Identifikasjon av sitoglusid som et potensielt hudpigmenteringsreduserende middel gjennom nettverksfarmakologi

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo, 1 Hongliang Zeng, 2 Chuhan Fu, 1 Jinhua Huang, 1 Jianyun Lu, 1 Yibo Hu, 1Ying Zhou, 1 Liping Luo, 1 Yushan Zhang, 1 Lan Zhang, 1 Jing Chen, 1 og Qinghai Zeng 1

Mange tradisjonelle kinesiske medisiner (TCMs) medhudblekingegenskaper har blitt registrert i Ben-Cao-Gang-Mu og infolks resepter, og noe litteratur bekrefter at deres ekstrakter har potensial til å hemmepigmentering. Imidlertid har ikke-systematiske studier identifisert de spesifikke reguleringsmekanismene til de potensielle aktive ingrediensene. Målet med denne studien var å screene ingrediensene i TCM som hemmer hudenpigmenteringgjennom et nettverksfarmakologisystem og for å utforske underliggende mekanismer. Vi identifiserte 148 potensielle aktive ingredienser fra 14 TCM-er, og basert på gjennomsnittlig "grad" av de topologiske parameterne, de fem beste TCM-ene (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones og Paeoniae Radix Alba) var mest sannsynlig å forårsakehudblekinggjennom anti-inflammatoriske prosesser ble valgt. Sitoglusid, den vanligste ingrediensen i de fem beste TCM-ene, hemmer melanogenese i humane melanomceller (MNT1) og murine melanomceller (B16F0) og reduserer hudenpigmenteringi sebrafisk. Videre viste mekanistisk forskning at sitoglusid er i stand til å nedreguleretyrosinase(TYR) uttrykk ved å hemme ERK- og p38-banene og hemme TYR-aktivitet. Disse resultatene viser at nettverksfarmakologi er et effektivt verktøy for oppdagelsen av naturlige forbindelser med hudblekende egenskaper og bestemmelse av deres mulige mekanismer. Sitogluside er en ny, hudblekende aktiv ingrediens med doble regulatoriske effekter som hemmerTYRuttrykk og aktivitet.

Klikk for åCistanche DHT ekstrakt for bleking av huden

Introduksjon

Melanin bestemmer ikke bare fargen på menneskelig hud, øyne og hår, men spiller også en nøkkelrolle i kamuflasje, mimikk, sosial kommunikasjon og beskyttelse mot ultrafiolette stråler. Men når melanin er overprodusert og unormalt fordelt i epidermis, forårsaker det en variasjon av tilstander, som fregner og melasma, som kan påvirke ens oppfattede skjønnhet og sosiale selvtillit negativt [1]. Melanin er sluttproduktet av L-tyrosin etter flere trinn av enzymatiske reaksjoner og syntetiseres i melanocyttmelanosomer [2]. I huden er melanocytter lokalisert i basallaget av epidermis og kan produsere og overføre modne melanosomer til keratinocytter, og dermed forårsake hudpigmentering [3]. TYRer det viktigste hastighetsbegrensende enzymet i melaninproduksjonen [4], og mikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor (MITF) er den viktigste transkripsjonsfaktoren som regulerer det transkripsjonelle uttrykket av TYR [5].

Nylig har studier funnet at inflammatoriske responser spiller viktige roller i reguleringen av melanogenese [6]. For eksempel kan IL-18, produsert av Langerhans-celler, dendrittiske celler og keratinocytter i epidermis, oppregulere uttrykkene av TRP{{2 }} (tyrosinase-relatert protein 1) og TRP-2 (tyrosinase-relatert protein 2) ved å aktivere thep38/MAPK (mitogen-aktivert proteinkinase) og PKA (proteinkinase A)-veier, og dermed fremme melanogenese[7, 8 ]. TNF- nedregulerer B16-melaninproduksjonen hovedsakelig ved å aktivere NF-KB [9]. PGe2 (prostaglandin e2), som utskilles av fibroblaster og keratinocytter, har vist seg å stimulere differensieringen av dendrittiske celler og initiere TYR-aktivitet i melanocytter gjennom cAMP (syklisk adenosinmonofosfat) og Plc (fosfolipase c) signalveier [10]. PIH (postinflammatorisk hyperpigmentering) er en type reaktiv hudmelanisering [11]. Ulike hudsykdommer, traumer eller kosmetisk kirurgi fører ofte tilpigmenteringav det berørte området, spesielt hos fargede personer [12]. Pasienter med PIH bærer vanligvis enormt psykisk stress, som i alvorlige tilfeller påvirker livskvaliteten deres negativt. Derfor brukes visse medisiner som regulerer betennelse for å behandle PIH og andre sykdommer som forårsaker hyperpigmentering. For eksempel ble resveratrol, som reduserte den inflammatoriske skaden i HaCaT-celler [13], funnet å hemme melaninsyntesen gjennom ekstracellulær signalregulering av kinase1/2 og signalering av fosfoinositid 3-kinase/Akt [14].

