Intramuskulær boosting med HIFN-Alpha 2b Forbedrer BCGphipps-indusert beskyttelse i en murin modell av spedalskhet

Abstrakt:

Vertsimmunitet mot Mycobacterium leprae omfatter et spekter av mekanismer som spenner fra cellulær immunitetsdrevet beskyttelse til skade assosiert med humoral immunitet som i type-2 spedalskhetsreaksjoner. Selv om type I-interferoner (IFN) deltar i eliminering av intracellulære patogener, er deres bidrag til produksjonen av antistoffer og CD3 pluss FOXP3 pluss regulatoriske T-celler (Tregs) i BCG-vaksinemediert beskyttelse ved spedalskhet ukjent. BCGphipps (BCGph) priming etterfulgt av intramuskulær hIFN- 2b øker betydelig redusert lesjonsstørrelse og Mycobacterium lepraemurium vekst i huden. T-follikulære regulatoriske celler (TFR), en undergruppe av Tregs indusert av immunisering eller infeksjon, ligger i germinal sentre (GCs) og modulerer antistoffproduksjon.

Vi fant svekket Treg-induksjon og forbedret GC i drenerende lymfeknuter av BCGph-primede og hIFN- 2b-forsterkede mus. Dessuten fremkalte disse musene betydelige mengder IL-4 og IL-10 i serum. Derfor støtter resultatene våre adjuvansegenskapene til hIFN- 2b i sammenheng med BCGph-priming for å forbedre beskyttende immunitet mot hudspedalskhet.

Beskyttende immunitet refererer til kroppens evne til å forsvare seg mot smittsomme patogener ved å produsere antistoffer, T-celler osv., og er en av de viktige mekanismene for at kroppen kan motstå sykdommer. Immunitet refererer til kroppens evne til å gjenkjenne og reagere på ulike fremmede stoffer (inkludert patogener, fremmedlegemer, tumorceller, etc.), inkludert cellulær immunitet og humoral immunitet. Beskyttende immunitet er en del av immunitet, og de to er nært beslektet. God immunitet kan fremme forbedring av beskyttende immunitet, for bedre å forhindre forekomst av sykdommer. Samtidig kan forbedringen av beskyttende immunitet også forbedre immuniteten, slik at kroppen bedre kan takle ulike ytre utfordringer. Derfor er det svært viktig å opprettholde et sunt immunsystem, inkludert god beskyttende immunitet, for å opprettholde god helse. Fra dette synspunktet er immunitet også veldig viktig. Hvis vi ønsker å forbedre vår immunitet, kan Cistanche forbedre vår menneskelige immunitet betydelig. Polysakkaridene i Cistanche kan regulere immunresponsen til det menneskelige immunsystemet og forbedre immunceller. Stressevne, forsterker den bakteriedrepende effekten av immunceller.

Klikk helsemessige fordeler av cistanche

Nøkkelord:

Mycobacterium lepraemurium; murin spedalskhet; interferon alfa; BCGphipps; germinal sentre; regulatoriske T-celler.

1. Introduksjon

Mycobacterium leprae og Mycobacterium lepromatosis, de etiologiske agensene til menneskelig spedalskhet [1,2], påvirker huden og perifere nerver [3]. Selv om multimedikamentelle behandlinger (MDT) for spedalskhet er tilgjengelige, forblir antallet nye tilfeller stabilt (700,000 per år).

Videre gjør mangelen på en effektiv diagnostisk prosedyre sporing av M. leprae-overføring vanskelig [4–7]. Den genetiske disposisjonen for tidlig spedalskhet [8] understreker behovet for en passende diagnose og utvikling av rimelige immunterapier for å redusere forekomsten av spedalskhet i utviklede land [9,10]. Spekteret av kliniske manifestasjoner ved spedalskhet korrelerer med typen immunrespons som fremkalles. For eksempel begrenser tuberkuloid spedalskhet (TT), karakterisert ved en dominerende Th1-respons, vekst av basiller via IFN-drevet aktivering av mikrobicide funksjoner til makrofager. I motsetning til dette har produksjonen av klassiske Th2-cytokiner (IL-4 og IL-10) blitt assosiert med tap av beskyttelse og forbedret basillær vekst ved spredt lepromatøs spedalskhet (LL) [10]. Det er også mellomliggende undertyper som representerer en blanding av Th1- og Th2-responser [10].

