Identifikasjon av nøytrofil gelatinase-assosiert lipokalin som en ny biomarkør for tidlig urin for iskemisk nyreskade

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

JAYA MISHRA,* QING MA,* ANNE PRADA,* MARK MITSNEFES,* KAMYAR ZAHEDI,* JUN YANG,† JONATHAN BARASCH,†, og PRASAD DEVARAJAN*

*Neprologi og hypertensjon, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, Ohio; og † Nephrology, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York

Abstrakt.

Akuttnyresvikt (ARF) sekundært til iskemisk skade er fortsatt et vanlig og potensielt ødeleggende problem. En transkriptomomfattende avhørsstrategi ble brukt for å identifisere nyregener som induseres veldig tidlig etter nyreiskemi, hvis proteinprodukter kan tjene som nye biomarkører for ARF. Syv gener som er oppregulert pluss - 10-fold ble identifisert, hvorav ett (Cyr61) nylig er rapportert å være indusert etter nyreiskemi. Uventet var induksjonen av de andre seks transkripsjonene ny for ARF-feltet. I denne studien ble et av disse tidligere ukjente genene ytterligere karakterisert, nemlig nøytrofil gelatinase-assosiert lipocalin (NGAL), fordi det er et lite utskilt polypeptid som er proteaseresistent og som følgelig lett kan oppdages i urinen. Den markerte oppreguleringen av NGAL mRNA og proteinnivåer i den tidlige postiskemiske musennyreble bekreftet. NGAL-proteinekspresjon ble hovedsakelig påvist i prolifererende cellekjerneantigenpositive proksimale tubulusceller, i en punktert cytoplasmatisk fordeling som samlokaliserte med markører for sene endosomer. NGAL ble lett påvist i urinen i den aller første urinutgangen etter iskemi i både muse- og rottemodeller av ARF. Forekomsten av NGAL i urinen var relatert til dosen og varigheten avnyreiskemi og forut for oppkomsten av andre urinmarkører som N-acetyl- -D-glukosaminidase og 2-mikroglobulin. Opprinnelsen til NGAL fra tubulusceller ble bekreftet i dyrkede humane proksimale tubuliceller utsatt for in vitro iskemisk skade, hvor NGAL mRNA ble raskt indusert i cellene og NGAL-protein var lett påviselig i kulturmediet innen 1 time etter mild ATP-utarming. NGAL var også lett påviselig i urinen til mus med cisplatin-indusert nefrotoksisitet, igjen før opptredenen av N-acetyl- -D-glukosaminidase og 2-mikroglobulin. Resultatene indikerer at NGAL kan representere en tidlig, sensitiv, ikke-invasiv urinbiomarkør for iskemisk og nefrotoksisknyreskade.

Cistanche herbakan behandle nyreskade

Få mer informasjon om Cistanche-relaterte produkter

Akuttnyrefeil(ARF) sekundært til iskemisk eller nefrotoksisk skade er fortsatt et vanlig og potensielt ødeleggende problem i klinisk nefrologi, med en vedvarende høy dødelighet til tross for betydelige fremskritt innen støttebehandling (1–4). Banebrytende studier over flere tiår har belyst rollene til vedvarende vasokonstriksjon, tubulær obstruksjon, cellulære strukturelle og metabolske endringer, og den inflammatoriske responsen i patogenesen av ARF (4–7). Selv om disse studiene har banet vei for vellykkede terapeutiske tilnærminger i dyremodeller, har translasjonsforskningsinnsats hos mennesker gitt skuffende resultater (2–4). Årsakene til dette kan inkludere nyrenes mangefasetterte respons på iskemi og nefrotoksiner og en mangel på tidlige markører for ARF med påfølgende forsinkelse i oppstart av behandling (4–8).

Forsøk på å avdekke det molekylære grunnlaget for disse utallige tidlignyreresponser har blitt tilrettelagt av nyere fremskritt innen funksjonell genomikk som har gitt nye verktøy for genomomfattende analyse av komplekse biologiske prosesser som iskemisk ARF (8–11). cDNA-mikroarray-metodene gir parallelle og kvantitative ekspresjonsprofiler av tusenvis av gener, som i kombinasjon med bioinformatikkverktøy kan identifisere gener i en biologisk bane, karakterisere funksjonen til nye gener og oppdage sykdomsunderklasser (9). Ved å bruke denne screeningsteknikken har vi identifisert en undergruppe av syv gener hvis uttrykk er oppregulert 0-fold i løpet av de første timene etter iskemisknyreskadei en musemodell. En av disse transkripsjonene, cysteinrikt protein 61 (Cyr61), har nylig blitt bekreftet å være indusert av nyreiskemi (8), men oppførselen til de andre seks differensielt uttrykte genene er ny for ARF-litteraturen. I denne studien valgte vi å karakterisere ytterligere ett av disse tidligere ukjente genene, nemlig nøytrofil gelatinase-assosiert lipocalin (NGAL), fordi det er et lite utskilt polypeptid som kan påvises i urinen, spesielt fordi det er proteaseresistent. Resultatene våre indikerer at NGAL kan representere en ny biomarkør for tidlig urin for iskemisk og nefrotoksisknyreskade.

Materialer og metoder

Musemodeller av nyreiskemi-reperfusjonsskade

Vi brukte veletablerte murine modeller der de strukturelle og funksjonelle konsekvensene av korte perioder mednyreiskemi er tidligere dokumentert (11–15). Kort fortalt ble Swiss-Webster hannmus (Taconic Farms, Germantown, NY) som veide 25 til 35 g holdt med 12:12-t lys: mørk syklus og fikk fri tilgang til mat og vann. Dyrene ble bedøvet med natriumpentobarbital (50 mg/kg intraperitonealt) og plassert på et varmebord for å opprettholde en rektal temperatur på 37 grader. Tre separate protokoller ble brukt: (1) unilateral iskemi uten ARF, (2) bilateral iskemi med ARF og (3) bilateral mild subklinisk iskemi. For de unilaterale iskemi-eksperimentene ble den venstre nyrepedikkelen okkludert med en ikke-traumatisk vaskulær klemme i 45 minutter, i løpet av denne tiden ble nyrene holdt varm og fuktig. Klemmen ble deretter fjernet, nyren ble observert for retur av blodstrøm, og snittet ble suturert. Musene fikk komme seg i et oppvarmet bur, og tidsbestemte urinsamlinger ble oppnådd. Etter 0, 3, 12 eller 24 timer med reperfusjon, ble dyrene bedøvet på nytt, bukhulen ble åpnet, og blod ble oppnådd via punktering av den nedre vena cava for måling av serumkreatinin ved hjelp av kvantitativt kolorimetrisk analysesett (Sigma, St. Louis, MO). Musene ble drept, nyrene ble perfusjonsfiksert in situ med 4 prosent paraformaldehyd i PBS, og begge nyrene ble høstet (den høyre nyren fungerte som kontroll for hvert dyr). Minst tre separate dyr ble undersøkt ved hver av reflow-periodene. Halvparten av hver nyre ble hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved 70 grader inntil videre behandling; en prøve ble fikset i formalin, parafininnstøpt og seksjonert (4 m). Parafinsnitt ble farget med hematoksylin-eosin og undersøkt histologisk. De sammenklemte nyrene viste de karakteristiske morfologiske endringene som følge av iskemi-reperfusjonsskade, som tidligere publisert av andre (12–14) og oss (11). Den andre halvdelen av hver nyre ble innebygd i OCT-forbindelsen (Tissue-Tek), og frosne seksjoner (4 m) ble oppnådd for immunhistokjemi. For den bilaterale iskemien med ARF-eksperimenter ble begge nyrene klemt i 30 minutter og undersøkt ved forskjellige reflow-perioder som beskrevet ovenfor. Denne gruppen på åtte dyr ble designet for å representere klinisk ARF og viste en betydelig økning i serumkreatinin 24 timer etter skaden. For de bilaterale milde subkliniske iskemi-eksperimentene ble begge nyrene bare klemt i 5, 10 eller 20 minutter og undersøkt ved forskjellige reperfusjonsperioder som ovenfor. Denne milde skadegraden ble designet for å simulere subklinisk nyreiskemi, og mus i denne gruppen viste ingen økninger i serumkreatinin målt 24 timer etter skaden.