Blekingmidler, som hydrokinon (HQ) og vitamin C, brukes tradisjonelt for å behandle pigmentering [15]. HQ er en hydroksyfenol med en kraftig hemmende effekt på melanogenese. Men på grunn av ulike bivirkninger som irriterende eller allergisk kontakteksem, misfarging av negler og nedsatt sårheling, er bruken av HQ begrenset[16, 17]. Vitamin C hemmerTYRved å interagere med kobberioner på TYR-aktive steder, og dermed redusere melanogenese. Vitamin C er imidlertid ustabilt i ferdige produkter. I tillegg, hvis konsentrasjonen av vitamin C er høyere enn 20 prosent, kan det forårsake hudirritasjon [18]. Derfor er det stor etterspørsel etter naturlige ingredienser fra et bredt spekter av kilder som er trygge, effektive, svært stabile og enkle å lagre.

Nylig har flere TCM-ingredienser vist seg å være effektive i å hemme hudenpigmentering, slik som apigenin og paeoniflorin [19–21]. TCM-ene med blekingsaktivitet beskrevet i Ben-Cao-Gang-Mu er mye brukt som hemmelige oppskrifter i Kina, og i dag er det bekreftet at de har effekten av å hemme pigmentering. For eksempel forårsaker ekstraktet av Hedysarum multijugum Maxim (rhizom av Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) hudbleking ved å hemme ERK-banen [22]. Det tørre ekstraktet av Typhonii Rhizoma (rhizomet til Sauromatum gigan-teum (Engl.) Cusimano og Hett.) kan effektivt hemmetyrosinaseaktivitet in vitro [23]. Og evidensbasert medisin har også bekreftet at ekstraktet av SapindiMukorossi Semen (frukten av Sapindus mukorossi Gaertn.), som hemmer tyrosinaseaktivitet, har potensial til å bli brukt som et medikament og kosmetisk tilsetningsstoff [24]. Noen tradisjonelle folkeresepter, selv om de ikke er satt sammen i et kompendium, er også mye brukt. San-Bai-Tang (SBT) er et typisk eksempel. Ye et al. demonstrerte at SBT kunne redusere melaninproduksjonen ved å hemme p38/MAPK-signalveien og TYR-aktiviteten [25]. Andre TCM beskrevet i enkelte resepter har også vist seg å hableking av hudeneffekter. Coicis Semen (frøet av Coix AquaticaRoxb.)-ekstrakt hemmer melaninproduksjonen ved å nedregulere MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 [26]. Dessuten en celleanalyse avTYRviste at Ampelopsis japonica (rhizomet til Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) hemmet aktiviteten til sopp-TYR med mer enn 50 prosent [27]. Whitening TCMs registrert i disse eldgamle reseptene har vist seg å være effektive av moderne eksperimentelle teknikker, men de fleste av dem er verifisert i form av ekstrakter, og de aktive ingrediensene som virker er ikke klare. Dette vekket vår interesse for de aktive ingrediensene i TCMs med blekingseffekter registrert. i gamle resepter.

Dessuten har TCM-er eller resepter komplekse ingredienser, forskjellige virkemåter og ukjente aktive ingredienser. I tillegg har inkonsistensen av faktorer som kvaliteten på råvarer, prosesseringsmetoder, tilberedningsteknikker, kompatibilitet av ingredienser brukt i sammensetningen og doseringsformer en større innvirkning på effekten av TCM [19, 28]. Derfor er bruken av visse TCM-er medhudblekingeffektene er begrenset. Det haster derfor å identifisere aktive ingredienser med potensielle blekende effekter på huden, gjennom systematisk screening for å sikre sikkerheten, effekten og stabiliteten til disse ingrediensene.

De siste årene har anvendelsen av systembiologi innen TCM gjort store fremskritt. Nettverksfarmakologien til TCM er en ny tverrdisiplin som kombinerer farmakologien til TCM med nettverksvitenskap, systembiologi, beregningsvitenskap og bioinformatikk [29]. Den forstår fullt ut kompleksiteten mellom legemidler, sykdommer og biologiske systemer fra perspektivet til "kompleks-protein/gen-sykdom"-nettverket [30]. Nettverksfarmakologi er et effektivt og systematisk verktøy for å studere den farmakologiske virkningen, mekanismen, sikkerheten og andre aspekter ved urtemedisin, spesielt TCM, og gir verdifull innsikt for nåværende medikamentoppdagelse [31, 32].

ingredienser for bleking av huden

2. Materialer og metoder

2.1. Nettverksfarmakologisk prosess

2.1.1. Databasebygging for kjemiske ingredienser

Et flytskjema over det studerte eksperimentelle programmet er avbildet i figur 1. TCM-ene med anti-pigmenteringseffekter, beskrevet i Ben-Cao-Gang-Mu og i folkeresepter, ble brukt til farmakologisk nettverksanalyse. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones og Sapindi MukorossiSemen, beskrevet i Ben-Cao-Gang-Mu, harblekingog gule senkende egenskaper og kan fjerne ansiktsflekker og føflekker. Poria cocos (Schw.) Wolf (sklerotiet til Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba og Atractylodes macrocephala Koidz (rotstokken til Atractylodes macrocephalaKoidz.) som er bestanddeler av SBT er kjent for å forbedre hudtekstur og redusere chloasmapigmentering. Andre tradisjonelt registrerte urter, som Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (rotstokken til Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (rotstokken til Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. og Hook.f. ex Franch. og Sav.), Atractylodes lancea(Thunb.) Dc. (rotstokken til Atractylodes lancea (Thunb.)DC.), Fructus Ligustri Lucidi og Coicis Semen, ble også inkludert i denne studien. På grunn av det store antallet TCM som er inkludert i denne studien, vil flere databasescreeninger for kinesisk medisin forårsake databehandlingsforvirring. Vi bruker kun databasen Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP), en mer vanlig database, for oppfølgingsscreening. De kjemiske ingrediensene i disse TCM-ene ble søkt i TCMSP (oppdatert 24. april,2020) [33]. Medikamentlikhet (DL) og oral biotilgjengelighet (OB) er ofte brukte screeningsparametere. Aktuelle eller systemiske medisiner er vanlige behandlinger for hudpigmenteringssykdommer; derfor brukte vi bare DL som screeningkriteriet. Utmerkede komplekser med DL > 0:18 ble valgt for å øke treffraten til medikamentkandidater.