Infeksjon av mus med M. lepraemurium (MLM) [11,12] har blitt brukt til å studere immunologiske mekanismer ved menneskelig spedalskhet [11–13], selv om MLM ikke viser tropisme for perifere nerver [11,13] som M. leprae gjør [14]. Likevel er begge mykobakteriene ikke-dyrkbare og vokser sakte i verten, og dobler antallet på 1–3 uker.

Eksperimentell subkutan infeksjon med små doser av bakterier etterligner den naturlige sykdommen som vanligvis oppstår når brudd på barrierer letter mykobakteriell kolonisering, og utløser en immunreaksjon på et perifert nivå [13,15–17]. Mens cellemediert immunitet (CMI) er svekket, er humoral immunitet praktisk talt upåvirket ved spedalskhet hos mennesker og mus [18]. I tillegg former Th1-- eller Th2--celler, andre T-lymfocytter, vertens immunitet mot M. leprae-infeksjon [18,19].

Det er spennende hvordan M. leprae påvirker vertens immunitet i de forskjellige undertypene av mykobakteriell sykdom. En hypotese er at patogenet nedregulerer vertshumoral og cellulær immunitet for å infisere huden og perifere nerver [3,14,15]. Det er også bevis på at basillen svekker makrofagaktivering. Det reduserer også ekspresjonen av TNF-alfa og molekyler som prostaglandiner som induserer produksjonen av IL-1 og reaktive oksygen- og nitrogenmellomprodukter (ROI og RNI), kritiske i makrofagenes mykobaktericide funksjoner [20–22].

Humorale responser generert i GC-ene til sekundært og tertiært lymfoidt vev deltar i den beskyttende immuniteten mot patogener [23–26]. En fersk rapport om spedalskhet fremhevet den kritiske rollen til Tregs i hemming av Th1- og Th17-celleresponser [19]. Balansen mellom disse undergruppene av T-celler ved GC-ene [27–29] dikterer faktisk de beskyttende eller patologiske utfallene av infeksjonssykdommer og autoimmune sykdommer [30,31] og er kritisk for utviklingen av terapier for å indusere beskyttende immunitet [26,27 ].

Spesielt modulerer T-hjelpefollikulære celler (TFH) og spesielt T-follikulære regulatoriske celler (TFR) GC-responsen for å indusere langvarige humorale immunresponser mens de forhindrer produksjon av autoantistoffer [32,33]. Gitt at type I IFN er assosiert med generering av både TFH og Tregs, fremstår det som en lovende adjuvans for å stimulere TFH-responser i GC-ene i sammenheng med BCG-vaksinasjon [34].

Slimhinneadministrasjon av type I IFN-er induserer modning av dendrittiske celler og generering av CXCR5 pluss CD4 pluss TFH, noe som letter GC-utvikling og produksjon av antistoffer med høy affinitet i lymfeknuter [34]. I motsetning til dette opphever type I IFN vertsimmunitet i human tuberkulose ved å hemme produksjonen av induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS), IL-12p40, IL-1A og IL-1 mens de induserer IL-10- og IL-1R-antagonister [35–38]. Dermed er deltakelsen av type I IFN-er kontekstavhengig [38–42]. Type I IFN-er produseres på et jevnt nivå, men når et intracellulært patogen invaderer verten, induseres flere heterogene og komplekse antivirale eller antibakterielle medfødte responser [43–48], inkludert antistoffklassebytte, somatisk hypermutasjon og forbedring av antigentilgjengelighet i GC-ene som vil føre til sterke og effektive antistoffresponser [34,49].

