In vivo administrasjon av tarmbakteriekonsortier replikerer urolithin-metabotyper A og B i en ikke-urolitin-produserende rottemodellⅠ

I flere tiår har forbruket av ellagitanniner (ET) andellaginsyre (EA) vært assosiert med en rekke biologiske effekter, inkludert antioksidant-, antikreft-, anti-inflammatoriske, antibakterielle og anti-HIV-replikasjonsaktiviteter.1 Imidlertid har absorpsjon og biotilgjengelighet av ET-er og EA er svært dårlige. Tidligere studier på mennesker fant at urinutskillelsen av EA og et EA-O-glukuronid er mindre enn 1 % av inntaket.2,3 Likevel, mens ET- og EA-absorpsjonen er lav, metaboliseres de videre av kolonmikrobiotaen til urolithiner (Uros), som er ansvarlige, i det minste delvis, for de gunstige effektene av ET- og (eller) EA-rike matvarer.1,4

Klikk til avføringsmiddel

For det første frigjøres EA gjennom hydrolysen av ETs esterbindinger av enzymet kjent som ellagitannase.5 EA gjennomgår ytterligere nedbrytning, og produserer 6H-dibenzo[b,d]pyran-6-one-derivater kalt Uros. Denne kaskaden av reaksjoner starter med en laktonringspaltning av et laktonaseenzym, noe som resulterer i luteinsyre, som deretter dekarboksyleres til pentahydroksy-Uro (Uro-M5). Konsekutiv dehydroksylering konverterer den til tetrahydroksy-Uros (Uro-D, Uro-E, og Uro-M6) og trihydroksy-Uros (Uro-C, UroM7 og Uro-G), for til slutt å gi dihydroksy-Uros (Uro-A andisoUro-A) og monohydroksy-Uro (Uro-B), sistnevnte blir generelt oppdaget når isoUro-A også produseres.1

Den store variasjonen av Uro-metabolske profiler oppdaget hos mennesker etter inntak av ET-rik mat indikerer interindividuelle forskjeller i tykktarmsmikrobiotaen som er ansvarlig for ET-nedbrytningen. )fenoler.6,9 Denne toveis interaksjonen mellom tarmmikrobiota og (poly)fenoler har fått det vitenskapelige samfunnet til å gruppere befolkningen basert på deresmetabolsk fenotype (metalltype) for å forklare forskjellene i polyfenolenes effekter.10,11 Mer spesifikt, i henhold til ET- og EA-metabolismen, kan individer stratifiseres i urometabotyper (UM) assosiert med tarmmikrobiomets sammensetning og funksjon.7,8,12

Tre menneskelige UM-er (UM-A, UM-B og UM-0) relatert til tre forskjellige Uro-produksjonsprofiler er blitt beskrevet i vestlige og østlige populasjoner.13–15 I denne forbindelse, metabotype A (UM-A) individer produsere flere mellomliggende Uroer, men bare urolithin A(Uro-A), den viktigste absorberte Uroen i denne UM, på slutten av den mikrobielle katabolske banen. Metabotype B (UM-B) individer produserer noen mellomliggende Uros og tre endelige Uros, dvs. urolithin B (Uro-B), urolithin A (IsoUro-A) og Uro-A, som er de viktigste absorberte Uroene i UM-B. Derfor kan de mellomliggende Uros primært virke i tarmen, mens de siste kan ha lokale og systemiske effekter.6 I motsetning kan ikke individer med metalltype 0 (UM-0) produsere disse endelige Uros (bare forløper Urolithin-M5 er påvist så langt, som ikke absorberes i tarmen).

Det er observert forskjeller i Uroprofiler mellom UM-er og langs tykktarmen, og viser dominerende Uro-produksjon i distalcolon-regionen.16–19 Bemerkelsesverdig nok er UM-0-prosenten i spanske og kinesiske friske frivillige omtrent 10 % og kan være enda høyere i den amerikanske befolkningen.13–15 Bakterieslektene Gordonibacter og Ellagibacter har blitt identifisert som i stand til å metabolisere EA til noen Uros.20–23Det ble imidlertid funnet at noen mellomprodukter (for eksempel Uro-D, Uro-E, Uro- M7 og Uro-G) og endelige Uroer (Uro-A og Uro-B) produseres ikke i rene kulturer av disse bakteriene, noe som innebærer at andre bakterier trenger å fullføre settet med Uros som konfigurerer både UM-A og UM-B . Nylig har de tarmbakterielle konsortiene som er involvert i EA-metabolisme for å gi de uroproduserende metabotypene (UM-A og UM-B) in vitro blitt identifisert.24