2.1.2. Skjæringspunktet mellom målgener for TCM og pigmenteringsassosierte gener.

Gensettet assosiert medpigmenteringble valgt basert på GeneCards-databasen (oppdatert 24. april 2020), hvorfra mål med alderssykdomsscore > 1 ble valgt. Etter hvert ble 6180 pigmentrelaterte mål identifisert. Skjæringspunktet mellom målgener til TCM og pigmenteringsassosierte gener ble illustrert ved hjelp av et Venn-diagram [34].

2.1.3. Konstruksjon av et Active Compound-Target-Pathway Network.

Aktive ingredienser og regulerte målgener ble screenet i henhold til resultatene av Venn-diagrammet. Nettverket ble konstruert ved bruk av Cytoscape-programvare [35] og ble brukt til å indikere forholdet mellom de aktive forbindelsene til TCM og målgenene tilpigmenteringHvert målgen regulert av en aktiv ingrediens i aTCM ble ansett som én "grad". De gjennomsnittlige "grad"-topologiske parameterne for hver TCM ble brukt for å evaluere viktigheten av de valgte TCM-ene. Forbindelsene ble rangert, og de fem beste TCM-ene ble valgt for nøkkelanalyser. Videre ble detaljert informasjon om de potensielle aktive ingrediensene rapportert for å regulere pigmentering analysert.

2.1.4. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome (KEGG) berikelsesanalyse av målgener regulert av potensielt effektive TCM-er.

Målgener regulert av de fem beste TCM-ene ble valgt for å bestemme KEGG-målveier og utforske de mulige mekanismene til potensielt effektive ingredienser i disse TCM-ene motpigmentering.DAVID bioinformatikkressurser 6.8 ble brukt til å analysere berikelsen av KEGG-målveier. Gensymbolene for de potensielle målene til de effektive aktive ingrediensene ble lastet opp. De oppnådde genidentifikatorene ble deretter lastet ned og lagt inn i KOBAS3. Genet som justerte p-verdier mindre enn 0.05 ble valgt.

2.1.5. Molekylær dokkingsimulering.

2D-strukturene til sitoglusid, arbutin, nikotinamid, HQ, kojinsyre og askorbinsyre ble hentet fra PubChem-databasen. De mekaniske strukturene til de små molekylene ble optimalisert ved hjelp av ChemBio3D Ultra 14.0. 3D-krystallstrukturen til soppTYR(PDB ID: 2Y9X, dokkingkoordinater: X =-8:87, Y=−30:74, og Z=−41:52) ble hentet fra proteindatabanken ( PDB) database [36]. 3D-krystallstrukturene til seks membranreseptorer (opioid u-reseptor, PDB ID: 4DKI; melanokortin 1-reseptor, PDB ID: 2L1J; endotelin B-reseptor, PDB ID: 5GLI; adrenerg reseptor, PDB ID: 4GBR; prostaglandinreseptor: 6D2 ID ; stamcellefaktorreseptor, PDB ID: 2EC8) ble hentet fra PDB-databasen. Proteinstrukturene ble fremstilt ved å bruke AutoDock Tools ved å fjerne vannmolekyler, tilsette hydrogen og lage nullordensbindinger til metaller og disulfidbindinger. Til slutt ble molekylære dokkingsimuleringer utført ved bruk av AutoDock Vina 1.1.2 [37], og resultatene ble analysert ved bruk av PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Eksperimentell validering

2.2.1. Kjemikalier og antistoffer.

Sitoglusid (renhet større enn eller lik 98 prosent) ble kjøpt fra ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Dimetylsulfoksid (DMSO) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Nøytral paraformaldehyd (4 prosent) ble kjøpt fra Biosharp (Hefei, Kina). Kojic acid, Fontana-Masson Stain Kit, natriumdeoxycholate og L DOPA ble kjøpt fra Solarbio (Beijing, Kina). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) ble kjøpt fra Gibco (#C11995500BT, Gibco). Fetalt bovint serum (FBS) og Cell Counting Kit-8 (CCK8) ble kjøpt fra BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). PMA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat, ERK/MAPK-aktivatoren) ble kjøpt fra APExBIO (#N2060, APExBIO). Anisomycin (p38/MAPK-aktivatoren) ble kjøpt fra MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). Primære antistoffer mot ras-relatert protein Rab-27A (RAB27A) (#69295,CST), ekstracellulær signalregulert kinase (ERK) (#4695,CST), p-ERK (#4370, CST), c- Jun N-terminal kinase JNK(#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), cAMP-responselementbindende proteinCREB ( #9107, CST), og p-CREB (#9198, CST) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology. Primære antistoffer mot TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058,Novusbio), MITF (STJ94134, St. John's Laboratory),TYR(BS1484, Bioworld), og GAPDH (#AP0066, Bioworld) ble kjøpt fra henholdsvis Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory og Bioworld.