Vi har tidligere rapportert beskyttelsen gitt av påfølgende intramuskulær IFN-forsterkning hos mus vaksinert med Mycobacterium bovis BCG og utfordret med MLM [42] eller mot aerosolisert M. tuberculosis-utfordring [41]. Hos mus utfordret med MLM, korrelerte beskyttelse med økt produksjon av iNOS, nitrogenoksid og IgG3-antistoffer [42]. I sammenheng med M. tuberculosis-utfordringen, fremkalte de beskyttede musene en Th1-respons [41].

I en nyere studie modulerte type I IFN autofagi og metabolisme ved spedalskhet [50]. Vi bestemte oss i denne studien for å undersøke ytterligere beskyttelsen mot murin spedalskhet indusert ved vaksinasjon med M. bovis BCGphipps (BCGph) og en farmasøytisk presentasjon av humant IFN- 2b [51]. I nyere studier ble en rekombinant BCG som uttrykker humant IFN- 2b brukt for å behandle blærekreft med hell [51–55]. I samsvar med disse dataene var målet vårt i denne studien å analysere beskyttelsen indusert av BCGph-priming og hIFN- 2b-boosting i en murin modell av spedalskhet. Samlet sett ser resultatene våre for seg potensialet til BCGph subkutan priming og intramuskulær hIFN- 2b-forsterkning for å indusere beskyttende immunitet mot menneskelig spedalskhet.

2. Materiale og metoder

2.1. Dyr

Spesifikke patogenfrie Balb/c-mus ble avlet og holdt i dyrefasilitetene til Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional i Mexico City.

Alle dyreforsøk ble utført etter godkjenning (07. mars 2014) av Institutional Animal Care and Management Committee (CIE-ENCB ZOO 016/2014).

2.2. Mikroorganismer

BCG Phipps-stammen (ATCC® 35744™) (BCGph) er en variant av BCG-stammen som har mistet regionen RD1 som koder for ESAT-6 og CFP10, med det laveste antallet T-celleepitoper , 316, versus BCG Tokyo, 359, og BCG Pasteur, 331, (Zhang et al., 2013) [51] og ble levert av Dr. Hernández-Pando (INCMNSZ, Mexico City, MX). Vaksinesuspensjoner ble deretter lagret ved –80 ◦C frem til bruk. Mycobacterium lepraemurium (MLM) ikke-dyrkbar stamme ble isolert fra milten til mus som bar en fire måneders infeksjon via en prosedyre beskrevet av Prabhakaran et al., 1976 [56], etterfulgt av rensing ved bruk av den personlige isolasjonsprosedyren beskrevet av Draper P. 1980 [57]. Kort fortalt ble 4 g miltvev suspendert i 20 ml 0,2 M sukrose og malt i en homogenisator av glass Potter-Elvehjem-type. Den resulterende suspensjonen ble sentrifugert i 20 minutter ved 150 x g for å fjerne celleavfall (Sorvall RV5B, rotor HB4) (Sorvall Instruments, Wilmington, DE, USA). Deretter ble 9 mL av supernatanten lagt på 12 mL 0,3 M sukrose, og rørene ble sentrifugert ved 3500 × g i 10 minutter ved 4–10 ◦C (Sorvall RC5B). Den resulterende basillrike pelleten ble resuspendert i 20 ml 0,2 M sukrose, og 9 ml alikvoter ble lagt på 12 ml 1,5 M KCl.

Deretter ble røret sentrifugert ved 4 ◦C i 10 min ved 3500× g. Bacillene ble samlet, vasket tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) (0,01 M Na/K-fosfat, 0,15 M NaCl, pH 7,4), og resuspendert i 40 ml av en løsning inneholdende en blanding av Percoll (3 deler) og 0,1 prosent Tween 80 (7 deler). Suspensjonen ble sentrifugert ved 23,000× g. Bacillarpelleten ble samlet og vasket fem ganger med PBS inntil Percoll ble eliminert. Renheten til det basillære preparatet ble bekreftet ved Ziehl-Neelsen-farging. Den rensede basillære suspensjonen ble fremstilt i syntetisk 7H9 Middlebrook-buljong OADC-medium (DIFCO, Detroit, MI, USA) (7H9-OADC-medium) og kvantifisert via en nefelometrisk referansekurve fremstilt med kjente mengder bakterier. Basillærsuspensjonen ble alikvotert og frosset ved -20 ◦C, til den var klar til bruk.

