Interferens av fenyletanoidglykosider fra Cistanche Tubulosa med MTT-analysen

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu og Yu-Qi Gao

Abstrakt:

MTT-analysen, som en screeningsmetode, har blitt mye brukt for å måle levedyktigheten og spredningen av celler. Det skal imidlertid bemerkes at MTT-analysen kanskje ikke nøyaktig gjenspeiler effekten avCistanche tubulosaetanolisk ekstrakt på EA.hy926-cellers levedyktighet. For å undersøke og identifisere komponentene som er ansvarlige for de motstridende observasjonene av MTT-analysen, echinacoside og acteosid, ble to hovedfenyletanoidglykosider fra C. tubulosa etanolisk ekstrakt isolert. Dataene hentet fra CCK-8, Hoechst 33342 og annexin V-FITC/PI-analyser antyder at caffeoylgruppen tilstede i begge isolerte forbindelsene var ansvarlig for de motstridende resultatene av MTT-analysen. Disse dataene understreker behovet for å bruke en rekke forskjellige metoder for å bestemme effekten av medisinske midler på cellelevedyktighet for å unngå å generere misvisende resultater.

Nøkkelord: MTT-analyse;fenyletanoid glykosid; koffeinsyre; cellelevedyktighet; innblanding

Introduksjon

Den parasittiske plantenCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceae-familien) er vidt utbredt i nordafrikanske, arabiske og asiatiske land [1]. stammer fraCistanche tubulosaogCistanche deserticolaer viktige i tradisjonell kinesisk medisin, etter å ha blitt brukt til behandling av impotens, sterilitet, lumbago og forstoppelse på grunn av treghet i tykktarmen [2]. I tillegg har det etanoliske ekstraktet av Cistanche tubulosa vist seg å ha en betydelig beskyttende effekt mot cerebral hypoksi hos mus [3].

Endotelceller spiller en avgjørende rolle i patogenesen av hypoksisk pulmonal hypertensjon. EA.hy926 endotelcellelinjen er betydelig lik primære endotelceller. Under vår egen studie av den antihypoksiske effekten avCistanche tubulosaetanolisk ekstrakt på EA.hy926 endotelcelle, la vi merke til at 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analysen, som vanligvis brukes til å vurdere cellelevedyktighet i studier av cytotoksisitet og cytostatisk aktivitet, genererte motstridende resultater ved å vise økt EA.hy926-cellelevedyktighet etter behandling.

Nøyaktig vurdering av cellelevedyktighet er avgjørende for å identifisere potensielle cytotoksiske eller cytobeskyttende effekter av et medisinsk middel. Vi undersøkte derfor hvilke komponenter som er tilstede i C. tubulosa etanolisk ekstrakt som kan være ansvarlige for de motstridende resultatene observert med MTT-analysen. Vi isolerte to hovedfenyletanoidglykosider (PhGs) fra C. tubulosa etanolisk ekstrakt, echinacoside (heretter forbindelse 1) og acteosid (heretter forbindelse 2), og bestemte deres effekt på EA.hy926-cellelevedyktighet ved å bruke en rekke metoder. I tillegg, for å avklare hvilken substituent av forbindelsene 1 og 2 som kan være ansvarlige for de motstridende resultatene, testet vi deres aglykoner, koffeinsyre (heretter forbindelse 3) og 3,4-dihydroksylfenyletanol (heretter forbindelse 4), på EA.hy926-cellelevedyktighet ved bruk av de samme metodene.

Resultater og diskusjon

Identifikasjon av forbindelser

Strukturene til de to forbindelsene isolert fra C. tubulosa etanolisk ekstrakt ble identifisert ved kjernemagnetisk resonans (NMR) og massespektrometri (MS) analyser og er vist i figur 1. Forbindelse 1 ble identifisert som echinacosid ved sammenligning med tidligere rapportert NMR (tabell). 1) og MS (m/z 785 [M−H]−) data [4]. Forbindelse 2 NMR-spektra var svært like de for forbindelse 1, bortsett fra fraværet av en -D-glukopyranosylgruppe (tabell 1). Forbindelse 2 (m/z 623 [M−H]− ) ble identifisert som akteosid [5]. Det er viktig at begge forbindelsene har samme aglykon, som inkluderer koffeinsyre (forbindelse 3) og 3,4-dihydroksylfenyletanol (forbindelse 4).