2.2.2. Cellekultur og behandling.

MNT1 og B16F0, som er rike på melanosomer, er mye brukt for å studere melanogenese [38]. Følgelig ble disse to cellelinjene valgt for etterfølgende eksperimenter. MNT1- og B16F0-celler ble dyrket i 20 prosent eller 10 prosent føtalt bovint serum (BiologicalIndustries, Israel) og 1 prosent penicillin-streptomycin (Gibco) i DMEM. Alle cellene ble dyrket i en våt inkubator ved 37 grader og 5 prosent CO2. Sitoglusid ble oppløst i DMSO, og den endelige konsentrasjonen av DMSO var<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Dyrking og behandling av sebrafisk.

Sebrafiskembryoer og kulturmedium ble kjøpt fra EzeRinka Biotech (Nanjing, Kina). Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av den etiske komiteen ved Third Xiangya Hospital ved Central South University (nr. 2021-S137). Den første dagen etter klekking ble sebrafisken oppdrettet i en 12-brønnplate (10 perwell), beskyttet mot lys og dyrket ved 37 grader. Sebrafisken ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sitoglusid, og fotografier ble tatt med et invertert mikroskop med 24 timers mellomrom for å registrere endringene i melanin i halen til sebrafisken. Etter at bildene ble tatt, ble sitoglusidløsninger med forskjellige konsentrasjoner lest og registrert kontinuerlig i en uke.

2.2.4. Cellelevedyktighet.

Cellelevedyktighet ble vurdert ved å bruke en CCK8.MNT1 og B16F0-celler ble sådd ut i 96-brønnplater med en tetthet på 2000 celler/brønn eller 500 celler/brønn. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sitoglusid (25, 50, 100, 200, 400, 600 og 800 μM). Etter 24 timer eller 48 timer ble 10 μL CCK8-reagens tilsatt til hver brønn, og cellene ble inkubert ved 37 grader i 1 time. Når fargen på mediet ble oransje, ble kulturen avsluttet, og en mikroplateleser (PerkinElmer EnVision Xcite, UK) ble brukt for å måle absorbansen ved 490 nm.

2.2.5. Fontana-Masson Melaninfarging.

Celler ble dyrket i en 6-brønnplate og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sitoglusid i 2 dager, og kojinsyre som en positiv kontroll ble tilsatt ved 200 μM. Cellene ble deretter plassert i 4 prosent paraformaldehyd i 15 minutter. Etter skylling med vann ble cellene inkubert med Fontana ammoniakk-sølvløsning i 24 timer i et mørkt kammer, skylt med vann og deretter plassert i hyposulfitt i ytterligere 5 minutter. Et invertert mikroskop ble brukt for å observere melaninet.

2.2.6. Funksjonsgjenopprettingseksperiment.

PMA, som en anerkjent aktivator av ERK/MAPK [39, 40], ble testet for cytotoksisitet gjennom CCK8-eksperiment ved forskjellige konsentrasjoner (6.25,12.5, 25, 50, 100, 200, 400 og 800 ng/mL) i 24 timer. Og etter at MNT1- og B16F0-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner (25, 50 og 100 ng/mL) av PMA i 2 timer, ble fosforyleringsnivået til ERK påvist ved westernblotting-eksperiment. Ved den valgte konsentrasjonen ble cellene behandlet med 0, 1, 2, 4, 6 og 8 timer for å oppdage den effektive tiden for aktivering. Etter at cellene ble behandlet med sitoglusid (200 μM) og PMA (25 ng/ml) i 48 timer (behandlet hver 8. time), ble proteinnivåene tilTYRandp-ERK ble oppdaget. Fontana-Masson melaninfarging oppdaget melanininnholdet. Anisomycin [41] er aktivatoren til p38/MAPK, hvis letekonsentrasjon er 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 og 512 nM, og de andre eksperimentelle metodene er de samme som PMA.

2.2.7. TYR aktivitetsmålinger.

Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sitoglusid i 2 dager. Etter fordøyelse og sentrifugering ble cellene talt og suspendert to ganger i fosfatbufret saltvann (PBS). Deretter ble 500 μL 0,5 prosent natriumdeoksycholatløsning tilsatt til hver prøve. Prøvene ble inkubert ved 4 grader i 10 minutter og deretter ved 37 grader i 15 minutter. 1 mL 1 prosent L-DOPA-løsning ble tilsatt, hvoretter 200 μL umiddelbart ble pipettert inn i en 96-brønnplate. Deretter ble en multimodus plateleser brukt for å måle absorbansverdiene (A0) ved 475 nm, og målingen ble gjentatt etter 30 min (A30).TYRaktivitet ble beregnet som (A{{0}}A0)/cellenummer.

