å finne ut om GGT blokkerte skumcelledannelse via undertrykkelse av oxLDL-indusert ekspresjon av CD36, TLR2, TLR4, TLR6 eller TRPV4. Vi fant at stimulering av makrofager over natten med oxLDL resulterte i betydelig oppregulering av uttrykket av TRPV4-proteiner sammenlignet med LDL, mens uttrykket av andre reseptorer (CD36, TLR2, TLR4 og TLR6) forble uendret (fig. 4A–F). Forbehandling av celler med GGT før stimulering med oxLDL reduserte selektivt ekspresjonsnivået av TRPV4-proteiner sammenlignet med vehikelbehandling (fig. 4A–F). Samlet antyder disse funnene en hemmende effekt av GGT på TRPV4-proteinekspresjon, som delvis kan være involvert i undertrykkelsen av skumcelledannelse av GGT.
Figur 3. Linkedin-behandling endrer ikke det totale proteinet eller overflateekspresjonen av TRPV4, CD36 og TLR i makrofager. (A–D) Immunoblots av makrofag helcellelysater etter behandling over natten med 1 eller 5 µM Linkedin eller bærer. Representative immunoblots viser total proteinekspresjon av CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C) og TLR4 (D) i Linkedin-behandlede og ubehandlede celler. Tre uavhengige biologiske replikater og 3 eksperimentelle repetisjoner for hvert sett med eksperimenter ble utført. (E–H) Flowcytometrisk analyse av makrofager behandlet over natten med 5 µM Linkedin eller ubehandlet som viser overflateuttrykk av TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G) og TLR6 (G) i ubehandlede og Linkedin-behandlede celler. Tre uavhengige biologiske replikater og 30,000 celler per tilstand ble analysert. (I–L) Kvantitativ analyse av resultater fra (E–H). Analysert ved Two-tailed t-test med 99 prosent konfidensintervall. Celler telt per eksperiment, 30,000; to eksperimentelle gjentakelser.
GGT blokkerer proatherogen JNK2-aktivering og betennelse i makrofager. Publiserte rapporter fra vårt laboratorium og andre har vist at aktivering av JNK2 spiller en kritisk rolle i dannelse av skumceller og åreforkalkning7,57. For å bestemme om GGT kunne hemme aktiveringen av JNK1/2, ble makrofager behandlet med GGT etterfulgt av stimulering med LPS eller oxLDL. Resultater fra immunoblotanalyse viste at behandling med GGT signifikant undertrykte oxLDL- eller LPS-indusert fosforylering av JNK1/2 sammenlignet med den ubehandlede eller native LDL-behandlede kontrollen (fig. 7A–D). Det er vist at JNK-aktivering i makrofager induserer transkripsjon av proinflammatoriske mediatorer assosiert med aterosklerose58–60. For å bestemme om GGT potensielt kunne blokkere ekspresjonen av disse proinflammatoriske regulatorene i makrofager, ble GGT-forbehandlede celler stimulert med oxLDL, og mRNA-ekspresjonsnivåer av TNF, IL 6, IL12, IL1 og MCP1 ble kvantifisert ved qRT-PCR-analyse. Vi oppdaget betydelig nedregulering i oxLDL-induserte ekspresjonsnivåer av TNF, IL12, IL1 og MCP1 mRNA i GGT-behandlede celler sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller (fig. 7E-I). Til sammen antyder disse resultatene at GGT blokkerer proatherogen JNK2-aktivering og inflammatorisk genuttrykk som respons på oxLDL-stimulering i makrofager. Diskusjon Naturlige forbindelser som flavonoider og polyfenoler er kjent for å modulere kardiovaskulære responser via ulike mekanismer, slik som hemming av proinflammatoriske signaler, insulinsensibilisering, oksidativ status og forbedring av blodlipidprofiler40–45. Her rapporterer vi den semi-high-throughput screening-baserte identifiseringen og funksjonelle karakteriseringen av Linkedin, en flavon, som en ny hemmer av TRPV4-avhengige Protherogeniske/inflammatoriske prosesser i makrofager. Vi viste spesifikt at i) ginkgetin blokkerer TRPV4-mediert Ca2 pluss tilstrømning til makrofager, ii) ginkgetinblokkering av TRPV4-funksjon reduserte oxLDL-indusert skumcelledannelse markant ved å undertrykke opptaket av oxLDL i makrofager, og iii) ginkgetinblokker LPS- og oxLDL-indusert fosforylering av JNK1/2, ekspresjon av TRPV4-proteiner og inflammatorisk genuttrykk. Samlet sett viste resultatene fra vår studie at ginkgetin hemmer proaterogen/inflammatorisk makrofagfunksjon på en TRPV4-avhengig måte. Aterosklerose, en aortasykdom, er i utgangspunktet drevet av betennelse og opphopning av makrofager med oxLDL, som induserer dannelsen av makrofagskumceller, som deretter utvikler seg til å danne atheroma2–10. Siden skumcelledannelse er en kritisk prosess i aterogenese, kan forståelse og manipulering av skumcelledannelse ha terapeutisk potensial. Makrofager er kjent for å uttrykke en rekke membranpenetrerende ionekanaler og pumper, inkludert TRPV4, en mekanosensitiv polymodal Ca2 pluss permeabel ionekanal, som aktiveres av både fysiske og biokjemiske stimuli11–24. Publiserte studier av vårt laboratorium og andre har identifisert rollen til TRPV4 i makrofagbetennelse og oxLDL-indusert skumcelledannelse14–16,26. TRPV4 kan dermed tjene som et levedyktig mål for demping av proatherogene prosesser.