Bakteriekonsortier som inneholder Gordonibacter plusEnterocloster-slekter og Ellagibacter pluss Enterocloster produserte in vitro urolithinene assosiert med henholdsvis UM-A og UM-B.25 Imidlertid er evnen til disse bakterielle konsortiene til å replikere menneskelige Uro-profiler assosiert med UM-A og UM-B in vivo er fortsatt ukjent. Videre er sikkerheten ved å konsumere disse Uro-produserende bakteriene som nye probiotika fortsatt usikker, siden den ikke tidligere har blitt testet på dyr eller mennesker. I denne studien ble de ovennevnte bakteriekonsortiene vurdert for deres evne til å kolonisere tarmen til Uro-ikke-produserende (UM-0-lignende) rotter og konvertere dem til Uroprodusenter som etterligner henholdsvis UM-A og UM-B. Sikkerheten til disse bakteriekonsortiene ble også evaluert. Dessuten ble to nye sanntids kvantitative PCR (qPCR)-baserte prosedyrer utviklet for å oppdage og kvantifisere Ellagibacter og Enterocloster i fekale prøver.

Materialer og metoder

Kjemikalier og reagenser

Uros ble kjemisk syntetisert og renset av VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Spania). EA ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Fosfatbuffer saltvann (PBS) ble hentet fra FisherScientific (USA), mens metanol, etanol og maursyre var fra Panreac Química (Barcelona, ​​Spania). Væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) løsningsmidler ble kjøpt fra JT Baker (Deventer, Nederland). Ultrapure Millipore vann (Bedford, MA, USA) ble brukt gjennom hele studien. Alle kjemikalier og reagenser var av analytisk kvalitet.

Utarbeidelse av bakteriekonsortier

Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T og Enterocloster boltet CEBASS4A9, alle av dem isolert og identifisert i laboratoriet vårt (CEBAS-CSIC, Spania), var en kultivatorskinn. -Chalgren anaerob medium (WAM, Oxoid) rør ved 37 grader i 48 timer i Concept 400 anaerobt kammer (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, South Wales, UK) og suspendert i PBS supplert med 10 % glyserol og 0,05 % L-cysteinhydroklorid (PanReac) Química, Barcelona, ​​Spania). Etter anaerob inkubasjon ble konsortier forberedt.24,25 Kort fortalt inneholdt "bakteriekonsortium A" G. urolithinfaciens og E. bolteae stammer; "bakteriekonsortiumB" inneholdt E. isourolithinifaciens- og E. bolteae-kulturer; og "kontrollcocktail" inneholdt steril PBS med 10 % glyserol og 0,05 % L-cysteinhydroklorid. Før administrering ble alle cocktailer fordelt i 3,5 ml alikvoter og holdt ved -80 grader.

Dyr, dietter og eksperimentell design

Den eksperimentelle protokollen (referanse 624/2020) ble godkjent av den lokale regjeringen, det spanske nasjonale forskningsrådets bioetikkkomité (Madrid, Spania), og dyreforsøksetikkomiteen fra Universitetet i Murcia (Spania). Forsøkene fulgte anbefalingene fra Den europeiske union angående dyreforsøk (Direktiv 2010/63/EU fra Europaparlamentet og rådet om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål). Wistar-rotter (n=18; 9 hunner og 9 hanner) som veide 240 ± 31 g ble oppnådd fra Envigo (Barcelona, ​​Spania). Denne rottemodellen ble valgt basert på dens evne til å produsere Uros observert i våre foreløpige studier der fekale prøver fra forskjellige rottemodeller ble testet. Tre grupper (A, B og C) ble dannet ved å tilfeldig tildele 6 dyr hver (3 hunn- og 3 hannrotter) ) per gruppe (fig. 1).