Cellelevedyktighetsanalyser

MTT- og CCK{{0}}-analyser ble brukt til å analysere effekten av forbindelsene 1–4 på EA.hy926-cellelevedyktighet. MTT-analysen viste at levedyktigheten til EA.hy926-celler økte betydelig etter behandling med 25 og 50 μM forbindelse 1, 2 eller 3 (166,3 prosent og 174,1 prosent for forbindelse 1, 205,8 prosent og 224,3 prosent for forbindelsen 2, og henholdsvis 164,8 prosent og 189,6 prosent for forbindelse 3, p < 0,05,="" sammenlignet="" med="" kontrollceller="" (figur="" 2a).="" videre="" bestemte="" en="" morfologisk="" inspeksjon="" av="" cellene="" at="" behandling="" med="" 50="" μm="" forbindelse="" 1,="" 2="" eller="" 3="" økte="" dannelsen="" av="" lilla="" formazankrystaller,="" som="" anses="" å="" være="" en="" direkte="" indikasjon="" på="" andelen="" levende="" celler="" (figur="" 3).="" omvendt="" antydet="" cck-8-analysen="" at="" cellelevedyktigheten="" reduserte="" betydelig="" etter="" behandling="" med="" 12,5,="" 25="" og="" 50="" μm="" forbindelse="" 1,="" 2="" eller="" 3="" (75,5="" prosent,="" 45,1="" prosent="" og="" 43,7="" prosent="" for="" forbindelse="" 1,="" 85,5="" prosent,="" 51,8="" prosent="" og="" 34,3="" prosent="" for="" forbindelse="" 2,="" og="" 64,5="" prosent,="" 48,2="" prosent="" og="" 36,4="" prosent="" for="" forbindelse="" 3,="" henholdsvis="" p="">< 0,05,="" sammenlignet="" med="" kontrollceller="" (figur="" 2b).="" forbindelse="" 4="" påvirket="" ikke="" cellelevedyktighet="" i="" verken="" mtt-="" eller="" cck-8-analysen.="" avviket="" mellom="" resultatene="" oppnådd="" med="" de="" to="" assayene="" antyder="" at="" en="" av="" de="" to="" assayene="" kanskje="" ikke="" nøyaktig="" gjenspeiler="" effekten="" av="" forbindelsene="" 1="" og="" 2="" på="">

Apoptosevurdering av Hoechst Staining

Hoechst 33342 er en cellegjennomtrengelig DNA-farge som eksiteres av ultrafiolett lys og avgir blå fluorescens ved 460 til 490 nm. Det kondenserte kromatinet til apoptotiske celler farges klarere enn kromatinet til normale celler [6]. Mens kontrollceller viste jevnt dispergert kromatin, normale organeller og intakte cellemembraner, viste celler inkubert med 50 μM forbindelser 1, 2 eller 3 i 48 timer den typiske fargingen av apoptotiske celler (Figur 4A). Omvendt økte ikke eksponering av celler for 50 μM av forbindelse 4 antallet apoptotiske kjerner sammenlignet med kontrollbehandlingen.

Flowcytometrisk analyse av apoptotiske celler

Annexin V-FITC/PI dobbeltfargingsanalysen identifiserer apoptotiske celler ved høyaffinitetsbindingen av annexin V-FITC til fosfatidylserin, som eksternaliseres i celler som gjennomgår apoptose [7]. I denne analysen binder ikke levedyktige celler seg til verken annexin V eller PI og blir derfor ikke farget (nedre venstre kvadrant), tidlige apoptotiske celler farges grønne ved bindingen av annexin V-FITC (nedre høyre kvadrant), og sene apoptotiske celler er farget grønt og rødt ved binding av annexin V-FITC til henholdsvis fosfatidylserin og PI til nekrotiske celler (øvre høyre kvadrant). Som vist i figur 4B, celler inkubert med 50 μM forbindelser 1, 2 eller 3 i 48 timer, økte prosentandelen av apoptotiske celler fra 3,74 prosent (kontrollceller) til henholdsvis 10,32 prosent, 12,95 prosent og 11,30 prosent. Sammenlignet med kontrollceller, økte ikke forbindelse 4 prosentandelen av apoptotiske EA.hy926-celler.

I samsvar med resultatene oppnådd med CCK-8-analysen og Hoechst 33342-farging, viste flowcytometrianalysen at forbindelsene 1, 2 og 3 induserte apoptose i EA.hy926-celler. Til sammen antyder disse observasjonene at økningen i EA.hy926-cellelevedyktighet observert med MTT-analysen etter behandling med forbindelsene 1–3 representerte et falskt positivt resultat.