Rottemodell av nyreiskemi-reperfusjonsskade

Vi brukte veletablerte gnagermodeller avnyreiskemi-reperfusjonsskade (10). Kort fortalt ble Sprague-Dawley hannrotter som veide 200 til 250 g (Taconic Farms) bedøvet med ketamin (150 g/g) og xylazin (3 g/g) og utsatt for bilateral nyrearterieokklusjon med mikrovaskulære klemmer i 30 minutter som beskrevet i museprotokollen. Tidsbestemte urinsamlinger ble oppnådd ved 3, 6, 9, 12 og 24 timers reperfusjon, og blod ble samlet for kreatininmåling ved avlivingstidspunktet (24 timer).

Musemodell av cisplatin-indusert nyreskade

Vi brukte veletablerte musemodeller der de strukturelle og funksjonelle konsekvensene av cisplatinadministrasjon er tidligere dokumentert (16–18). Kort fortalt ble mus gitt en enkelt intraperitoneal injeksjon av cisplatin (20 mg/kg kroppsvekt). Dette resulterer i tubuluscelle-nekrose og apoptose og forhøyet urea-nitrogen i blodet innen 3 dager etter cisplatin-injeksjonen (16–18). Dyrene ble holdt i metabolske bur, og urinansamlinger ble oppnådd daglig.

RNA-isolasjon

Hele nyrevev fra mus (eller dyrkede humane proksimale tubuliceller; se nedenfor) ble ødelagt med en vevsterror (Biospec Products, Racine, WI). Totalt RNA fra kontroll- og iskemiske nyrer ble isolert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og kvantifisert ved spektrofotometri.

Microarray-prosedyrer

Detaljerte beskrivelser av mikroarray-maskinvare og prosedyrer er publisert tidligere (11). Kort fortalt, for hvert eksperiment ble 100 g renset totalt musenyre-RNA reverstranskribert med Superscript II revers transkriptase (Life Technologies, Rockville, MD) i nærvær av Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ) for kontroller og Cy5-dUTP for iskemiske prøver. cDNA-prøvene ble renset ved bruk av et Microcon YM-50-filter (Millipore, Madison, WI) og hybridisert til mikroarray-objektglass inneholdende 8979 unike sekvensverifiserte museprober (11). Tre separate dyr ble undersøkt for hver av reflow-periodene, og minst to uavhengige mikroarray-eksperimenter ble utført for hvert av dyrene. Array-lysbildene ble skannet ved hjelp av en mikroarray-skanner (GenePix 4000B; Axon Instruments, Foster City, CA) for å få separate TIFF-bilder for Cy3 og Cy5 fluorescens. Signalintensitetene for Cy3 og Cy5 ble bestemt for individuelle gener ved å bruke GenePix Pro 3.0 dataekstraksjonsprogramvare (Axon Instruments). Kvalitetskontroll og dataanalyse ble gjennomført som beskrevet tidligere (11).

cistanche plante for nyre

Semikvantitativ omvendt transkripsjon – PCR

En lik mengde (1 pluss - g) totalt RNA fra kontroll- og eksperimentelle musenyrer ble reverstranskribert med Superscript II revers transkriptase (Life Technologies) i nærvær av tilfeldige heksamerer i henhold til produsentens instruksjoner. PCR ble utført ved bruk av et sett (Roche, Indianapolis, IN) og følgende primere: mus NGAL sense 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3', mus NGAL antisense 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG-3', human NGAL sense 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3', og Human NGAL antisense 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3'. Primerpar for muse- og human-aktin og glyceraldehyd-3- fosfatdehydrogenase (GAPDH) ble oppnådd fra Clontech (La Jolla, CA). Hånlige reaksjoner uten cDNA fungerte som negative kontroller. PCR-produkter ble analysert ved agarosegelelektroforese etterfulgt av farging med etidiumbromid og ble kvantifisert ved densitometri. Foldeendringer i NGAL mRNA-ekspresjon i iskemisk versus kontrollnyrer ble uttrykt etter normalisering for -aktin eller GAPDH-amplifikasjon.

Mikroskopi

For NGAL-deteksjon ble frosne seksjoner permeabilisert med {{0}},2 prosent Triton X-100 i PBS i 10 minutter, blokkert med geiteserum i 1 time og inkubert med primært antistoff mot NGAL ( 1:500 fortynning) i 1 time. Objektglass ble deretter eksponert i 30 minutter i mørket for sekundære antistoffer konjugert med Cy5 (Amersham, Arlington Heights, IL) og visualisert med et fluorescensmikroskop (Zeiss Axiophot) utstyrt med rhodaminfiltre. For samlokalisering av NGAL med Rab11 ble seriesnitt først inkubert med NGAL-antistoff eller et monoklonalt antistoff mot Rab11 (1:500 fortynning; Transduction Laboratories), deretter med sekundære antistoffer konjugert med enten Cy5 (for NGAL) eller Cy3 (for Rab11) ) og visualisert med henholdsvis rhodamin- eller fluoresceinfiltre. For samlokalisering av NGAL med prolifererende cellekjerneantigen (PCNA), ble seksjoner co-inkubert med NGAL-antistoff og et monoklonalt antistoff mot PCNA (1:500 fortynning; Upstate), og ble påvisning utført ved immunoperoksidasefarging (ImmunoCruz Staining System, Santa Cruz bioteknologi). For TUNEL-analysen brukte vi ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit (Clontech). Parafinseksjoner ble avparafinisert gjennom xylen og synkende etanolkvaliteter, fiksert med 4 prosent formaldehyd/PBS i 30 minutter ved 4 grader, permeabilisert med proteinase K ved romtemperatur i 15 minutter og 0,2 prosent Triton X-100/PBS i 15 minutter min ved 4 grader, og inkubert med en blanding av nukleotider og TdT-enzym i 60 minutter ved 37 grader. Reaksjonen ble avsluttet med 2 SSC, og seksjonene ble vasket med PBS og montert med Crystal/mount (Biomed, Foster City, CA). TUNEL-positive apoptotiske kjerner ble påvist ved visualisering med et fluorescensmikroskop.