Hver rottegruppe ble plassert i to forskjellige bur, delt etter kjønn, i et rom med et temperaturkontrollert miljø (22± 2 grader) med 55 ± 10 % relativ fuktighet og en kontrollert lys-mørke-syklus (12 timer). Rottene fikk en standard chow-diett (Teklad, Barcelona, ​​Spania) som inneholdt (%/100 g ferskvekt) 14,3 % proteiner (maisglutenmel), 48 % karbohydrater (hvetemelk, malt hvete, malt mais) og 4 % fett (soyaolje) ), 2,9 kcal g−1 energitetthet og 4,1 % råfiber, supplert med EA-pulver Større enn eller lik 95 % renhet (3,6 mg per 100 g chow). EA ble blandet homogent med malt standardfôr, re-pelletert og lyofilisert. Den EA-berikede dietten ble lagret borte fra fuktighet og lys. EA-dosen gitt tilrotter i dietten var omtrent 0.72 mg per rotte per dag (EA1× diett), en human ekvivalent dose på 41 mg dag–1.26 Alle gruppene ble matet med EA 1× dietten og springvann ad libitum gjennom hele eksperimentet ( 5 uker). Siden EA påvist i avføringsprøver var lav i løpet av den første uken, ble det tilsatt noe ekstra EA de påfølgende dagene. Ved uke 3 ble en ekstra dose på 1,5 mgEA per rotte per dag oppløst i vann administrert oralt med sonde til dyrene (totalt=EA 3× diett), som kun ble gitt i 1 uke. Til slutt, ved uke 4, ble ≈5 g valnøtter per rotte per dag (en annen EA-kilde) lagt til EA 1×-dietten og ble opprettholdt til slutten av studien for å evaluere effekten av matmatrisen som inneholder EA på bakterienes evne. å produsere Uros. Vekt, mat og vanninntak ble målt hver dag. Tarmbakteriekonsortiene ble administrert oralt ved gavage. Gruppe A mottok 500 µL bakteriell cocktail A, gruppe B mottok 500 µL bakteriell cocktail B, og gruppe C(kontroll) mottok 500 µL PBS. Oral sonde ble utført annenhver dag i løpet av de to første ukene og hver dag i løpet av de påfølgende 2 ukene. Den siste uken (dager 28 til 32) fortsatte dyrene med den samme dietten supplert med EA og valnøtter, men uten oral bakterieadministrasjon. På slutten av studien ble dyrene ofret ved bruk av et CO2-kammer.

Prøvetakingsprosedyrer

Avføringsprøver ble samlet under studien for Uro-analyse ved UPLC-ESI-QTOF-MS/MS og tarmmikrobiota ved 16S rRNAgen-sekvensering og qPCR. Blod ble ekstrahert på forskjellige tidspunkter (grunnlinje, dag 28 og slutten av studien) for hematologiske og biokjemiske analyser i serum. Blodprøver ble tatt fra halevenen (≈500 µL) og samlet i heparinholdige rør ved baseline og dag 28 og 32 (fig. 1). Plasmaseparasjon ble utført umiddelbart ved sentrifugering ved 3000 g i 10 minutter ved 4 grader og frosset ved - 80 grader inntil videre bestemmelse av serobiokjemiske variabler. Leveren, nyrene og milten ble samlet, veid og undersøkt for å oppdage eventuelle morfologiske forskjeller ved avliving.

Design og optimalisering av primerne og probe for kvantifisering av Ellagibacter og Enterocloster ved qPCR

Sekvenser av 16S rRNA-genene til Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T og E. bolted CEBAS S4A9 ble hentet fra GenBank-databasen (EMBL-databasen). Sekvensene ble justert med den fylogenetisk nære bakterien som genererte Molecular Evolutionary Genetics Analysis-programvaren (MEGA 11) og inspisert for regioner med konserverte og variable sekvenser for å designe primerne og proben for å oppdage og kvantifisere Ellagibacter og Enterocloster (tabell 1). Primer- og proben ble designet og validert med henholdsvis Primer Questand Oligo Analyzer-verktøyene (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgia). TaqMan-proben ble merket i 5'- og 3'-endene med en 6-karboksy-fluoresceingruppe (6FAM) og en bjørnebærslukker (BBQ), henholdsvis. qPCR ble utført ved bruk av et ABI 7500-sekvensdeteksjonssystem. Sluttkonsentrasjonen av hver primer og probe var 300 og 375 nM for Ellagibacter og 200 og 500 nM for Enterocloster. En konvensjonell qPCR-protokoll ble utført for DNA-amplifisering av Ellagibacter ogEnterocloster, henholdsvis. Rampeprofilen for Ellagibacteramplification var 1 syklus ved 95 grader i 5 minutter, etterfulgt av 45 sykluser på 95 grader i 15 s, 50 grader i 40 s og 72 grader i 31 s. Til slutt ble 1 syklus ved 72 grader i 5 minutter lagt til . Rampeprofilen for Enterocloster-forsterkning var 1 syklus ved 95 grader i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 grader i 15 s, 65 grader i 40 s og 72 grader i 31 s. Til slutt ble 1 syklus ved 72 grader i 5 minutter tilsatt.