Diskusjon

I 1983 utviklet Mosmann en kolorimetrisk MTT mikroplateanalyse for å måle celleproliferasjon og cytotoksisitet [8]. Denne enkle analysen, og modifikasjoner av den, er nå mye brukt i cellebiologiske laboratorier rundt om i verden. Fraksjoneringsstudier i pattedyrceller indikerte at den reduserte pyridinnukleotidkofaktoren, NADH, er ansvarlig for mest MTT-reduksjon. Dette ble støttet av studier med hele celler [9]. MTT-reduksjon er derfor assosiert med metabolsk aktive celler og er ikke bare koblet med mitokondriell respirasjon, men også med cytoplasma og ikke-mitokondrielle membraner inkludert endosom/lysosom-rommet og plasmamembranen [10]. Netto positive ladning på MTT-molekylet er den primære faktoren for dets cellulære opptak via plasmamembranpotensialet.

Spesielt kan MTT-analysen av og til ikke reflektere nøyaktig den faktiske effekten som en testet forbindelse har på spesifikke celler. Imidlertid er de kjemiske strukturene eller gruppene som kan forårsake motstridende resultater i MTT-analysen ikke identifisert. Nyere studier har vist at MTT-analysen kan undervurdere den anti-proliferative effekten av (−)-epigallocatechin-3-gallat, den vanligste polyfenolen i grønn te [11]. I studier som brukte MTT-analysen for å oppdage tumorkjemosensitivitet, viste kjemoterapeutiske midler mot kreft, som epirubicin, paklitaksel, docetaxel og imatinibmesylat (Gleevec), økt cellelevedyktighet [12,13]. Dessuten har en rekke studier rapportert at visse planteekstrakter og redoksaktive polyfenoler kan forstyrre MTT-analysen da de direkte reduserer MTT-tetrazoliumsaltet i fravær av celler [14].

Behovet for å solubilisere MTT-formazankrystallene før spektrofotometrisk analyse i en mikroplateleser og reaksjonens iboende endepunktsnatur begrenser bruken av MTT-analysen til visse applikasjoner. Dette førte til utviklingen av tetrazoliumanaloger der fenyldelene var dekorert med negativt ladede sulfonatgrupper, slik som 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro- 5- sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboksamid (XTT), et negativt ladet indre salt [15] og 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS), et svakt surt indre salt nært beslektet med MTT [16] . Disse modifikasjonene resulterte i produksjonen av kulturmediumløselige formazanprodukter som eliminerte kravet til et solubiliseringstrinn før kvantifisering. Tilsvarende, ettersom den økte negative ladningen på disse molekylene reduserte deres evne til å bevege seg over cellemembraner [17], mellomliggende elektronakseptorer (IEA), slik som 1-metoksy-5-metylfenaziniummetylsulfat ({{25 }}metoksy PMS) var nødvendig for å lette tetrazolfargestoffreduksjon eller for å øke reduksjonshastigheten.

Nylig har det blitt utviklet en ny generasjon vannløselige tetrazoliumsalter hvor WST-1 er prototypen [18]. WST-1, et negativt ladet disulfonert indre salt som inneholder en jodrest, er mer stabil enn XTT og MTS i nærvær av 1-metoksy PMS, dets obligatoriske IEA. Dette førte til markedsføringen av WST-1/1-methoxy PMS som et praktisk enkeltreagenscelleproliferasjonssett. Flere andre tetrazoliumsalter i WST-serien er utviklet, hvorav den mest nyttige kanskje er WST-8 [19]. WST-8 ser ut til å ha svært like cellulære reduksjonsegenskaper som WST-1 og markedsføres uavhengig som CCK-8-analysen. WST-8 er celleugjennomtrengelig og reduseres derfor ekstracellulært, via elektrontransport fra intracellulær NADH til WST-8 over plasmamembranen mediert av 1-metoksy-PMS. Selv om både MTT og WST-8/1-metoksy PMS-reduksjon er drevet av intracellulær NADH, ser det ut til at kilden til NADH er forskjellig innenfor disse to metodene. WST-8/1-metoksy PMS-reduksjon er mer avhengig av malat/aspartat-skyttelen som kobler mitokondriell trikarboksylsyresyklus-NADH med det ekstramitokondrielle rommet [20].