Urinsamling

Mus eller rotter ble plassert i metabolske bur (Nalgene, Rochester, NY), og urin ble samlet før og hver time etter bilateralnyrearterieokklusjon. Urinprøver ble sentrifugert ved 5000 g for å fjerne rusk, og supernatanten ble analysert ved Western blotting. Urinkreatinin ble målt med et kvantitativt kolorimetrisk analysesett (Sigma) for å normalisere prøver for urin-NGAL-bestemmelse. Et kolorimetrisk analysesett for bestemmelse av N-acetyl-D-glukosaminidase (NAG) i urinen ble oppnådd fra Roche.

Cellekultur

Menneskelignyreproksimale tubulære epitelceller (RPTEC) ble oppnådd fra Clonetics (San Diego, CA). Celler ble dyrket innnyreepitelcelle basal medium supplert medNyreEpitelcellevekstmedium (REGM) kompleks ({{0}},5 l/ml hydrokortison, 10 pg/ml hEGF, 0,5 - g/ml epinefrin, 6,5 pg/ml trijodtyronin, 10 pluss - g/ml transferrin, 5 - g/ml insulin, 1 -g/ml gentamicinsulfat og 2 prosent FBS), som anbefalt av produsenten.

Mild ATP-utarming av dyrkede celler

Vi modifiserte tidligere beskrevne protokoller for in vitro iskemi ved ATP-utarming med hemmere av oksidativ fosforylering (19,20). På den andre dagen etter konfluens ble RPTEC-celler inkubert med 1 m antimycin A (Sigma) i varierende tidsrom opptil 6 timer. Vi har tidligere vist at dette resulterer i mild delvis reversibel ATP-utarming og ingen tap av cellelevedyktighet i andre typer dyrkede nyreepitelceller som MDCK (19) og 786-O (20) celler. ATP-nivåer ble overvåket ved bruk av et luciferasebasert analysesett (Sigma) og uttrykt som en prosentandel av kontrollverdier. Celler ble høstet på forskjellige tidspunkter for ATP-uttømming og analysert for NGAL mRNA-ekspresjon ved revers transkripsjon-PCR (RT-PCR) og NGAL-proteinekspresjon ved Western-analyse. Sekresjonen av NGAL i kulturmediet ble også overvåket.

Andre materialer og metoder

Alle kjemikalier ble kjøpt fra Sigma med mindre annet er spesifisert. For Western blotting ble proteinkonsentrasjoner bestemt ved Bradford-analysen (Bio-Rad, Hercules, CA), og like mengder totalt protein ble lastet i hver bane. Monoklonalt antistoff mot - -tubulin (Sigma) ble brukt ved 1:10,000 fortynning for bekreftelse av lik proteinbelastning, og et polyklonalt antistoff mot NGAL ble brukt ved 1:500 (21). Monoklonalt antistoff mot 2-mikroglobulin ble brukt ved 1:500 (Sigma). Immundeteksjon av overførte proteiner ble oppnådd ved bruk av forbedret kjemiluminescens (Amersham).

Resultater

Karakterisering av dyremodellene for tidlig nyreiskemi-reperfusjonsskade

Vi brukte murine modeller der de strukturelle og funksjonelle konsekvensene av korte perioder med nyreiskemi er dokumentert (11–15). De karakteristiske histopatologiske trekk ved iskemisk skade var lett synlige i 24-h reperfusjonsprøver etter både unilateral (45 min) og bilateral (30 min) iskemi. Disse inkluderte tap av børstekantmembraner, tubulær dilatasjon, flatet tubulært epitel, luminale rusk og interstitielle infiltrater (figur 1). Vi dokumenterte tilstedeværelsen av apoptotiske celler ved å bruke TUNEL-analysen. Apoptose var hovedsakelig lokalisert til distale tubulære celler og stigende lem av Henles løkke, både i løsrevne celler i lumen så vel som festede celler. Sporadiske proksimale tubulære celler var også apoptotiske, men glomeruli var i hovedsak blottet for apoptose. Ingen TUNEL-positive celler ble påvist i kontrollnyrene eller i de iskemiske prøvene der TdT ble utelatt (ikke vist). De ovennevnte histologiske og apoptotiske endringene var fraværende fra nyrer utsatt for mildere grader av iskemi (5, 10 eller 20 minutter med bilateral iskemi; ikke vist). Serumkreatininnivåene reflekterte de observerte histopatologiske endringene. Mus med ensidig nyreiskemi eller milde grader av subklinisk bilateral iskemi viste således serumkreatininnivåer som ikke kunne skilles fra kontrolldyr, mens mus med bilateral iskemi i 30 minutter viste en signifikant økning av serumkreatinin (figur 1).

Figur 1. Karakterisering av musemodellen for iskemisknyreskade. Venstre paneler viser resultatene av hematoxylin- og eosinfarging (øverst) og TUNEL-farging (nederst) av nyreseksjoner fra kontrollmus eller etter 24 timer med iskemi-reperfusjon (IRI). (Høyre) Resultater av serumkreatininbestemmelser i kontrollmus (Con), etter unilateral iskemi i 45 minutter (U45), eller etter bilateral iskemi i forskjellige perioder som vist. *P 0.05 versus kontroll. Tall innenfor stolper indikerer et antall dyr.

NGAL mRNA er markert indusert i den tidlige postiskemiske nyren

Ved mikroarray-analyse av mus med ensidignyreiskemi, NGAL ble funnet å være konsekvent indusert (3,2 pluss - 0.5-fold, 11,1 pluss - 1.2-fold og 4,3 pluss {{1{{30} }}}.6-fold ved 3, 12 og 24 timers reperfusjon) i den iskemiske musenyren sammenlignet med kontrollnyrene fra samme dyr (gjennomsnittlig pluss - SD fra tre dyr på hvert tidspunkt). Dette funnet ble bekreftet av semikvantitativ RT-PCR, ved bruk av en normaliseringsprotokoll med både pluss-aktin og GAPDH. Ingen signifikante endringer i mRNA-ekspresjon av verken pluss-aktin eller GAPDH ble notert ved noen av reperfusjonsperiodene som ble undersøkt, som beskrevet tidligere (11). Ved å bruke musespesifikke primere oppdaget vi imidlertid betydelig oppregulering av NGAL mRNA-ekspresjon (4,1 pluss -0.5-fold, 9 pluss -0.6-fold og 4,2 pluss 0.4-fold ved henholdsvis 3, 12 og 24 timer reperfusjon, der verdiene representerer gjennomsnittlig pluss - SD fra tre separate dyr). Disse resultatene er illustrert i figur 2 og er generelt i samsvar med endringene oppdaget ved transkriptomanalyse.

Figur 2. Induksjon av mus nyre nøytrofil gelatinase-assosiert lipocalin (NGAL) mRNA etter iskemi. (Topp) Representativ revers transkripsjon – PCR (RT-PCR) med primere for museaktin og NGAL, ved bruk av RNA ekstrahert fra nyrene til kontrollmus (C) eller etter forskjellige reperfusjonsperioder som vist (timer). Bane M inneholder en 100-bp DNA-stige. (Bund) Fold økning i NGAL mRNA-ekspresjon på forskjellige tidspunkter fra kontroll (CON). Verdier oppnådd ved mikroarray (heltrukken linje) versus RT-PCR (stiplet linje) er gjennomsnittlig SD fra tre eksperimenter på hvert tidspunkt.