Fekal DNA-ekstraksjon og tarmmikrobielle analyser

DNA-ekstraksjon fra fekale prøver ble utført med NucleoSpin®-vevs-DNA-rensesettet (Macherey-Nagel, Tyskland), i henhold til produsentens instruksjoner med noen modifikasjoner. DNA ble kvantifisert ved fluorimetri (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, UK), og renheten ble målt fra absorbansforholdet ved en bølgelengde på 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK ). Tarmmikrobiota-sammensetning ble bestemt ved å sekvensere de variable V3- og V4-områdene til 16S rRNA-genet ved å følge Illumina-protokoller (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) med en leselengde på 2 × 300 bp paret-ende-kjøring (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Metagenomisk sekvensering ble utført på en MiSeq-Illumina-plattform (FISABIO sequencingservice, Spania). Databehandling, fjerning av kimær sekvens, sekvensjustering og 16S rRNA-gensekvensklynger ble utført som beskrevet andre steder for å oppnå den taksonomiske klassifiseringen.8,27 Gordonibacter DNA-amplifikasjon ble oppnådd i et ABI 7500 qPCR-system som tidligere beskrevet. spesifikke primere og prober designet i denne studien ble brukt etter qPCR-protokollen beskrevet ovenfor. Genomiske DNA-standardkurver av Gordonibacter, Enterocloster og Ellagibacter ble brukt for kvantifisering. Alle avføringsprøvene ble analysert i tre eksemplarer.

Ekstraksjon, påvisning og kvantifisering av urolithiner i avføringsprøver

Avføringsprøver ({{0}}.2–0,5 g) ble ekstrahert, i en andel på 1:10, med en løsning av MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), surgjort med 0.1 % HCl, og homogenisert ved å virvle i 2 minutter og riste ved 1500 rpm ved romtemperatur i 10 minutter i en blokkvarmer. Suspensjonen ble sentrifugert ved 14 000g ved 4 grader i 10 minutter, og supernatanten ble filtrert gjennom et 0,22 µm PVDF-membranfilter (Millipore Corp., Bedford, MA) og fortynnet 3x med MeOH (0,1 % maursyre) ) før injeksjon i et UPLC-ESI-QTOF-MS-system. Et UPLC-system (Agilent 1290Infinity) koblet til et quadrupol time-of-flight (QTOF) LC/MS-system (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland) ble brukt til å analysere fekale metabolitter ved å bruke en gradientelueringsmetode som tidligere beskrevet .29,30 Kort fortalt ble separasjon utført i en Poroshell 120 EC-C18 revers-fase kolonne, ved bruk av vann og acetonitril, begge surgjort med 0,1 % maursyre, som mobile faser. Strømningshastigheten var 0,4 mL min−1, og injeksjonsvolumet var 5 μL. MassHunter Qualitative Analysis-programvaren (versjon B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland) ble brukt til databehandling. Alle metabolitter ble identifisert ved direkte sammenligning med standarder og bekreftet av deres molekylmasse. Kalibreringskurver ble oppnådd for EA og de forskjellige Uroene med god linearitet (R2 > 0,99).

Hematologi og klinisk kjemi

Hematologiske variabler ble bestemt i heparinisert blod ved å bruke en automatisert hematologisk analysator med spesifikk programvare for rotteblodprøver (AVDIA 120, Siemens, München, Tyskland). Variablene som ble analysert var gjennomsnittlig korpuskulært volum (MCV), gjennomsnittlig korpuskulært hemoglobin (MCH), gjennomsnittlig korpuskulært hemoglobinkonsentrasjon (MCHC), erytrocyttfordeling (RDW), gjennomsnittlig blodplatevolum (MPV), blodplatekritt (PCT), blodplatefordelingsbredde (PDW) , gjennomsnittlig blodplatekomponent (MPC), gjennomsnittlig blodplatemasse (MPM), antall blodplater (PLT), retikulocytthemoglobininnhold (CHr), og gjennomsnittlig retikulocyttkorpuskulært volum (MCVr). Plasma biokjemiske variabler, kalsium (Ca) og fosfor (P) ble analysert ved bruk av en Olympus AU400 kjemi- og toksikologianalysator (Beckman Coulter, California, USA). De biokjemiske variablene var totale proteiner (PROT), albumin (ALBU), globulin (GLOB), kreatinin (CREA), glukose (GLUC), kolesterol (CHOL), triglyserider (TRIGL), alkalisk fosfatase (ALP), gamma-glutamyl transpeptidase ( GGT), aspartataminotransferase (AST) og alaninaminotransferase (ALT). Til slutt ble tyroksin (T4) nivåer analysert ved bruk av et IMMULITE® 1000 immunoassay system (Siemens).