2.2.8. TYR aktivitetssonde.

En nær-infrarød fluorescensprobe forTYRaktivitet basert på resorufin ble brukt for å visualisere aktivitet i levende celler, som beskrevet tidligere [42]. Kort fortalt ble MNT1- og B16F0-celler dyrket i en 6-brønnplate og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sitoglusid i 2 dager . En 10 μM fluorescensprobe ble tilsatt, og etter 4 timer ble cellene erstattet med PBS. Etter at det røde lyset var spennende, ble et fluorescerende invertert mikroskop umiddelbart brukt til å ta bilder.

2.2.9. Proteinekstraksjon og Western Blotting.

Etter at cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sitoglusid i 2 dager, ble det totale cellulære proteinet ekstrahert ved å bruke RIPA Lysis Buffer (Thermo Fisher) og proteasehemmer og fosfatasehemmer cocktailer (Roche). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke en BCA-proteinanalyse (KeyGEN Biotec). Etter blokkering med 1 prosent BSA, de primære antistoffene motTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A,CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38 og p-p38 ble inkubert med membranene over natten ved 4 grader ved 1:1000 og GAPDH ved 1:3000 Membranene ble vasket med TBS-T og inkubert med geit-anti-kanin sekundært antistoff ved 1:3000 i 1 time. Det bindende antistoffet ble påvist ved elektrokjemiluminescens (ECL).

2.2.10. Statistisk analyse.

SPSS22.0-programvare ble brukt for statistisk analyse, og Students t-test eller enveis variansanalyse (ANOVA) ble brukt for flere gruppesammenlikninger. Mann-Whitney U-testen ble brukt for ikke-parametriske data. p < 0:05="" ble="" i="" alle="" tilfeller="" ansett="" som="" statistisk="" signifikant.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01="" og="" ∗p=""><>

3. Resultater

3.1. Sammensatte ingredienser av TCM.

Fjorten TCM-er, registrert i Ben-Cao-Gang-Mu og i folkeresepter, med anti-pigmenteringseffekter ble studert. Totalt 372 kinesiske medisiningredienser fra de 14 TCM-ene ble hentet fra TCMSP-databasen (tilleggstabell S1).

3.2. Målgener regulert av TCM-er og relaterte pigmenteringsgener.

I følge målprediksjonssystemet i TCMSP-databasen ble totalt 834 målgener fra de 14 TCM-ene oppnådd. Totalt 9431 gener relatert tilpigmenteringble hentet fra GeneCards-databasen, hvorav 6180 ble valgt ut og hadde en relevansscore > 1.

3.3. Rangering av 14 TCM-er og Disease-Compound-Target Network.

Ved å bruke Cytoscape-programvare tok vi skjæringspunktet mellom de regulatoriske genene til hver TCM og pigmenteringsrelaterte gener og fikk de potensielle aktive ingrediensene og vanlige målgener. Deretter målnettverket for sykdomsforbindelse mellom TCM ogpigmenteringble bygget. Basert på dette oppnådde vi gjennomsnittlig "grad" av hver aktive ingrediens og rangerte TCM-ene i henhold til deres poengsum. I henhold til rangeringsskårene var de 5 beste urtene Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones og Paeoniae Radix Alba (Figur 2(a)). Gjennom KEGG-analyse av 220 målgener av de 5 beste TCM-ene, var 19,3 prosent av genene rike på PI3K-Akt-signalveien, 13,6 prosent av gener var relatert til TNF-signalveien, og omtrent 12,3 prosent av genene var relatert til IL{{ 12}}. I tillegg var 37 gener involvert i MAPK-banen og 28 gener var involvert i HIF-1-banen. Disse veiene er nært knyttet til regulering av melaninmetabolisme og hudfotoaldring. Blant de 20 beste berikede signalveiene utgjorde betennelsesrelaterte veier en fjerdedel av disse (figur 2(c)). Figurene 2(d)–2(h) viser sykdomsforbindelse-målnettverket mellom henholdsvis Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba og pigmentering. I følge Venn-diagrammet over ingrediensene i de fem beste TCM-ene fant vi at fire TCM-er inneholdt sitoglusid og beta-sitosterol (figur 2(b), tilleggstabell S2).

3.4. Potensielle aktive ingredienser for å hemme pigmentering.

I følge nettverket sykdom-forbindelse-mål, 148ingredienser knyttet tilpigmenteringble hentet fra 14TCMs. Gjennom et litteratursøk ble 25 av de 148 ingrediensene rapportert å hemme melanogenese. Fire aktive ingredienser ble rapportert som planteekstrakter som hemmer melanogenese. Fjorten aktive ingredienser ble studert, og deres derivater ble rapportert å regulere pigmentering. Interessant nok ble fire ingredienser vist å fremme melanogenese, mens mekanismen til seks ingredienser i å regulere melanogenese fortsatt er uklar. De resterende 95 potensielle kinesiske medisinske ingrediensene har ennå ikke blitt utforsket for regulering av pigmentering. Detaljert informasjon om disse ingrediensene er gitt i tilleggstabell S3.