NGAL-protein er markert overuttrykt i de proksimale tubuli av tidlige iskemiske musenyrer

Det var neste av interesse å bestemme om det postiskemiske uttrykket av NGAL-protein i nyrene er parallell med det til mRNA. Ved vestlig analyse var NGAL nettopp påviselig som et 25-kD immunreaktivt peptid i kontrollmusenyrer. Identiteten til dette båndet som NGAL ble etablert i et eget sett med eksperimenter, der preinkubering av det primære antistoffet med rekombinant muselipokalin fullstendig blokkerte denne immunreaktiviteten (ikke vist). I de unilaterale iskemieksperimentene ble NGAL-ekspresjon indusert tre til fire ganger ved densitometri i den iskemiske nyren fra fem separate dyr innen 3 timer etter skaden, som vist i figur 3. Denne responsen ble dramatisk forbedret i de bilaterale iskemieksperimentene fra åtte separate dyr . NGAL i disse musene ble indusert tre ganger etter 3 timers reperfusjon, nådde en topp 12- ganger i 24-t prøvene, og falt til normale nivåer ved gjenopprettingsperioden for 72-t (Figur 3) .

Figur 3. Induksjon av musenyre-NGAL-protein etter unilateral eller bilateral iskemi. (Topp) Representative Western blots med hele nyreprøver hentet fra kontrollmus (Con) eller etter reperfusjonsperioder som vist (timer), probet med et polyklonalt antistoff mot NGAL eller et monoklonalt antistoff mot tubulin (for å demonstrere lik proteinbelastning). Molekylvektmarkører er til venstre. (Bund) Fold økning i NGAL-proteinekspresjon på forskjellige tidspunkter fra kontroll (CON). Verdier oppnådd ved densitometri er gjennomsnitt SD fra fem dyr for unilateral iskemi og åtte dyr for bilateral iskemi

Ved å bruke immunhistokjemiske teknikker demonstrerte vi deretter at NGAL-protein knapt var detekterbart i kontrollmusenyrer, men er oppregulert hovedsakelig i proksimale tubuli innen 3 timer etter iskemi som illustrert i figur 4. Identifikasjon av proksimale tubuli i disse seksjonene var basert på tilstedeværelsen av en børste grensemembran, forholdet mellom kjernefysisk og cellestørrelse og cellulær morfologi. Den induserte NGAL dukket opp i en punktert cytoplasmatisk fordeling i proksimale tubuliceller, som minner om et utskilt protein. Dette uttrykksmønsteret var identisk i både ensidige og bilaterale modeller for iskemi-reperfusjonsskade og var konsekvent tydelig i hvert dyr som ble studert. Glomeruli var blottet for NGAL-uttrykk, og ingen NGAL-uttrykkende nøytrofiler var tydelige. Fordi NGAL har vist seg i dyrkede Wilms-tumornyreceller å samlokalisere i det minste delvis med endosomer (21), undersøkte vi i seriesnitt fordelingen av NGAL og Rab11 (en markør for sene resirkuleringsendosomer). Sammenslåtte bilder viste en betydelig samlokalisering av NGAL med Rab11 (figur 4). For å utforske den funksjonelle betydningen av forbedret NGAL-ekspresjon etter iskemi, undersøkte vi serielle nyreseksjoner for NGAL-ekspresjon, TUNEL-positive kjerner eller PCNA-positive kjerner. Mens tubulusceller som overuttrykker NGAL ikke var TUNEL-positive (ikke vist), var en signifikant samlokalisering av NGAL og PCNA tydelig i de prolifererende og regenererende cellene ved 48-t-tilbakestrømningsperioden (figur 4).

Figur 4. Induksjon av musenyre-NGAL-protein etter iskemi. (Topp) Representative immunhistokjemiresultater på frosne seksjoner av musenyrer oppnådd fra kontrollmus eller etter varierende perioder med reflow som vist (timer), sondert med et polyklonalt antistoff mot NGAL. G, glomerulus. Panelet merket HP er en høyeffekts 100 pluss -forstørrelse, og de andre panelene er på 20. (Nederst) De to venstre panelene viser en tubuli etter 3 timers reperfusjon, som uttrykker NGAL (rød) eller Rab11 (grønn). Det tredje panelet viser et sammenslått bilde, som indikerer samlokalisering i gult. Panelet til høyre viser samlokalisering av NGAL med prolifererende cellekjerneantigen i tubuli etter 48 timers reflow.

NGAL-protein oppdages enkelt i urinen umiddelbart etter induksjon av ARF hos mus

Det var neste av betydelig interesse å avgjøre om det postiskemiske uttrykket av NGAL-protein kunne påvises i urinen, og dermed antyde dets nytte som en tidlig ikke-invasiv biomarkør for iskemisknyreskade. Ved bruk av urinkreatininkonsentrasjoner for å utjevne for prøvebelastning, var NGAL fraværende i urinen før iskemi. I slående kontrast var NGAL manifest som et 25-kD-bånd innen 2 timer etter skaden (i den aller første urinutgangen etter iskemi) hos alle undersøkte dyr (fem med unilateral og åtte med bilateral iskemi), som vist i Figur 5. Identiteten til dette båndet som NGAL ble etablert i et eget sett med eksperimenter, der preinkubasjon av det primære antistoffet med rekombinant muselipokalin fullstendig blokkerte denne immunreaktiviteten (ikke vist). Bemerkelsesverdig nok var NGAL lett påviselig i så lite som 1 l ubehandlet urin ved Western-analyse og vedvarte i hele varigheten som ble undersøkt (24 timer med reperfusjon). Vi sammenlignet deretter urinutskillelse av NGAL med tidligere etablerte skademarkører, som 2-mikroglobulin og NAG. Mens urin-NGAL var tydelig innen 2 timer etter iskemi, var 2-mikroglobulin påviselig i de samme urinprøvene først etter 12 timer med unilateral og 8 timer med bilateral iskemi (Figur 5). På samme måte ble urin-NAG-utskillelse signifikant økt bare etter 12 timer med unilateral og 8 timer med bilateral iskemi sammenlignet med ikke-iskemiske kontrolldyr (figur 5).

Figur 5. Tidlig påvisning av NGAL-protein i urinen hos mus med iskemisk akuttnyrefeil (ARF). (Topp) Representative Western blots av ubehandlede urinprøver (1 til 2 pluss - l per bane, normalisert for kreatinininnhold) ble oppnådd ved reperfusjonsperioder som vist (timer), etter unilateral eller bilateralnyrearterieklemming. Molekylvektsmarkører vises til venstre. Blottene ble sondert med NGAL (øverst) eller {{0}}mikroglobulin (Beta2-M; midten). (Bund) Urin-N-acetyl--D-glukosaminidase (NAG)-bestemmelser ved forskjellige reperfusjonsperioder som angitt, fra fem dyr for unilateral iskemi og åtte dyr for bilateral iskemi. Verdier er gjennomsnittlige SD. *P 0,05 versus kontroll på hvert tidspunkt, ANOVA.