2.3. Vaksinasjoner

Grupper av åtte uker gamle Balb/c-mus (n=6) ble subkutant immunisert med 8 × 103 kolonidannende enheter (CFU) av BCGphipps i 200 µL steril PBS. En måned senere ble hver gruppe mus forsterket intramuskulært i løpet av tre påfølgende dager (30, 31 og 32 dager etter vaksinasjon) med 100 µL PBS eller med 100, 200 eller 300 internasjonale enheter (IE) hIFN{{14} }b (Urifron, Probiomed, Azcapotzalco, Mexico by, Mexico).

2.4. M. lepraemurium Challenge

For utfordringsforsøkene ble mus inokulert intradermalt med 2 × 106 levedyktig MLM i 20 µL PBS. Deretter ble musene holdt i standardforhold og forsynt med renset vann og Purina-gnager-chow-chips (Cuautitlan Izcalli, Mexico) ad libitum. De infiserte musene ble overvåket i åtte uker, tidspunktet da lesjoner var tydelige i huden til infiserte dyr. Sykdomsprogresjonen var variabel hos musene og korrelerte med eksperimentelle terapier (PBS, BCGph eller hIFN- 2b).

2.5. Enzym-linked immunosorbent assays (ELISA)

Antistoffer i sera fra MLM-infiserte mus ble målt ved indirekte enzymkoblede immunosorbentanalyser (ELISA). Kort fortalt ble 96-brønnplater (Nunc, Rochester, NY, USA) belagt over natten ved 4 ◦C, med 1.0 µg peptidoglykolipider oppløst i etanol [38]. Etter etanolfordampning ved romtemperatur [37] ble uspesifikk binding blokkert med 3 prosent fettfri melk i PBS fra 2 til 3 timer. Etter å ha kastet blokkeringsløsningen, ble 0,1 mL av sera fortynnet (1:100) i 1 prosent fettfri melk i PBS tilsatt til brønnene og inkubert over natten ved 4 ◦C.

Deretter ble platene grundig vasket med PBS, og bundne antistoffer ble påvist med {{0}}.1 mL anti-muse IgG (1:4000, BD 550487, BD Pharmingen, San Diego, CA, USA), IgG1-HRP (1:2500, ab 97240, Abcam, Cambridge, MA, USA), IgG2a-HRP (1:2500, ab97245, Abcam), IgG2b-HRP (1: 2500, ab97250, Abcam), eller IgG3-HRP (1:2500, ab97260, Abcam), eller biotinkonjugert rotte anti-mus IgA monoklonalt antistoff (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen), etterfulgt av pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert rotte-anti-mus-Ig-antistoff (1:1000, BD 550487, BD Pharmingen) eller avidin-HRP (ab 59653, abcam) Det kromogene substratet, tetrametyl-benzidin i 0,05 M sitratbuffer (pHphate-buffer) 5.2), supplert med 0,01 prosent hydrogenperoksid (H2O2), ble tilsatt til brønnene for fargeutvikling. Reaksjonen ble stoppet med 1 M H3P04. De optiske tetthetene ble målt ved 450 nm i en mikroplate ELISA-leser (LabSystems Multiskan Plus, LabX, Midland, ON, Canada). IFN-, IL-4, IL-17, IL-6, TNF- og IL-10 ble målt i serumet med spesifikke sandwich ELISA-sett (PEPROTEC Inc., Cranbury , NJ, USA). i henhold til produsentens instruksjoner.

2.6. Målinger av NO i seraen til mus

Kort fortalt ble sera behandlet med etanol (1:1) for å utfelle proteiner og andre forstyrrende faktorer. Etter sentrifugering ved 3000 rpm i 20 minutter, ble 20 µL av det gjenvunnede serumet plassert i brønner på en ELISA-plate sammen med 100 µL av Griess-reagenset og 80 µL destillert vann. Griess-reagenset er en volum-til-volum-blanding av løsning A (2 prosent sulfanilamid i 5 prosent fosforsyre) og løsning B (0,1 prosent N-(1-naftyl) etylendiamin, dihydroklorid. Etter en 30 min inkubering ved 25◦ C, ble den utviklet rosa fargen registrert i en ELISA-leser ved 595 nm. Verdiene ble ekstrapolert til en standardkurve av natriumnitritt i området 1–100 µM.