3.5. In vitro og in vivo effekter av Sitogluside på melanogenese.

Etter screeningsprosessen ovenfor fant vi ut at fire TCM-er i de øverste TCM-ene inneholdt sitoglusid og -sitosterol. -Sitosterol er rapportert å hemme talfa-melanocytt-stimulerende hormon (-MSH), og stimulere melanogenese via p38-signalveien i B16F10 melanomceller [43]. Imidlertid er antipigmenteringseffektene av sitoglusid og dets spesifikke mekanisme ikke rapportert. Derfor valgte vi sitoglusid som legemiddelkandidat for disse studiene. CCK8-analysen ble utført for å undersøke potensielle toksiske konsentrasjoner av sitoglusid i MNT1- og B16F0-celler. Resultatene viste at sitogluside ikke hadde noen åpenbar effekt på spredningen av cellene (figur 3(a) og 3(b)) ved konsentrasjoner under 400 μM. Melaninfarging utført ved bruk av 25, 50, 100 og 200 μMsitoglusid viste at sitoglusid kan redusere melanininnhold i MNT1- og B16F0-celler på en doseavhengig måte (figur 3(c)). Videre hemmet sitoglusidbehandling huden betydeligpigmenteringi sebrafisk på en tids- og doseavhengig måte (Figur 3(d)). Disse resultatene antydet at sitoglusid hemmet melanogenese in vitro og in vivo.

3.6. Effekter av Sitogluside på TYR-ekspresjon.

Fra de tidligere resultatene kan sitoglusid effektivt redusere melanininnholdet, men hvordan det regulerer denne prosessen er fortsatt ukjent og derfor av interesse. Western blotting ble utført for å oppdage ekspresjonen av melanogenese-relaterte gener (TYR,MITF, TRP1, TRP2 og RAB27A) på proteinnivå. Resultatene av analysene viste at TYR-ekspresjon var signifikant nedregulert og MITF- og TRP1-uttrykk var moderat nedregulert etter sitoglusidebehandling (Figur 4(a)). Siden MAPK og PKA er keyupstream-signalveiene som regulerer TYR, undersøkte vi ytterligere endringene i nøkkelproteiner i disse to banene. Etter at MNT1- og B16F0-celler ble behandlet med sitoglusid i 2 dager, var fosforyleringsnivåene til ERK og P38 betydelig nedregulert , mens det ikke var noen signifikante endringer i de totale nivåene av CREB-, ERK-, JNK- og p38-proteiner eller fosforyleringsnivåene til JNK og CREB (Figur 4(b), Figur S1A). I følge resultatene fra CCK8-eksperimentet fant vi at PMA under 100 ng/ml ikke er giftig for begge cellene (Figur S1B), og 25 ng/ml PMA kan åpenbart øke fosforyleringsnivået til ERK. Fosforyleringsnivået til ERK avtok gradvis etter 4 timer (Figur S1C-D). Gjennom Fontana-Masson melaninfarging fant vi at PMA kan øke temelanininnholdet i MNT1- og B16F0-celler betydelig. Westernblotting-resultatene tyder også på at PMA kan oppregulere fosforyleringsnivået til ERK, og sitoglusid kan redusere fosforyleringsnivået til ERK oppregulert av PMA. Ved å hemme fosforyleringsnivået til ERK og redusere proteinnivået tilTYR, reduserer sitoglusid melanininnholdet økt med PMA (figur 4(c) og 4(e), figur S2A). Samtidig fant vi at anisomycin har lignende resultater. Anisomycin under 8 nM er ikke giftig for begge celler, og 2 nM anisomycin kan øke fosforyleringsnivået til p38 betydelig. Etter 8 timer er fosforyleringsnivået til p38 fortsatt høyt (figur S1B, figur S1E-F). Resultatene av Fontana-Masson melaninfarging og western blotting tyder også på at sitogluside kan hemme fosforyleringsnivået til p38 oppregulert av anisomycin, redusere innholdet av TYR-protein og hemmepigmentering(Figur 4(d) og 4(f), figur S2B). Derfor kan sitoglusid redusere TYR-ekspresjon ved å hemme ERK/MAPK- og p38/MAPK-veiene. Mekanismen som sitoglusid hemmer disse signalveiene med forblir imidlertid uklar. Vi sporet oppstrøms membranreseptorene til disse signalveiene og brukte molekylær dokking for å utforske mekanismen for å regulere nedstrøms veier. Bindingsenergiene mellom sitoglusid og de seks membranreseptorene, nemlig opioid u, melanokortin 1, stamcellefaktor, endotelinB, adrenerge og prostaglandinreseptorer var -7.8,-5.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4 og 0 kal/mol, henholdsvis. Gjennom molekylær dokking fant vi at blant seksmembranreseptorene hadde sitoglusid svært høy affinitet med opioid u, melanokortin 1 og stamcellevekstfaktorreseptorer (figur 4(g)). Vi spekulerer i at sitogluside kan hemme ERK/MAPK- og p38/MAPK-veiene ved å binde seg til de tidligere nevnte membranreseptorene, og derved nedregulere TYR-ekspresjon.