NGAL-protein oppdages enkelt i urinen selv etter mild nyreiskemi hos mus

For å bestemme følsomheten til urin-NGAL-deteksjon i fravær av åpen ARF, brukte vi protokoller der separate sett med mus ble utsatt for bare 5, 10 eller 20 minutter bilateralnyrearterieokklusjon. Disse studiene ble designet for å vurdere utskillelse av NGAL i urin etter mild subklinisk nyreiskemi. Serumkreatinin målt etter 24 timers reflow var innenfor normale grenser i alle disse musene (figur 1). Påfallende ble NGAL lett påvist i så lite som 1 l ubehandlet urin hos disse dyrene (Figur 6), selv om utseendet var noe forsinket sammenlignet med dyr med åpenlyst ARF. Mens 30 minutter med bilateral iskemi resulterte i utskillelse av NGAL i urin innen 2 timer (Figur 5), manifesterte mus med 20 eller 10 minutter med bilateral iskemi urin-NGAL etter 4 timer og de med 5 minutter med iskemi utskilte NGAL først etter 6 timer ( Figur 6). Forekomsten av NGAL i urinen korrelerer således med dosen og varigheten av nyreiskemi.

NGAL-protein oppdages enkelt i urinen umiddelbart etter induksjon av ARF hos rotter

Figur 6. Påvisning av NGAL-protein i urinen hos mus med subklinisk nyreiskemi. Representativt Western blot av ubehandlede urinprøver (1 til 2 l per bane, normalisert for kreatinininnhold) oppnådd ved reperfusjonsperioder som vist (timer), etter 5, 10 eller 20 minutter med bilateral nyrearterieklemming. Molekylvektsmarkører vises til venstre. Disse dyrene viste normalt serumkreatinin ved 24 timers reflow.

Fordi det eksisterer en debatt om artsforskjeller i responsene på nyrearterieokklusjon (22), undersøkte vi deretter oppførselen til NGAL i en annen dyremodell, nemlig en veletablert rottemodell for nyreiskemi-reperfusjonsskade. Ved bruk av urinkreatininkonsentrasjoner for å utjevne for prøvebelastning, var NGAL fraværende i urinen før iskemi. I markant kontrast var NGAL manifest som et 25-kD immunreaktivt peptid innen 3 timer etter skaden (i den aller første urinproduksjonen etter iskemi), som vist i figur 7. Til sammenligning var serumkreatinin i denne modellen av iskemisk skade ble forhøyet først etter 24 timers reperfusjon (ikke vist). Nok en gang var NGAL påviselig i 1 l ubehandlet urin og vedvarte i hele den undersøkte varigheten (24 timer med reperfusjon).

Figur 7. Tidlig påvisning av NGAL-protein i urinen hos rotter med iskemisk ARF. Representativt Western blot av ubehandlede urinprøver (1 til 2 l per bane, normalisert for kreatinininnhold) oppnådd ved reperfusjonsperioder som vist (timer), etter 30 minutter med bilateral nyrearterieklemming hos rotter. Molekylvektsmarkører vises til venstre. Disse dyrene viste en signifikant økning i serumkreatinin ved 24 timers reflow.

NGAL mRNA induseres i dyrkede humane proksimale tubuliceller etter tidlig mild iskemi

For å bekrefte opprinnelsen til NGAL fra iskemiske proksimale tubuliceller, modifiserte vi tidligere beskrevne protokoller for in vitro iskemi ved ATP-utarming i dyrkede humane proksimale tubuliceller (RPTEC). Inkubasjon er 1- m antimycin resulterte i en mild delvis ATP-depletering til ca. 83 pluss 3 prosent av kontrollen innen 1 time, med en mer gradvis reduksjon til ca. 75 pluss - 3 prosent av kontrollen med 6 timer ( gjennomsnittlig SD fra fire eksperimenter). Ingen morfologiske konsekvenser av denne milde ATP-uttømmingen ble observert. NGAL mRNA var nettopp påviselig i hvilende celler. Imidlertid, etter delvis ATP-uttømming, var rask og varighetsavhengig induksjon av NGAL mRNA tydelig ved RT-PCR, som vist i figur 8.

NGAL-protein oppdages enkelt i medium etter tidlig iskemi in vitro

Vi undersøkte deretter NGAL-proteinuttrykk i RPTEC-celler og kulturmediet etter mild ATP-utarming. NGAL-protein var påvisbart i kontroll-RPTEC-celler, og dets uttrykk økte etter ATP-utarming på en varighetsavhengig måte, som vist i figur 8. Det ble ikke funnet noe NGAL-immunreaktivt protein i kulturmediet fra kontrollceller, men NGAL var lett påviselig innen 1 time med mild ATP-deplesjon (figur 8). Ytterligere økninger i NGAL-proteinoverflod ble notert relatert til varigheten av ATP-uttømming. Disse resultatene antyder at det induserte NGAL-proteinet raskt skilles ut i mediet, analogt med det raske utseendet til NGAL i urinen etter nyreiskemi in vivo.

Figur 8. Induksjon av NGAL mRNA etter iskemi in vitro. (Topp) Representant RT-PCR med primere for human NGAL, ved bruk av RNA ekstrahert fra renale proksimale tubulære epitelceller (RPTEC) celler etter ulike perioder med delvis ATP-utarming som vist (timer). Bane M inneholder en 100-bp DNA-stige. (Middels) Foldeøkning i NGAL mRNA-ekspresjon på forskjellige tidspunkter fra kontroll (0), normalisert for glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenaseekspresjon. Verdiene som vises er gjennomsnittlig SD fra tre eksperimenter på hvert tidspunkt. (Bunn) Representativ Western blot med RPTEC-prøver etter ulike perioder med delvis ATP-utarming som vist (timer), oppnådd fra like mengder cellepelleter (Pel) eller kulturmediet (Sup), probet med et polyklonalt antistoff mot NGAL. Molekylvektmarkører er til venstre. Figuren er representativ for tre separate eksperimenter.

NGAL-protein oppdages enkelt i urinen tidlig etter induksjon av cisplatin-indusert nefrotoksisitet

Vi ønsket deretter å finne ut om NGAL kan påvises i urinen etter andre former for tubuluscelleskade. I en etablert musemodell for cisplatin nefrotoksisitet ble NGAL lett påvist i urinen innen 1 d etter cisplatinadministrering (figur 9). I motsetning til dette var 2-mikroglobulin i urin knapt påviselig etter 2 dager og kunne ikke påvises pålitelig før dag 4 til 5 etter cisplatin. Tilsvarende var økt NAG-utskillelse i urin ikke tydelig før dag 4 og 5 etter cisplatinadministrasjon (figur 9).

