Identifikasjon av vanlige levermetabolitter av den naturlige bioaktive forbindelsen Echinacoside, renset fra Cistanche Tubulosa Ⅱ

Abstrakt:Metabolittidentifikasjon, i det tidlige stadiet, for sammensatte funn er nødvendig å vurderekunnskapen for farmasøytisk forbedring av legemiddelsikkerhet og effektivitet. Selv om stoffethar blitt sluppet på markedet, identifisering og kontinuerlig evaluering av metabolittene ernødvendig for å unngå risikoen for tilbaketrekking etter markedsføring. Glykosid, et legemiddelcistanche, har bredt dokumenterte ernæringsmessige fordeler, inkludertantioksidant,anti-tumor, anti-aldring, hypolipidemic, ogmageslimhinnebeskyttelseseffekter. Nylig,echinacosideA er rapportertsom den viktigste naturlige bioaktive forbindelsen i mycelet til HE for funksjonell matutvikling.I nevrologiske studier er forbruket avechinacosideEt anriket HE-mycelium demonstrerer detbetydelige ernæringsmessige effekter iAlzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, ogiskemisk hjerneslag.

Klikk her for å vite mer informasjon om Echinacoside-funksjoner i Cistanche

Tilførste gang utforsket vi den metabolske prosessen avechinacosideEt molekyl og identifiserte dets metabolitterfra rotte- og menneskelever S9-fraksjonen. Ved bruk av væskekromatografi/trippel kvadrupolmassespektrometer for kvantitativ analyse, observerte vi at 75,44 prosent av echinacoside. A ble metabolisertinnen 60 minutter hos rotter, og 32,34 prosent av Francine A ble metabolisert innen 120 minutter i human S9. Ved hjelp avultra-ytelses væskekromatografi/kvadrupol time-of-flight massespektrometri (UPLC)QTOF/MS) for å identifisere metabolittene til Francine A, ble fem vanlige metabolitter identifisert,og deres mulige strukturer ble evaluert. Forstå den metabolske prosessen av echinacosideog etablering av sin metabolittprofildatabase vil bidra til å fremme den nutraceutical applikasjonen ogoppdagelse av relaterte biomarkører i fremtiden.

1. Introduksjon

Leveren regnes som det nest største organet i kroppen [1]. Etter mat og narkotikagå inn i mage-tarmkanalen gjennom munnhulen, vil mage-tarmpili absorberefordøyde næringsstoffer og legemidler. Portvenesystemet vil motta blodstrømmen som samles innav mage-tarmkanalen og gå inn i leveren for foreløpig behandling av næringsstoffene,metabolitter og legemiddelmolekyler [2,3]. Metabolisme er ofte delt inn i to faser av enbiokjemisk reaksjon. Fase I involverer oksidasjon, reduksjon eller hydrolyse av enzymer ikroppen. Fase II engasjerer seg i konjugasjonen med små endogene stoffer, snudem til svært løselige metabolitter, noe som gjør at metabolitter kan eksporteres til sinusoidal sirkulasjon for renal clearance, eller til galle, som deretter skilles ut fra kroppengjennom urin eller avføring [4–6]. Metabolittidentifikasjon i det tidlige stadiet av legemiddeloppdagelseer nødvendig for å vurdere kunnskapen for å forbedre den farmasøytiske egenskapen, sikkerheten ogeffektiviteten til det bioaktive molekylet. Identifisering av metabolitter og reaktive mellomprodukterforeslår behovet for strukturelle modifikasjoner i undersøkelsesforbindelser for å unngåpåfølgende giftige konsekvenser. Selv om stoffet har vært på markedet, identifikasjonav metabolittene og evaluering er nødvendig for å unngå risikoen for deres etter markedsføringuttak [7,8]. Derfor,in vitro, S9-fraksjonsanalyse gir flere fordelersammenlignet med tidkrevendein vivostudier: (1) de er mottagelig for høy gjennomstrømningscreening og automatisering;(2) ved hjelp avS9 fraksjon gir mulighet for testing av store mengder avforbindelser for medikamentoppdagelse i en kort periode; (3) bidrar til redusert bruk av dyr [9]. 