I foreløpige eksperimenter bekreftet vi at forbindelsene 1, 2, 3 og 4 ikke direkte kunne redusere MTT-tetrazoliumsaltet (ikke vist). I denne studien ble den direkte påvirkningen av selve forbindelsene med reagenset eliminert ved å vaske mikroplatene nøye med fosfatbufret saltvann (PBS) før MTT eller CCK-8-løsning ble tilsatt, som angitt i produsentens protokoller. Likevel var resultatene oppnådd ved bruk av de to metodene fortsatt motstridende (figur 2). Som forventet økte inkubering av celler med forbindelsene 1, 2 og 3 reduksjonen av tetrazoliumsaltet til lilla formazan, sammenlignet med kontrollgruppen (figur 3), noe som tyder på at ren reduksjon av tetrazoliumsaltet i nærvær av en spesifikk forbindelse er ikke tilstrekkelig til å bedømme forbindelsens evne til å forstyrre MTT-analysen.

For å bestemme om forbindelsene 1, 2, 3 og 4 kunne indusere apoptose i EA.hy926-celler, ble cellulære morfologiske endringer og fosfatidylserin-eksternalisering vurdert. I samsvar med reduksjonen i cellulær levedyktighet observert med CCK-8-analysen, antydet resultatene av Hoechst-farging og flowcytometrianalyse ved bruk av annexin V-FITC/PI at vekstinhiberingen observert etter behandling av forbindelse 1, 2 og 3 var skyldes, i det minste delvis, EA.hy926-celleapoptose. Resultatene våre støttet også ideen om at caffeoylgruppen tilstede i både forbindelsene 1 og 2 var ansvarlig for de motstridende resultatene oppnådd med MTT-analysen.

I likhet med funnene våre, viste ikke Rottlerin, en potent kaliumkanalåpner med stor konduktans, reaktivitet mot MTT in vitro. Imidlertid forbedret det sterkt dannelsen av formazankrystaller inne i celler, et resultat som var i åpenbar konflikt med Rottlerin-hemming av NF-KB og celleproliferasjon observert ved analyse av [3H]-tymidininkorporering i DNA [21]. Mekanismen som Rottlerin forbedret MTT-reduksjonen ble tilskrevet dens mitokondrielle frakoblingseffekt [22]. Rottlerin har en kanelsyresubstituentgruppe. Sammenlignet med cinnamoylsyre, har forbindelse 3 ytterligere to hydroksylrester, som er lokalisert ved C-3 og C-4. Derfor spekulerer vi i at mekanismen som forbindelsene 1 og 2 forårsaker motstridende resultater i MTT-analysen også kan være assosiert med deres mitokondrielle frakoblingseffekter. For å teste denne hypotesen er det nødvendig med komparative studier mellom forbindelsene 1, 2 og en kjemisk frakopler, slik som trifluorkarbonylcyanid fenylhydrazon (FCCP).

eksperimentell del

Reagenser og kjemikalier

Forbindelse 3 (koffeinsyre-pulver, renhet=98,6 prosent ) ble kjøpt fra Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Forbindelse 4 (3,4-dihydroksylfenyletanol-olje, renhet=98,5 prosent) ble oppnådd fra Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). MTT og dimetylsulfoksid (DMSO) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). CCK-8-analysen ble kjøpt fra Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan). Hoechst 33342 og annexin V-FITC/PI apoptosedeteksjonssett ble kjøpt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kina)

Plantemateriale

C. tubulosa-stilker ble samlet fra Yutian Prefecture, Xinjiang Uygur autonome region, Kina. Voucherprøver ble deponert i Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, Kina) og autentisert av Yi Zhang fra Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, Kina)

Utvinning og isolering av plantemateriale

Lufttørkede C. tubulosa (0,6 kg) stilker ble pulverisert og ekstrahert med 50 prosent etanol i 2 timer ved 70 grader. Etter fjerning av løsningsmidlet under redusert trykk, ble det etanoliske ekstraktet (212,5 g) oppløst og suspendert i vann (2 L) og ekstrahert med n-butanol (2 L × 3). Det n-butanoliske ekstraktet (110 g) ble kromatografert på en polyamidkolonne og eluert med etanol/vann (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) og ga fem fraksjoner (A–E) . Fraksjon B (65 g) ble fraksjonert på en ODS-kolonne; eluering med etanol: vann (1:9) separerte forbindelse 1 (3 g). Fraksjon D (10,5 g) ble fraksjonert på en ODS-kolonne; eluering med etanol/vann (1:4) separerte forbindelse 2 (1 g).

NMR-spektra ble registrert på et Bruker Avance 600-spektrometer i CD3OD med tetrametylsilan (TMS) som intern standard. Massespektre ble utført på et BioTOF-Q massespektrometer.

Cellekultur

EA.hy926-cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler ble dyrket i RPMI 1640-medium, supplert med 10 prosent (v/v) føtalt bovint serum og 1 prosent (v/v) penicillin-streptomycin i et fuktet miljø med 5 prosent CO2 ved 37 grader.