Figur 9. Tidlig påvisning av NGAL-protein i urinen hos mus med cisplatin-indusert skade. (A) Representative Western blots på ubehandlede urinprøver (1 til 2 l per bane, normalisert for kreatinininnhold) oppnådd på dager som vist etter cisplatinadministrering, sondert med antistoff mot 2-mikroglobulin eller NGAL. Molekylvektsmarkører vises til venstre. (B) Urin NAG-bestemmelser på forskjellige dager etter cisplatinadministrasjon (n 4). Verdier er gjennomsnitt pluss -SD. *P 0.05 versus dag 0.

Diskusjon

Vi brukte en transkriptomomfattende avhørsstrategi for å identifisere nyregener som induseres tidlig etter nyreiskemi, hvis proteinprodukter kan tjene som nye biomarkører for ARF. Vi identifiserte syv gener som er oppregulert 10-fold, hvorav ett (Cyr61) nylig har blitt rapportert å være indusert etter nyreiskemi (8). Uventet var induksjonen av de andre seks transkripsjonene ny for ARF-feltet. I denne studien valgte vi å karakterisere ytterligere ett av disse tidligere ukjente genene, nemlig NGAL.

NGAL tilhører lipocalin-superfamilien av - 20 strukturelt beslektede utskilte proteiner som antas å transportere en rekke ligander innenfor en tønnebeger (23). Human NGAL ble opprinnelig identifisert som et 25-kD-protein kovalent bundet til gelatinase fra humane nøytrofiler, hvor det representerer et av de nøytrofile sekundære granulatproteinene (24,25). Molekylære kloningsstudier har avslørt humant NGAL å være lik muse-24p3-genet først identifisert i primærkulturer av musenyrer som ble indusert til å formere seg (26). NGAL uttrykkes ved svært lave nivåer i annet humant vev, inkludert nyre, luftrør, lunger, mage og tykktarm (27). NGAL-ekspresjon er markert indusert i stimulert epitel. For eksempel er det oppregulert i tykktarmsepitelceller i områder med betennelse eller neoplasi, men er fraværende fra intervenerende uinvolverte områder eller innenfor metastatiske lesjoner (28). NGAL-konsentrasjoner er forhøyede i serum hos pasienter med akutte bakterielle infeksjoner (29), oppspytt hos personer med astma eller kronisk obstruktiv lungesykdom (30), og bronkialvæsken fra emfysematøs lunge (31). I alle disse tilfellene postuleres NGAL-induksjon å være et resultat av interaksjoner mellom inflammatoriske celler og epitelslimhinnen, med oppregulering av NGAL-uttrykk som er tydelig i både nøytrofiler og epitel (28–32).

Oppregulering av NGAL i den modne nyren er hittil ikke beskrevet. Flere bevis fra studien vår tyder på at den detekterte NGAL-induksjonen representerer en ny iboende respons fra de proksimale tubuluscellene i nyrene på iskemisk skade og ikke bare er avledet fra aktiverte nøytrofiler. For det første er responsen ekstremt rask, med NGAL som vises i urinen innen 2 timer etter skaden (i den aller første urinproduksjonen etter nyrearterieokklusjon), og nyre-nøytrofilakkumulering i denne modellen av iskemisk ARF blir vanligvis først registrert etter 4 timer. etter skade (33–35). For det andre er de tidsmessige mønstrene for NGAL-induksjon og nøytrofilakkumulering divergerende. NGAL mRNA og proteinekspresjon ble maksimalt notert etter 12 timers reflow, mens nøytrofilakkumulering topper etter 24 timer (33–35), da NGAL-ekspresjonen har avtatt betydelig. For det tredje var ingen NGAL-uttrykkende nøytrofiler påviselige ved immunfluorescens i de undersøkte nyreprøvene (figur 4). Fjerde og mest overbevisende, NGAL mRNA og proteininduksjon ble dokumentert å forekomme i dyrkede humane proksimale tubuliceller etter in vitro iskemi, med NGAL utskilt i kulturmediet innen 1 time etter ATP-utarming, i et system der nøytrofiler er absolutt fraværende. Imidlertid tillater ikke våre in vivo-studier oss helt å utelukke noe bidrag fra å infiltrere aktiverte nøytrofiler til den observerte NGAL-oppreguleringen. Det er faktisk mulig at oppregulering av NGAL i nyretubuliceller kan induseres av lokal frigjøring av cytokiner fra nøytrofiler fanget i mikrosirkulasjonen tidlig etter iskemisk skade.

Hva er en cistanche? Cistanchekan behandlenyreskade

En tilstrekkelig forklaring på induksjonen av NGAL ved stimulert epitel har manglet, og hvorvidt NGAL er beskyttende eller nærliggende skade eller til og med en uskyldig tilskuer er fortsatt uklart. Nyere bevis tyder på at, i det minste i en undergruppe av celletyper, kan NGAL representere et proapoptotisk molekyl (36–38). I den muse pro-B-lymfocytiske cellelinjen resulterte cytokinuttak i en markert induksjon av NGAL så vel som utbruddet av apoptose (36,37). NGAL har også vært knyttet til apoptose i reproduktive vev. Epitelceller i den involuterende brystkjertelen og livmoren uttrykker høye nivåer av NGAL, tidsmessig sammenfallende med en periode med maksimal apoptose (38). Det er sannsynlig at NGAL regulerer en undergruppe av cellepopulasjoner ved å indusere apoptose. Stimulert epitel kan oppregulere NGAL for å indusere apoptose av infiltrerende nøytrofiler, og dermed tillate de fastboende cellene å overleve ødeleggelsene av den inflammatoriske responsen. Alternativt kan epitelceller bruke denne mekanismen for å regulere sin egen død. Imidlertid er det interessant å merke seg i våre studier at induksjon av NGAL etter den tidlige nyreiskemi-reperfusjonsskaden skjer hovedsakelig i proksimale tubuliceller som ikke viste TUNEL-positive kjerner.

Andre nyere studier har avslørt at NGAL forbedrer epitelfenotypen. NGAL uttrykkes av den penetrerende ureteriske knoppen og utløser nefrogenese ved å stimulere omdannelsen av mesenkymale celler til nyreepitel (21). Et annet lipokalin, glykodelin, har vist seg å indusere en epitelfenotype når det uttrykkes i humane brystkarsinomceller (40). Disse funnene er spesielt relevante for den modne nyren, der en av de veldokumenterte responsene på iskemisk skade er det bemerkelsesverdige utseendet til dedifferensierte epitelceller som ligger langs de proksimale tubuli (41). Et viktig aspekt ved nyregenerering og reparasjon etter iskemisk skade innebærer gjenervervelse av epitelfenotypen, en prosess som rekapitulerer flere aspekter ved normal utvikling (42). Dette antyder at NGAL kan uttrykkes av den skadede tubulus for å indusere re-epitelisering. Støtte for denne oppfatningen stammer fra den nylige identifiseringen av NGAL som et jerntransporterende protein som er komplementært til transferrin under nefrogenese (21). Det er velkjent at tilførsel av jern til cellene er avgjørende for cellevekst og utvikling, og dette er antagelig kritisk for postiskemisk nyregenerering akkurat som det er under ontogeni. Fordi NGAL ser ut til å binde og transportere jern (21), er det også sannsynlig at NGAL kan tjene som en vask for jern som avgis fra skadede proksimale tubuli-epitelceller. Fordi NGAL kan endocyteres av den proksimale tubuli (K. Mori og J. Barasch, upubliserte observasjoner), kan proteinet potensielt resirkulere jern til levedyktige celler. Dette kan stimulere vekst og utvikling, samt fjerne jern, et reaktivt molekyl, fra stedet for vevsskade, og dermed begrense jernmediert cytotoksisitet. Resultatene våre viser samlokalisering av NGAL i PCNA-positive regenererende og prolifererende tubuliceller gir ytterligere støtte til denne hypotesen.