3.7. Effekt av Sitogluside på TYR-aktivitet.

SidenTYRer nøkkelenzymet i melaninsyntesen, det er det mest fremtredende målet for å hemme melanogenese. De fleste kommersielt tilgjengelige kosmetikk eller hudlysende midler, som HQ, arbutin og kojinsyre, er TYR-hemmere. Vi brukte sitoglusid og noen klinisk brukthudblekingmidler (arbutin, nikotinamid, kojinsyre, HQ og askorbinsyre) for å utføre molekylær dokking med TYR. De detaljerte interaksjonene mellom sitoglusid og de ovennevnte midlene medTYRer vist i figur 5(a). Bindingsenergiene til disse seks forbindelsene var -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4 og {{ 11}},4 kcal/mol, henholdsvis. Det antas generelt at når affinitetsenergien er -4, indikerer det en bindingskraft, og når den er større enn eller lik -7.0, indikerer det en sterk bindingskraft. Sitoglu-siden ble nummer to i affinitet, litt svakere enn arbutin, og viste en relativt enestående kombinasjonsevne.

Samtidig ble et L-DOPA-konverteringseksperiment brukt for å påvise aktiviteten til TYR, ved å bruke kojinsyre som en positiv kontroll. Resultatene viste at sitoglusid hemmet TYR-aktivitet i MNT1- og B16F0-celler på en konsentrasjonsavhengig måte, og høykonsentrasjonsgruppen (200 μM) viste en tilsvarende hemmende effekt som den som ble vist av 200 μM kojic syre (figur 5(b) og 5(c)). I tillegg viste resultatene av TYR-probeeksperiment at når konsentrasjonen av sitoglusid økte, sank fluorescensintensiteten gradvis i cellene, og fluorescensintensiteten til høykonsentrasjonsgruppen var nær den for 200 μM kojinsyre i MNT1- og B16F0-celler (Figur 5(d), Figur S2C). Disse resultatene indikerer at sitoglusid effektivt kan hemmeTYRaktivitet i MNT1 og B16F0 celler. Dessuten spekulerer vi i at sitoglusid, som en naturlig sterolforbindelse, kan trenge direkte inn i cellemembranen og binde seg til TYR og hemme dens aktivitet, og derved hemme melanogenese.

4. Diskusjon

I denne studien brukte vi nettverksfarmakologi for å utforske potensialets mekanismerhudblekingingredienser funnet i 14 TCM-er, dokumentert i Ben-Cao-Gang-Mu og infolks resepter, for å hemmepigmentering. Studien foreslo også en innovativ metode som bruker den gjennomsnittlige "grad" topologiske parameteren for hver aktiv ingrediens for å evaluere den potensielle effektiviteten til urtene. I henhold til den gjennomsnittlige "graden" ble Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones og Paeoniae Radix Alba valgt, og gjennom KEGG-anrikningsanalysen av genene regulert av disse fem TCM-ene, var det uventet 25 prosent av den anrikede signalveier var relatert til betennelse, inkludert IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt og MAPK signalveier.

Nylig har en rekke inflammatoriske mediatorer blitt vist å aktivere eller hemme melanogenese-relaterte signalveier som fremmer eller hemmer hudpigmentering[6]. Inkulturerte B16F10 melanomceller, TNF- reduserte uttrykket avTYRog TRP1- og TYR-aktivitet på en doseavhengig måte [44]. IL-17 og TNF- kan redusere uttrykket av melanogenese-relaterte gener i melanocytter, og IL-17 kan betydelig øke den hemmende effekten av TNF- på melanogenese. Etter behandling med etanercept (anti-TNF) ble melanogenese-relaterte gener betydelig oppregulert i hudlesjonene til pasienter med psoriasis [45]. HIF-1, en kraftig transkripsjonsfaktor som regulerer den inflammatoriske responsen, har blitt rapportert å være involvert i reguleringen av faktorer som IL-17 og TNF- [46–48]. Derfor vil HIF-1 sannsynligvis delta i reguleringen av melanogenese ved å påvirke betennelse. Andre cytokiner som IL-18, IL-33, GM-CSF og IL-1 kan fremme melanogenese ved å aktivere PKA, MAPK eller andre signalveier, mens IFN-, IL-1, IL-4 og IL-6 reduserer melanogenese ved å hemme STAT1, NF-kB, og JAK2-STAT6-signalveier [6]. Våre funn tyder på at de fem beste TCM-ene (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones og Paeoniae Radix Alba) kan ha en anti-pigmenteringseffekt hovedsakelig gjennom anti-inflammatoriske veier. Tidligere litteratur nevnte også at disse fem beste TCM-ene har kraftige antiinflammatoriske og antialdringseffekter [49, 50]. Dette støtter også vår formodning om at TCM kan spille en ikke ubetydelig rolle i postinflammatorisk pigmentering.

Mens vi leste litteraturen om 148 ingredienser funnet i 14 TCM, fant vi også at blant 35 av de rapporterte ingrediensene ble nesten 70 prosent av dem bekreftet å enten redusere melanininnholdet eller hemme TYR-aktivitet. Dette bekrefter ikke bare at registreringer av resepter for bleking av hud i eldgamle bøker stort sett er pålitelige, men viser også at referanse til gammel litteratur er en pålitelig metode for å få kunnskap om TCM. Det er fortsatt 95 forbindelser som forblir uutforskede, som har potensial til å motståpigmentering. Gjennom analyse av Venn-diagrammene av de fem beste TCM-ene ble 13 vanlige ingredienser oppnådd. Blant dem bekreftet in vitro-eksperimenter at daidzein, rutin og (pluss)-katechin kan redusere melanininnholdet [51–53]. Sukrose forstyrrer riktig melanosommodning ved å indusere osmotisk stress og hemme PI3-kinaseveien, og dermed forstyrre melanogenese [54]. Quercetin reduserer oksidativt stress-indusert melanogenese [55]. I tillegg bekreftet kjemiske og fysiske metoder som spektroskopiske og struktur-aktivitetsanalyser at lupeoland kaempferol kan hemmeTYRog redusere melanogenese [56, 57]. Dette indikerer at nettverksfarmakologi kan være en gjennomførbar metode å grave utblekingingredienser. Fire TCM-er i de fem beste TCM-ene inneholdt sitoglusid, og det er ingen rapporter om hvorvidt sitoglusid regulerer pigmentering eller dens relaterte mekanisme. Derfor valgte vi sitogluside for disse studiene.