Statistisk analyse

Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistisk analyse ble utført med SPSS-programvareversjon 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), og forskjeller medp < 0.05 ble ansett som statistisk signifikante. Datanormalitet ble evaluert med Shapiro–Wilk-testen. Sammenligninger mellom ulike behandlingsgrupper ble utført ved bruk av gjentatt målt variansanalyse (RM ANOVA) med Tukeys eller Dunnetts T3 post hoc-test, avhengig av om dataene fulgte en henholdsvis normal eller ikke-normal fordeling. Forskjeller mellom menn og kvinner ble undersøkt ved å bruke den sammenkoblede Students t-test, eller Wilcoxon signedrank test når data var henholdsvis normalt eller ikke-normalfordelt. Chi-kvadrat lineær diskriminant analyse effektstørrelse (LEfSe) ble brukt for å oppdage differensielle bakterieegenskaper mellom grupper. Pearson-korrelasjon ble brukt til å analysere mulige assosiasjoner mellom variabler i normalfordelte data, mens Spearman-korrelasjon ble brukt i ikke-normalfordelte data. Dataplott ble utført ved bruk av Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA).

Naturlig urtemedisin for å lindre forstoppelse-Cistanche

Cistanche er en slekt av parasittiske planter som tilhører familien Orobanchaceae. Disse plantene er kjent for sine medisinske egenskaper og har blitt brukt i tradisjonell kinesisk medisin (TCM) i århundrer. Cistanche-arter finnes hovedsakelig i tørre og ørkenområder i Kina, Mongolia og andre deler av Sentral-Asia. Cistanche-planter er preget av deres kjøttfulle, gulaktige stilker og er høyt verdsatt for deres potensielle helsemessige fordeler. I TCM antas Cistanche å ha styrkende egenskaper og brukes ofte til å gi næring til nyrene, øke vitaliteten og støtte seksuell funksjon. Det brukes også til å adressere aldring, tretthet og generelle velværeproblemer. Mens Cistanche har en lang historie med bruk i tradisjonell medisin, er vitenskapelig forskning på dens effekt og sikkerhet pågående og begrenset. Imidlertid inneholder den forskjellige bioaktive forbindelser som fenyletanoidglykosider, iridoider, lignaner og polysakkarider, som kan bidra til dens medisinske effekter.

Wecistanche sincistanche pulver, cistanche tabletter, cistanche kapsler,og andre produkter er utviklet ved hjelp avørkencistanchesom råvarer, som alle har god effekt på å lindre forstoppelse. Den spesifikke mekanismen er som følger: Cistanche antas å ha potensielle fordeler for å lindre forstoppelse basert på tradisjonell bruk og visse forbindelser den inneholder. Mens vitenskapelig forskning spesifikt på Cistanches effekt på forstoppelse er begrenset, antas det å ha flere mekanismer som kan bidra til potensialet til å lindre forstoppelse. Avføringseffekt:Cistanchehar lenge vært brukt i tradisjonell kinesisk medisin som et middel mot forstoppelse. Det antas å ha en mild avføringseffekt, som kan bidra til å fremme avføring og indusere forstoppelse. Denne effekten kan tilskrives forskjellige forbindelser som finnes i Cistanche, for eksempel fenyletanoidglykosider og polysakkarider. Fukting av tarmene: Basert på tradisjonell bruk anses Cistanche å ha fuktighetsgivende egenskaper, spesielt rettet mot tarmen. Å fremme hydrering og smøring av tarmene kan bidra til å myke verktøy og lette passasjen, og dermed lindre forstoppelse. Anti-inflammatorisk effekt: Forstoppelse kan noen ganger være assosiert med betennelse i fordøyelseskanalen. Cistanche inneholder visse forbindelser, inkludert fenyletanoidglykosider og lignaner, som antas å ha anti-inflammatoriske egenskaper. Ved å redusere betennelse i tarmen, kan det bidra til å forbedre regelmessig tarmbevegelse og lindre forstoppelse.