En viktig implikasjon av funnene våre gjelder muligheten for at NGAL er en ny urinbiomarkør for en iskemisknyreskadesom kan sammenlignes med andre biomarkører som er beskrevet. Det kanskje best studerte eksemplet er nyreskademolekyl-1 (KIM-1), et antatt adhesjonsmolekyl involvert i nyregenerering (43,44). I en rottemodell av iskemi-reperfusjonsskade, ble KIM-1 funnet å være oppregulert 24 til 48 timer etter den første fornærmelsen, noe som gjorde den til en pålitelig, men noe sen markør for skade på tubulær celle. Nyere elegante studier har vist at KIM-1 kan påvises i nyrebiopsi og urin hos pasienter med iskemisk akutt tubulær nekrose (45). Imidlertid ble denne påvisningen dokumentert hos pasienter med etablert iskemisk nyreskade, og nytten av urin-KIM-1-måling for påvisning av tidlig subklinisk skade har så langt ikke blitt validert. I et annet nylig eksempel ble Cyr61 funnet å være et utskilt cysteinrikt protein som kan påvises i urinen 3 til 6 timer etter iskemisk nyreskade (8). Imidlertid krevde denne påvisningen et bioaffinitetsrensetrinn med heparin-Sepharose-kuler, og selv etter slik rensing var flere kryssreagerende peptider tydelige. I motsetning til dette viser studien vår at NGAL enkelt og raskt ble oppdaget som relativt rene immunreaktive peptider i Western blots med så lite som 1 l av den aller første ubehandlede urinproduksjonen etter nyreiskemi hos både mus og rotter. I tillegg var NGAL i urinen tydelig selv etter svært mild "subklinisk" nyreiskemi, til tross for normale serumkreatininnivåer. I tillegg gikk urin-NGAL-deteksjon langt før opptredenen av tradisjonelle markører i urinen, inkludert 2- mikroglobulin og NAG.

Til slutt er det verdt å merke seg at NGAL også var påviselig i urinen tidlig etter cisplatinadministrasjon, på et tidspunkt da andre morfologiske og biokjemiske indikatorer fornyreskadevar fraværende. Dermed kan oppreguleringen og urinutskillelsen av NGAL representere en rask respons av nyretubuliceller på en rekke fornærmelser, og påvisningen av NGAL i urinen kan representere et bredt anvendelig ikke-invasivt klinisk verktøy for tidlig diagnose av tubuluscelleskade.

Oppsummert indikerer våre data at NGAL representerer en ny, sensitiv, en ikke-invasiv urinbiomarkør for nyreiskemi. Det vil være viktig i fremtidig translasjonsarbeid å undersøke uttrykket av NGAL i urinen hos pasienter med milde og tidlige former for iskemisknyreskade. Det er å håpe at en slik tidlig oppdagelse kan gjøre det mulig for klinikere å sette i gang rettidig intervensjonsinnsats i ARF, en tilstand som fortsatt er forbundet med en dyster prognose som nye terapier er desperat nødvendig for. Videre er det håp om at en så rask og enkel påvisning av urin-NGAL hos pasienter med subtil, subklinisk iskemisknyreskade(f.eks. levende-relaterte nyretransplantasjoner, karkirurgi, kardiovaskulære hendelser) eller subklinisk nefrotoksisk skade (f.eks. bruk av kontrastmidler og aminoglykosider) vil varsle klinikeren om å sette i gang manøvrer rettet mot å forhindre progresjon til åpen ARF.

Anerkjennelser

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health/National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases til PD (DK53289, DK52612) og JB (DK55388 og DK58872).

Cistanche tubulosakan behandlenyreskade

Referanser
1. Thadani R, Pascual M, Bonventre JV: Akutt nyresvikt. N Engl J Med 334: 1448–1460, 1996
2. Star RA: Behandling av akuttnyrefeil. Kidney Int 54: 1817–1831, 1998
3. Liaño F, Pascual J: Prediktive faktorer og scoring. I: Acute Renal Failure, redigert av Molitoris BA og Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, s. 507–518
4. Molitoris BA: Overgang til terapi ved iskemisk akutt nyresvikt. J Am Soc Nephrol 14: 265–267, 2003
5. Brady HR, Brenner BM, Clarkson MR, Lieberthal W: Akutt nyresvikt. I: The Kidney, 6. utgave, redigert av Brenner BM, Philadelphia, WB Saunders, 2000, s. 1201–1262
6. Sutton TA, Molitoris BA: Mekanismer for cellulær skade ved iskemisk akutt nyresvikt. Semin Nephrol 18: 490–497, 1998
7. Sheridan AM, Bonventre JV: Cellebiologi og molekylære mekanismer for skade ved iskemisk akuttnyrefeil. Curr Opin Nephrol Hypertens 9: 327–334, 2000
8. Muramatsu Y, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PST, Craig L, Hu X, Star RA: Tidlig påvisning av cysteinrikt protein 61 (CYR61, CCN1) i urin etter nyreiskemi-reperfusjonsskade. Kidney Int 62: 1601–1610, 2002

9. Kurella M, Hsiao LL, Yishida T, Randall JD, Chow G, Sarang SS, Jensen RV, Gullans SR: DNA-mikroarray-analyse av komplekse biologiske prosesser. J Am Soc Nephrol 12: 1072–1078, 2001

10. Yoshida T, Kurelia M, Beato F, Min H, Ingelfinger JR, Stears RL, Swinford RD, Gullans SR, Tang SS: Overvåking av endringer i genuttrykk i nyreiskemi-reperfusjon hos rotte. Kidney Int 61: 1646–1654, 2002