Sitoglusid, et sterolglykosid som er mye tilstede i planter, har blitt rapportert å ha antitumor-, antioksidativ- og nevrobeskyttende effekter [58–60]. I denne studien oppdaget vi at sitoglusid effektivt reduserte melanininnholdet in vitro og in vivo. Etterfølgende eksperimenter viste at det kunne redusere uttrykket av TYR betydelig. Kojic acid ble brukt som en positiv kontroll, og den kan også hemme proteinnivåene til melanogenese-relaterte gener som TYR,MITF og TYRP1 under -MSH-stimulering, som ble rapportert av Jeon et al. [61]. Gitt fraværet av eksogen stimulering, hadde 200 μM kojinsyre bare moderate hemmende effekter på genuttrykk i vår studie, men fordi kojicacid har stor tyrosinaseinhiberende aktivitet, bruker vi det fortsatt som en positiv kontroll i denne studien. TYR-ekspresjon ble rapportert å være direkte eller indirekte regulert av henholdsvis MAPKor PKA-veiene. Et økende antall ingredienser har blitt bekreftet å ha en blekende effekt på huden ved å hemme MAPK-signalveien. For eksempel reduserer fargesin uttrykket avTYRved å hemme P38/MAPK-banen [62]. Ganoderma lucidum polysaccharides kan motstå UVB-indusert melanogenese ved å nedregulere MAPK-banen [63]. Vår studie fant at sitoglusid, i en konsentrasjon på 200 μM, hadde potensialet til å redusere TYR-ekspresjon ved å hemme ERK/-MAPK og P38/MAPK signalveier. Dette har blitt rapportert gjennom den molekylære dokkingen mellom oppstrøms membranreseptorene til MAPK-veier [64] og sitoglusid. Vi fant at sitoglusid binder seg sterkt til opioid u, melanokortin 1 og stamcellevekstfaktorreseptorer. Derfor spekulerer vi i at sitoglusid kan interagere med disse membranreseptorene, hemme ERK/MAPK og P38/MAPK signalveier og redusere uttrykket av TYR.

Siden TYR er nøkkelenzymet i syntesen av melaninpartikler i melanocytter, er hemming av aktiviteten til det katalytiske stedet til TYR avgjørende for å redusere hudenpigmentering[65]. Mange hudlysende midler på markedet er TYRactivity-hemmere, slik som HQ, arbutin og kojinsyre. I denne studien brukte vi molekylær docking for å utforske bindingseffektene av sitoglusid og fem vanligehudblekingaktive ingredienser (arbutin, nikotinamid, kojinsyre, HQ, andaskorbinsyre) [66] medTYR. Resultatene viste at sitoglusid hadde en sterk bindingsaffinitet med TYR, svakere ennarbutin, men sterkere enn kojinsyre, nikotinamid, HQ, andaskorbinsyre. Arbutin er et prodrug av HQ og et naturlig produkt som kan redusere eller hemme syntesen av melanin ved å hemme TYR. Imidlertid er den naturlige formen av arbutin iskjemisk ustabil og kan omdannes til HQ, som katalyseres og metaboliseres til benzenmetabolitter med potensiell toksisitet for benmarg [67]. Bruken av kojic acid inkosmetikk er begrenset på grunn av dens kreftfremkallende egenskaper og ustabilitet under lagring [68]. Derfor forventes sitoglusid, en naturlig sterolforbindelse avledet fra en rekke planter, å virke som et kraftig hudlysende middel. Imidlertid er løseligheten av sitoglusid i DMSO lav, noe som også er en mangel ved denne naturlige ingrediensen. Etterfølgende eksperimentell verifikasjon viste at sitoglusid er trygt i MNT1- og B16F0-cellelinjer, og lavkonsentrasjonsgruppen hadde en god hemmende effekt på TYR-aktivitet, mens høykonsentrasjonsgruppen hadde samme effekt som den samme konsentrasjonen av kojinsyre. Derfor kan sitoglusid brukes terapeutisk som en hudblekende regulator, som ikke bare reduserer uttrykket av TYR, men også hemmer aktiviteten (Figur 6).

5. Konklusjoner

Nettverksfarmakologien er kanskje et effektivt verktøy for å oppdage naturlige hudpigmenteringsreduserende aktive ingredienser og deres mulige mekanismer. Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones og PaeoniaeRadix Alba har potensialehudblekingegenskaper og kan hemmepigmenteringved å regulere betennelse. Sitogluside er en romanhudblekingaktiv ingrediens med dobbeltregulerende effekter, nemlig. hemmendeTYRuttrykk og aktivitet.

cistanche tabletter