2.7. Immunfluorescens

Primære antistoffer ble hentet fra følgende selskaper: Geit-anti-iNOS (klon M-19, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), kanin-anti-nitrotyrosin (AB 5411, EMD, Millipore, Burlington, MA, USA ), biotinrotte Ly6C/Ly6G (klon RB6-8C5, BD Pharmingen), geit-anti-CD3-epsilon (Clone M-20, Santa Cruz Biotechnology), rotte-antimus FoxP3 (klon FJK{{12} }s, eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-prolifererende cellekjerneantigen (klon C-20, Santa Cruz Biotechnology), FITC-peanøttagglutinin (L7381- 1MG, SIGMA, St. Louis, MO, USA), og APC-rotte anti-mus CD45R (klon RA3-6B2, BD Pharmingen).

Primære antistoffer ble avslørt med følgende sekundære antistoffer: Alexa Fluor 568 esel anti-geit IgG (A11057, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), Alexa Fluor 488 esel anti-kanin IgG (711-546, Jackson ImmunoResearch Laboratories , West Grove, PA, USA), og Alexa Fluor 680 streptavidin (S32358, Thermo Fisher Scientific).

Fem-µm formalinfikserte parafiniserte seksjoner ble inkubert ved 60 ◦C over natten for avparafinisering. Vevsseksjoner ble raskt overført til xylener (247642-2.5L, SIGMA) og hydrert ved å senke objektglassene sekvensielt ned i absolutt alkohol, 96 prosent alkohol, 70 prosent alkohol og vann. Objektglassene ble nedsenket i en antigenhentingsløsning, kokt i 30 minutter og avkjølt i 10 minutter ved romtemperatur (RT). Objektglassene ble skylt flere ganger i vann og overført til PBS. Ikke-spesifikk binding ble blokkert med 5 prosent normalt eselserum i PBS inneholdende 0,1 prosent Tween 20 og 0,1 prosent Triton-X-100, i 30 minutter ved RT i et fuktig kammer. Primære antistoffer ble tilsatt til objektglass og inkubert over natten i et fuktig kammer ved romtemperatur. Objektglass ble forsiktig vasket i PBS, og fluorescerende merkede sekundære antistoffer ble inkubert i 2 timer, ved RT eller over natten i et fuktig kammer.

Til slutt ble objektglass skylt i 1 time i PBS og montert med Vectashield antifade-monteringsmedier med DAPI (H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Bildene ble tatt med et Zeiss Axioplan-mikroskop. Alle germinale sentre (GC) i en lymfeknuteseksjon ble målt med et automatisert verktøy fra Carl Zeiss-mikroskopet, og gjennomsnittlig GC-størrelse ble beregnet ved hjelp av Prism-programvaren. CD3 pluss FoxP3 pluss tregs ble talt i 5 tilfeldige 200 × felt per vev for å beregne gjennomsnittlig antall positive celler per felt.

2.8. Statistisk analyse

Statistisk signifikante forskjeller mellom grupper ble beregnet ved enveis ANOVA, Newman–Keuls multiple sammenligninger, uparet/parret to-hale Students t-test og P-verdier < 0.05 ble ansett for å være statistisk signifikante. Statistiske forskjeller ble beregnet med Graph Pad Prism.

3. Resultater

3.1. BCGphipps (BCGph)-priming etterfulgt av suksessiv intramuskulær hIFN- 2b-forsterkning Beskytter Balb/c-mus mot intradermal utfordring med M. lepraemurium.

Vi utviklet tidligere en prime-boost-protokoll basert på suksessiv intramuskulær boosting av IFN etter BCG-vaksinasjon av mus [42] med lovende beskyttelsesresultater. Nyere studier brukte en BCG-rekombinant som uttrykker humant IFN- 2b for å behandle blærekreft [51,53]. Derfor, i denne studien, var målet vårt å analysere beskyttelsen indusert av BCGph-priming etterfulgt av hIFN- 2b-forsterkning i en murin modell av spedalskhet, etter skjemaet vist i figur 1.