11. Supavekin S, Zhanh W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P: Differensiell genuttrykk etter tidlig nyreiskemi/reperfusjon. Kidney Int 63: 1714–1724, 2003
12. Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, Saito T, Abe K, Saito H, Nakane PK, Nakanishi Y, Koji T: Induksjon av apoptose i iskemi-reperfusjonsmodell av musenyren: Mulig involvering av Fas. J Am Soc Nephrol 9: 620–631, 1998
13. Daemen MARC, Van de Ven MWCM, Heineman E, Buurman WA: Involvering av endogent interleukin-10 og tumornekrosefaktor - i nyreiskemi-reperfusjonsskade. Transplantation 67: 792–800, 1999
14. Kelly KJ, Plotkin Z, Dagher PC: Guanosin-tilskudd reduserer apoptose og beskytternyrefunksjon i sammenheng med iskemisk skade. J Clin Invest 108: 1291–1298, 2001
15. Burne NJ, Rabb H: Patofysiologiske bidrag av fucosyltransferaser ved nyreiskemi-reperfusjonsskade. J Immunol 169: 2648-2652, 2002
16. Megyesi J, Safirstein RL, Pris PM: Induksjon av p21WAF1/CIP/SD1 i nyretubuliceller påvirker forløpet av cisplatin-indusert akuttnyrefeil. J Clin Invest 101: 777–782, 1998
17. Shiraishi F, Curtis LM, Truong L, Poss K, Visner GA, Madsen K, Nick HS, Agarwal A: Heme oksygenase-1-genablasjon eller ekspresjon modulerer cisplatin-indusert renal tubulær apoptose. Am J Physiol 278: F726–F736, 2000
18. Ramesh G, Reeves WB: TNF- formidler kjemokin- og cytokinekspresjon ognyreskadeved cisplatin nefrotoksisitet. J Clin Invest 110: 835–842, 2002
19. Feldenberg LR, Thevananther S, del Rio M, De Leon M, Devarajan P: Delvis ATP-utarming induserer Fas- og caspase-mediert apoptose i MDCK-celler. Am J Physiol 276: F837–F846, 1999
20. Devarajan P, De Leon M, Talasazan F, Schoenfeld AR, Davidowitz EJ, Burk RD: von Hippel-Lindau-genproduktet hemmer nyrecelleapoptose via Bcl-2-avhengige veier. J Biol Chem 276: 40599-40605, 2001
21. Yang J, Goetz D, Li JY, Wand W, Mori K, Setlik D, Du T, ErdjumentBromage H, Tempst P, Strong R, Barasch J: En jernleveringsvei formidlet av et lipocalin. Mol Cell 10: 1045–1056, 2002
22. Molitoris BA, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Zager RA, Nath KA, Goligorsky MS: Akutt nyresvikt II. Eksperimentelle modeller for akutt nyresvikt: Ufullkommen, men uunnværlig. Am J Physiol 278: F1–F12, 2000
23. Flower DR, North AC, Sansom CE: The lipocalin protein family: strukturell og sekvensoversikt. Biochim Biophys Acta 1482: 9–24, 2000
24. Kjeldsen L, Cowland JB, Borregaard N: Human neutrofil gelatinase-assosiert lipokalin og homologe proteiner i rotte og mus. Biochim Biophys Acta 1482: 272–283, 2000
25. Xu S, Venge P: Lipocalins som biokjemiske markører for sykdom. Biochim Biophys Acta 1482: 298–307, 2000
26. Hraba-Renevey S, Turler H, Kress M, Salomon C, Weil R: SV40-indusert ekspresjon av musegen 24p3 ​​involverer en posttranskripsjonell mekanisme. Onkogen 4: 601–608, 1989
27. Cowland JB, Borregaard N: Molekylær karakterisering og mønster av vevsekspresjon av genet for nøytrofil gelatinase-assosiert lipokalin fra mennesker. Genomics 45: 17–23, 1997
28. Nielson BS, Borregaard N, Bundgaard JR, Timshel S, Sehested M, Kjeldsen L: Induction of NGAL-synthesis in epithelial cells of human colorectal neoplasia and inflammatory bowel diseases. Gut 38: 414–420, 1996
29. Xu SY, Pauksen K, Venge P: Serummålinger av humant nøytrofilt lipokalin (HNL) skiller mellom akutte bakterielle og virusinfeksjoner. Scand J Clin Lab Invest 55: 125–131, 1995
30. Keatings VM, Barnes PJ: Granulocyttaktiveringsmarkører i indusert sputum i sammenligning mellom kronisk obstruktiv lungesykdom, astma og normale individer. Am J Respir Crit Care Med 155: 449–453, 1997
31. Betsuyaky T, Nishimura M, Takeyabu K, Tanino M, Venge P, Xu S, Kawakami Y: Nøytrofile granulatproteiner i bronkoalveolær skyllevæske fra personer med subklinisk emfysem. Am J Respir Crit Care Med 159: 1985–1991, 1999
32. Carlson M, Raab Y, Severus L, Xu S, Hallgren R, Venge P: Humant nøytrofilt lipokalin er en unik markør for nøytrofil betennelse ved ulcerøs kolitt og proktitt. Gut 50: 501–506, 2002
33. Chiao H, Kohda Y, McLeroy P, Craig L, Housing I, Star RA: -Melanocyttstimulerende hormon beskytter motnyreskadeetter iskemi hos mus og rotter. J Clin Invest 99: 1165–1172, 1997
34. Rabb H, Ramirez G, Saba SR, Reynolds D, Xu J, Flavell R, Antonia S: Renal iskemisk reperfusjonsskade i L-selektin-mangelfulle mus. Am J Physiol 271: F408–F13, 1996
35. Rabb H, Star R: Inflammatorisk respons og dens konsekvenser ved akuttnyrefeil. I: Acute Renal Failure, redigert av Molitoris BA, og Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, s. 89–100
36. Devireddy LR, Teodoro JG, Richard FA, Green MR: Induksjon av apoptose av et utskilt lipokalin som er transkripsjonelt regulert av IL-3-deprivasjon. Science 293: 829–834, 2001
37. Persengiev SP, Devireddy LR, Green MR: Hemming av apoptose av ATFx: En ny rolle for et medlem av ATF/CREB-familien av pattedyrs bZIP-transkripsjonsfaktorer. Genes Dev 16: 1806–1814, 2002
38. Ryon J, Bendickson L, Nilsen-Hamilton M: Høyt uttrykk i involuterende reproduktive vev av uterocalin/24p3, et lipocalin og akuttfaseprotein. Biochem J 367: 271-277, 2002
39. Slettet i bevis.
40. Kamarainen M, Seppala M, Virtanen I, Andersson LC: Uttrykk av glykodelin i MCF-7 brystkreftceller induserer differensiering til det organiserte acinære epitelet. Lab Invest 77: 565–573, 1997
41. Witzgall R, Brown D, Schwarz C, Bonventre JV: Lokalisering av prolifererende cellekjerneantigen, vimentin, c-fos og clusterin i den postiskemiske nyren: Bevis for en heterogen genetisk respons blant nefronsegmenter og en stor pool av mitotisk aktive og dedifferensierte celler. J Clin Invest 93: 2175–2188, 1994
42. Hammerman MR: Rekapitulering av fylogeni ved ontogeni i nefrologi. Kidney Int 57: 742–755, 2000
43. Ichimura T, Bonventre JV, Bailly V, Wei H, Hession CA, Cate RL, Sanicola M: Nyreskademolekyl-1 (KIM-1), et antatt epitelcelleadhesjonsmolekyl som inneholder et nytt immunglobulin domene, er oppregulert i nyreceller etter skade. J Biol Chem 271: 4135-4142, 1998
44. Bailly V, Zhang Z, Meier W, Cate R, Sanicola M, Bonventre JV: Shedding of kidney injury molecule-1, et antatt adhesjonsprotein involvert i nyregenerering. J Biol Chem 277: 39739–39748, 2002
45. Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadani R, Bonventre JV: Nyreskademolekyl-1 (KIM-1): En ny biomarkør for human nyreproksimal tubuliskade. Kidney Int 62: 237–244, 2002