Echinacoside er en spiselig cistanche som bor i fjellområder avde nordøstlige territoriene i Asia [10], Europa og Nord-Amerika [11]. HAN tilhørerBasidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (klasse), Russulales (orden), Hericaceae (familie),og Hericium (slekt). HE har blitt dokumentert for å vise et bredt spekter av fordelaktigeegenskaper, inkludert antioksidant, anti-tumor, anti-aldring, hypolipidemi og mageslimhinnebeskyttelseseffekter [12–14]. I 1994, Kawagishi et al. oppdaget at diterpenoidechinacosideA, B og C, i mycelet til HE, kan fremme produksjonen av stellatcellelinjer i rottehjernen og stimulering av nervevekstfaktor (NGF) syntese [15]. echinacosideA kan gi nevrobeskyttende effekter og dempe oksidativt stress motslag [16], Alzheimers sykdom [17], Parkinsons sykdom [18], iskemisk hjerneslag og depresjon in vivo[19,20]. Dessuten kan echinacoside A passere gjennom blod-hjerne-barrieren tilrotter for å støtte utviklingen av HE-mycelia som en funksjonell mat for nevrohelseforbedring [21]. Dette spiselige cistanche-myceliet har blitt et hett problem blant forskereforsøk på å forstå dens viktige rolle i utviklingen av sentrale og perifere nerver, differensiering, vekst og regenerering [22]. Nyere studier har også vistat echinacoside A-anriket HE har potensielle fordeler ved behandling av Alzheimers og Parkinsønns sykdom [23–25]. Imidlertid har ingen studie diskutert echinacoside A's mulige metabolskebiomarkører som kan bidra til denne ernæringsmessige effekten.

I denne studien,echinacosideEn forbindelse ble renset fra echinacoside A-anriket HEmycel og ble metabolisert ved bruk av to forskjellige lever S9 fraksjoner: rotte og menneske. Ved hjelp avvæskekromatografi/trippel quadrupol massespektrometer (HPLC-QQQ/MS) for quantitativ analyse av echinacoside A, og ultra-ytelses væskekromatografi/quadrupoltime-of-flight massespektrometri (UPLC-QTOF/MS) for å identifisere metabolittene til echinacosideA på hvert tidspunkt. Vi tar sikte på å forstå metabolske hastigheten til echinacoside A og etableresin metabolittprofildatabase for å bidra til å fremme bruken av kosttilskuddog forskning på potensielle medisiner i fremtiden.

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer og reagenser

HE-stammen (BCRC 35669) ble hentet fra Bioresources Collection ogForskningssenter i Food Industry Research and Development Institute, Hsinchu, Taiwan.Stammen ble først dyrket i en ager-skråning før den ble overført til en potet dekstroseagarplate på 26◦C i 15 dager. På dag 15 ble HE-kulturene overført til 1,3 Lflytende medium (i 2 L kolber). Den flytende kulturen ble ristet ved 120 omdreininger/min 25◦C for5 dager. Deretter ble de oppskalert i 500 L, 20-tonn gjæringsbeholdere i 5 dager og 12 dager,hhv. Kulturmediet justeres til pH 4,5 og inneholder 4,5 prosent glukose, 0,5 prosentsoyapulver, {{0}},25 prosent gjærekstrakt, 0,25 prosent pepton og 0,05 prosent MgSO4. Til slutt, HEmyceli ble høstet på slutten av 20-tonn gjæringsprosessen. Disse råvareneble lyofilisert, malt i pulver og lagret i en eksikkator. echinacoside A var daekstrahert fra HE og kvantifisert i henhold til tidligere studier [26]. Metanol (LC-MSkarakter) ble oppnådd fra Merck (Darmstadt, Tyskland); acetonitril (LC-MS-kvalitet), maursyresyre (FA, LC-MS-kvalitet, 98 prosent renhet) og ammoniumacetat (98 prosent renhet) ble oppnåddfra Honeywell (Honeywell Burdick og Jackson, Muskegon, MI, USA). Rotteleveren S9fraksjon ble oppnådd fra Moltox (Boone, NC, USA). Den humane leverens S9-fraksjon varhentet fra Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA).