Figur 1. Prime-boost-protokoll for å evaluere beskyttelsen av mus mot intradermal utfordring med M. lepraemurium. Grupper av Balb/c-mus (n=6) ble subkutant vaksinert med en lav dose BCGph (8 × 103 CFU). Mus fra hver gruppe ble forsterket intramuskulært på påfølgende dager (30, 31 og 32 dager etter vaksinasjon) med PBS eller hIFN- 2b. Mus ble utfordret med 2 × 106 levedyktig MLM åtte uker etter den siste boostingen. Etter det ble mus ofret, og bioprøver ble samlet åtte uker etter utfordring. Utviklingen av hudlesjoner ble overvåket og målt som beskrevet i Materiale og metoder.

Kort fortalt ble mus utfordret intradermalt med MLM, åtte uker etter den tredje boosten med 300 IE hIFN- 2b. Sykdomsprogresjon ble overvåket i løpet av de neste åtte ukene. På slutten av denne perioden samlet vi lyskelymfeknuter for å oppdage GC og telle Tregs og andre cellepopulasjoner ved immunfluorescens. Vi brukte også immunfluorescens for å visualisere iNOS-produksjon av aktiverte makrofager, plasseringen av nitrotyrosin (NT)-rester og akkumulering av Gr-1 pluss myeloide celler i huden til eksperimentelle mus. I tillegg samlet vi serumet for å måle cytokinene og antistoffene mot glykolipider av MLM ved ELISA (figur 1).

Først, for å evaluere den beskyttende effekten av BCGph-priming og hIFN{{0}}b-forsterkning mot den intradermale utfordringen til mus med MLM, målte vi hudlesjonene og visualiserte basillerkolonisering av huden med Ziehl–Neelsen-flekken (Figur 2A–E). Huden til uprimede mus som bare mottok bærer (PBS), uten MLM-utfordring, viste ingen basiller (figur 2A). Musene som ble inokulert med bæreren og utfordret med MLM, viste store mengder MLM-basiller i huden (Figur 2B) mens priming av mus med BCGph førte til en reduksjon i mykobakteriell vekst (Figur 2C). Suksessiv hIFN- 2b-administrasjon reduserte også mykobakteriell vekst i huden sammenlignet med mus utsatt for MLM (figur 2D). Musene primet med BCGph og boostet med hIFN- 2b hadde den laveste mykobakterielle veksten (figur 2E). I samsvar med disse dataene utviklet de friske musene som ble utfordret med MLM som bare mottok bærer (PBS) de mest omfattende hudlesjonene (35 ± 9,9 mm2), mens musene som ble BCGph-primet hadde hudlesjoner av lignende størrelse som de som ble utviklet i musene inokulert med bæreren og utfordret med MLM (13,5 ± 4,24 mm2) (figur 2F). Musene som ble subkutant injisert med hIFN- 2b viste mindre hudlesjoner (20 ± 1,77 µm2). Bemerkelsesverdig, mus som ble BCGph-primet og boostet med hIFN- 2b viste en signifikant reduksjon i hudlesjonsstørrelse (5 ± 7,07 mm2) (p < 0,05) (Figur 2F).

\

Figur 2. Hudlesjoner og mykobakteriell vekst i Balb/c utfordret med M. lepraemurium. Beskyttelsen av mus ble vurdert ved utvikling av hudlesjon og visualisering av mykobakteriell vekst i hudlesjonen åtte uker etter utfordring med MLM. Hudlesjoner ble farget med Ziehl–Neelsen. Representative 400× forstørrelsesbilder av (A) uprimede mus og uutfordrede mus; (B) mus inokulert med PBS og utfordret med MLM; (C) mus primet med BCGph og utfordret med MLM; (D) mus inokulert intramuskulært med hIFN- 2b og utfordret med MLM; (E) mus primet med BCGph, boostet med hIFN- 2b og utfordret med MLM; (F) Effektiv beskyttelse tilsvarer enten fravær av hudlesjoner eller en betydelig reduksjon i hudlesjonsstørrelse, uttrykt i mm2, n=6 mus/gruppe. * p < 0.05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 ble ansett for å være statistisk signifikant.