Cellelevedyktighet

Cellelevedyktighet ble vurdert ved å bruke MTT- og CCK{{0}}-analysene. Forbindelser 1 og 2, og deres aglykoner, koffeinsyre (3) og 3,4-dihydroksylfenyletanol (4) ble oppløst i DMSO til den endelige DMSO-konsentrasjonen < 0,1="" prosent="" (v/v)="" i="">

EA.hy926-celler ble sådd på 96-brønnplater med 4 × 103 celler/brønn. Etter inkubasjon i 24 timer ble cellene behandlet med 6,25–50 μM forbindelse 1, 2, 3 eller 4 i 24 timer. Kulturmediet ble fjernet og cellene ble vasket to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS). Alikvoter (10 μL) av stam-MTT-løsning (5 mg·mL−1) ble tilsatt til hver brønn som inneholdt 100 μL medium og inkubert med celler i 4 timer. Etter inkubering ble mediet fjernet og 150 μL alikvoter av DMSO ble tilsatt til hver brønn for å solubilisere formazankrystallene. Absorbansen ble målt ved 490 nm ved bruk av en mikroplateleser (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Cellelevedyktighet ble uttrykt som prosentandelen av MTT-reduksjon, og tilordnet 100 prosent verdi til absorbansen til kontrollcellene. Alle forsøk ble utført tre ganger og presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD).

CCK-8-analysen ble utført etter litteraturen med små modifikasjoner [23]. Spesifikt ble cellene behandlet med 6,25–50 μM forbindelser 1, 2, 3 eller 4 i 24 timer og vasket to ganger med PBS før tilsetning av 10 μL CCK-8-løsning og 100 μL kulturmedier. Etter inkubering av mikroplaten ved 37 grader i 2 timer, ble absorbansen målt ved 450 nm ved bruk av en mikroplateleser. Cellelevedyktighet ble uttrykt som prosentandelen av levedyktige celler i forhold til kontrollceller (100 prosent). Alle eksperimenter ble utført tre ganger og uttrykt som gjennomsnitt ± SD.

Apoptosevurdering av Hoechst 33342 Farging

Apoptotiske morfologiske endringer ble observert ved Hoechst 33342-farging. Kort fortalt ble EA.hy926-celler sådd på 48-brønnplater (2 × 104 celler/brønn) og behandlet med 50 μM forbindelse 1, 2, 3 eller 4 i 48 timer ved 37 grader, vasket to ganger med PBS, og fiksert med 4 prosent (v/v) paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur. Etter skylling to ganger med PBS, ble cellene farget med Hoechst 33342 (10 ug·mL−1) i 5 minutter ved romtemperatur og vasket to ganger med PBS. Hoechst-fargede kjerner ble visualisert ved bruk av et fluorescensmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Apoptoseanalyse ved flytcytometri

Apoptotiske celler ble påvist ved anneksin V-FITC/PI dobbeltfarging og flowcytometrianalyse. Kort fortalt, etter behandling med 50 μM forbindelse 1, 2, 3 eller 4 i 48 timer, ble celler høstet og resuspendert i PBS ved 1 × 105 celler·mL−1. Etter sentrifugering ved 500 x g i 5 minutter ved 25 grader, ble 195 μL annexin V-FITC bindingsbuffer og 5 μL annexin V-FITC tilsatt. Etter forsiktig virvelblanding ble blandingen inkubert i 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Etter sentrifugering ved 500 × g i 5 minutter ved 25 grader, ble 190 μL FITC-konjugert annexin V-bindingsbuffer og 10 μL PI tilsatt. Etter forsiktig virvelblanding ble prøvene analysert ved bruk av et FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) innen 30 minutter.

Statistisk analyse

Alle eksperimentelle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Betydningen av forskjellene mellom eksperimentelle prøver og den tilsvarende kontrollen ble vurdert ved enveis variansanalyse (ANOVA) ved bruk av SPSS-programvaren (versjon 11.5). Statistisk signifikans ble satt til p <>

Konklusjoner

Resultatene våre tyder på at overvurderingen av antall levedyktige celler observert i MTT-analysen kan maskere cytotoksisiteten til visse forbindelser. Under legemiddelscreeningsprosesser anbefaler vi derfor å bruke en rekke metoder for å bestemme effekten av den spesifikke forbindelsen i cellelevedyktighet (som CCK-8- og 3 H-TdR-analyser) for å unngå å generere misvisende resultater.