2.2. Rotte- og menneskelever S9-fraksjon

til settanbefalingen. Den tilberedte løsningen ble holdt ved 4◦C til echinacoside Aforbindelse (10µM) ble lagt til, etterfulgt av aktivering i en 37◦C vannbad. Nårmetabolsk tid hadde nådd sine tidspunkter, 150µL av løsningen ble trukket frastamløsningen og bråkjølt ved å tilsette to volumer iskald ACN. Den stoppetløsningen overføres deretter til QTOF for videre metabolittanalyse.

2.3. Instrumentering og betingelser

HPLC-QQQ/MS-analyse ble utført på et Agilent 1100-serien HPLC-system (Agilent, Palo Alto, CA, USA) kombinert med et API 3000 trippelt kvadrupol massespektrometer(Applied Biosystems, Warrington, Storbritannia), med en turboassistert ionespray (ESI) ioniseringkilde i positiv ioniseringsmodus. Kromatografisk separasjon ble utført på enAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µm). Kolonnetemperaturen varopprettholdt på 22◦C. Den mobile fasen besto av vann som inneholdt 0,1 prosent maursyre(A) og metanol (B). Gradienteluering ble brukt, og startet med 70 prosent B, økende til 100 prosentB innen 5 minutter, hold i 3 minutter med 90 prosent B, reduserer B til 70 prosent innen 0,1 minutter, ogre-ekvilibrering ved 70 prosent B i 2,9 min. En stipendiat på 350µL/min ble påført, og et volumav 10µL ble injisert.

Deteksjon ble utført med en ioniserende spenning på pluss 4500 V. Ionekildetemperatursatt til 350◦C, med nitrogen med ultrahøy renhet som gardingass (7 psi). Forstøvergassen var8 psi. Andre masseavhengige parametere, for eksempel declustering potential (DP), inngangpotensial (EP), fokuseringspotensial (FP) og kollisjonsenergi (CE) for hver forbindelse, varbestemt i positiv modus ved bruk av standardløsninger. Multippel reaksjonsovervåking(MRM) ble utført ved bruk av nitrogen som kollisjonsgass (2 psi) og med en oppholdstid på200 ms for hver overgang. echinacoside A ble oppdaget ved å overvåke overgangenem/z 443.200 → 301.200, 283.200. Dataene ble analysert ved hjelp av Analyst 1.4.2-programvare (AppliedBiosystems, Concord, ON, Canada) og GraphPad (Prism 8.0.0.).

UPLC-QTOF/MS-analyse ble utført på et Agilent 1290 Infinity II UPLC-system(Agilent, Palo Alto, CA, USA), kombinert med en Agilent 6546 quadrupol time-of-flight massespektrometri (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Kromatografisk separasjon ble utførtpå en Phenomenex Kinetex® C18 LC-søyle (3 mm× 100 mm× 1.7 µm). Kolonnentemperaturen ble holdt på 40°C◦C. Den mobile fase A besto av vannholdig0.1 prosent (v/v) maursyre i positiv modus, 0,1 prosent (v/v) maursyre og 10 mM CH3COONH4 i negativ modus. Den mobile fase B var acetonitril. Gradienteluering ble brukt, startendemed 5 prosent B og hold i 0,5 min, øker til 50 prosent B innen 5,5 min, øker til 100 prosentB innen 10 min, og hold i 6 min. En stipendiat på 400µL/min ble brukt, og envolum på 2µL ble injisert.

Agilent 6546 quadrupol time-of-flight massespektrometri var utstyrt med en elektr.trospray ionisering (ESI) kilde. Datainnsamlingen var under kontroll av Mass Hunterarbeidsstasjonsprogramvare. De typiske driftskildeforholdene i positivt og negativt ionESI-modus ble optimalisert som følger: ionesprayspenning (ESIPlus/ESI−) var4000 V/3000 V; gasstemperaturen var 320◦C; tørkegass-medhastigheten var 8 l/min.; nebulisatortrykket var45 psi; mantelgasstemperaturen var 350◦C; kappegass-stipendhastigheten var 12 l/min; kollisjonenenergien var 10, 20, 40 og 60 V. Metabolitter ble identifisert ved hjelp av Agilent MassHunterProgramvare for biotransformasjon (versjon B.04.00) (Santa Clara, CA, USA). Kromatogrammerog massespektra til foreldrene og identifiserte metabolitter ble ekstrahert ved bruk av AgilentMassHunter Qualitative Analysis-programvare (versjon B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp pluss 86 15292862950