Figur 5. Linkedin undertrykker ikke DiI-oxLDL-binding til makrofager. Makrofager ble forbehandlet med bærer eller Linkedin (1 eller 10 µM) i 3 timer etterfulgt av inkubering med DiI-merket oxLDL (2,5 µg/ml) i 1 time ved 4 grader. (A) Representative fluorescensmikroskopiske bilder (opprinnelig forstørrelse, 63×) av DiI-oxLDL-binding på makrofagmembranoverflaten (n=20 celler/tilstand). (B) Resultater fra eksperiment A vist som plottprofil ved bruk av NIH ImageJ-programvare. (C) Kvantitativ analyse av resultater fra A. n=20 celler/tilstand. i å forbedre aterosklerose ved å redusere MMP-2 og MMP-9 og øke nivåene av NO og NOS i thoraxaorta hos rotte52. I denne studien viste vi at ginkgetin blokkerer TRPV4-fremkalte Ca2 pluss tilstrømning i makrofager. Mekanistisk viste vi at ginkgetin blokkerer opptaket av oxLDL, men ikke bindende, i makrofager. Studier gjort in vivo og in vitro antydet en kritisk rolle for CD36 som den viktigste scavenger-reseptoren i opptak av oxLDL og makrofagskumcelledannelse2–7. Det ble vist at CD36 null-mus som mangler ApoE eller LDLR er mindre utsatt for å utvikle aterosklerotiske lesjoner5,6. Tidligere studier fra gruppen vår identifiserte en viktig rolle for CD36-JNK-signalkaskaden i makrofagskumcelledannelse7. Tolllignende reseptorer TLR2, TLR4 og TLR6 fungerer som koreseptorer ved å interagere med CD36 og har vist seg å være involvert i aterogenese2,56,63. Vi undersøkte muligheten for at mangelen på skumcelledannelse sett i Linkedin-behandlede makrofager skyldtes redusert ekspresjon av CD36-, TRPV4-, TLR2-, TLR4- eller TLR6-proteiner. Interessant nok reduserte ikke Linkedin-behandling uttrykket av CD36-, TLR2-, TLR4- eller TLR6-proteiner signifikant ved basale nivåer eller under oxLDL-stimulerte forhold. Imidlertid blokkerte Linkedin spesifikt den oxLDL-induserte oppreguleringen av ekspresjon av TRPV4-proteiner, mens uttrykket ved basale nivåer forble uendret. Tatt i betraktning alt sammen tyder disse resultatene på at ginkgetin blokkerer oxLDL-indusert skumcelledannelse via en mekanisme uavhengig av CD36 og TLR-uttrykk, men avhengig av TRPV4. Tidligere studier fra vår gruppe og andre viste at JNK2-aktivering er involvert i skumcelledannelse og aterosklerotisk lesjonsutvikling7,57. Det ble også rapportert at JNK er involvert i moduleringen av MMP-9 og MMP-13, som er overuttrykt i aterosklerotiske lesjoner64–68. Gitt den anerkjente koblingen til JNK i aterogene prosesser, ønsket vi å finne ut om ginkgetin kunne hemme aktiveringen av JNK. I samsvar med tidligere rapporter viste resultatene våre også at ginkgetin blokkerer inflammatorisk stimulus-indusert fosforylering av JNK2 i makrofager. Dette resultatet antyder en mulig mekanisme som Linkedin blokkerer skumcelledannelse med. Videre fant vi en betydelig nedregulering i det oxLDL-induserte uttrykket av TNF, IL12, IL1 og MCP1 mRNA i ginkgetin-behandlede celler sammenlignet med vehikelkontroll, og fremhever potensielle antiinflammatoriske roller til ginkgetin som respons på oxLDL. Oppsummert viste resultatene våre at ginkgetin hemmer proaterogen og inflammatorisk makrofagfunksjon på en TRPV4-avhengig måte. Disse funnene styrker dermed begrunnelsen for bruk av naturlige forbindelser i utviklingen av potensielle terapeutika og/eller kjemopreventive reagenser.
Referanser
1. Barquera, S. et al. Global oversikt over epidemiologien til den aterosklerotiske kardiovaskulære sykdommen. Arch. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Te cellulær biologi av makrofager i aterosklerose. Cell 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Inflammation in aterosclerosis. Nature 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Cytokiner, makrofag-lipidmetabolisme og skumceller: implikasjoner for behandling av kardiovaskulær sykdom. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Målrettet forstyrrelse av klasse B scavenger-reseptoren CD36 beskytter mot utvikling av aterosklerotisk lesjon hos mus. J. Clin. Investere. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Scavenger-reseptorer klasse AI/II og CD36 er de viktigste reseptorene som er ansvarlige for opptak av modifisert lavdensitetslipoprotein som fører til lipidbelastning i makrofager. J. Biol. Chem. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. En CD36-avhengig signalkaskade er nødvendig for dannelse av makrofagskumceller. Cell Metab. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Aterosklerose - en inflammatorisk sykdom. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Te molekylære mekanismer for trombotiske komplikasjoner av aterosklerose. J. Intern. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Aterosklerose. Nature 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Ultrarask aktivering av TRPV4-ionekanaler ved hjelp av mekaniske krefter påført beta1-integriner på celleoverflaten. Heltall. Biol. (Kamb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-TAZ mekanotransduksjonssignaleringsakse i matrisestivhets- og TGF 1-indusert epitel-mesenkymal overgang. Cell Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Transient reseptorpotensial vanilloid 4 er nødvendig for fremmedlegemerespons og dannelse av gigantiske celler. Er. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. TRPV4 kalsiumpermeabel kanal er en ny regulator for oksidert LDL-indusert makrofagskumcelledannelse. Free Radic. Biol. Med. 110, 142–150 (2017).