3.2. Minimal hudpatologi hos mus primet med BCGphipps og forsterket med hIFNa 2bKorrelerer med redusert nitrotyrosinakkumulering og svekket nøytrofilinfiltrasjon

Nitrogenoksid er avgjørende for å drepe intracellulære patogener. Imidlertid fører overdreven produksjon av nitrogenoksid, superoksidradikal (O,- og hydrogenperoksid til dannelse av giftig og ustabil peroksynitritt, et molekyl som reagerer med tyrosinrester på proteiner for å danne den stabile NT 56-601. Selv om peroksynitritt dreper mykobakterier, skader det også immunceller [57-59].

Derfor bestemte vi oss for å søke etter iNOS-produserende celler og nøytrofiler i huden til våre eksperimentelle mus ved hjelp av immunfluorescens. Wesaw bakgrunnssignaler for iNOS og NT og svært få Gr-1 pluss-celler i huden til mus som bare mottar PBS (figur 3A). Økt mykobakteriell belastning og forstørrede nekrotiske lesjoner i huden korrelerte med akkumulering av NT-rester i det nekrotiske hudområdet (58,59 av uvaksinerte (Figur 3B) og BCGph-primede mus utfordret med MLM (Figur 3C) Overensstemmende med en mer balansert lokal inflammatorisk respons og forbedring av hudpatologi, NT og nøytrofil infiltrasjon ble redusert hos mus som mottok suksessive inokulasjoner med hIFN- 2b (Figur 3D) eller mus BCGph primet og boostet med hIFN 2b (Figur 3E). Nedsatt infiltrasjon med Gr{{11 }} pluss nøytrofiler og reduserte NT-områder falt sammen med det minste inflammatoriske området i histologiske hudseksjoner av mus primet med BCGph og forsterket med hIFN- 2b (figur 3F).

Figur 3. Beskyttelse er assosiert med redusert nitrotyrosinakkumulering, nedsatt nøytrofilakkumulering og forbedret hudbetennelse. Seksjoner av hudlesjoner ble farget med en kombinasjon av antistoffer spesifikke for iNOs (rød), NT (grønn) og Gr-1 (hvit). Representant 200× bilder fra (A) Hud av uprimede og uutfordrede mus, (B) mus inokulert med PBS og utfordret med MLM, (C) mus primet med BCGphipps og utfordret med MLM, ( D) mus inokulert intramuskulært med hIFN- 2b og utfordret med MLM og (E) mus primet med BCGph, boostet med hIFN- 2b og utfordret med MLM; (F, G) kvantifisering av det inflammatoriske området med automatiserte verktøy av Zeiss Axioplan-mikroskop, hudlesjoner ble samlet åtte uker etter utfordring med MLM, grafikk viser det gjennomsnittlige området okkupert av inflammatoriske celler i spedalskhet hudlesjoner, uttrykt i µm2. Målestokk=100 µm. n=6 mus/gruppe * p < 0.05; ** p < 0,005; *** p < 0,0005 ble ansett som statistisk signifikant.

NO-produksjonen var ikke statistisk signifikant sammenlignet med de andre eksperimentelle gruppene, men i gruppen med mus som BCGph-primet og boostet med hIFN- 2b, var konsentrasjonen av NO høyere (68,28 µM/L ± 0 .889) enn i PBS- og MLM-gruppene (62,79 µM/L ± 1.04), BCGph (63.37 µM/L ± 0.225), hIFN- 2b (62.57 µM/L ± 1.028 ) (Figur 3G).

3.3. Antiinflammatoriske cytokiner øker i serumet til mus som er primet med BCGphipps og forsterket med hIFN- 2b

Pro- og antiinflammatoriske cytokiner ble målt i serumet til Balb/c-mus etter utfordringen med MLM. I samsvar med den immunsuppressive tilstanden forårsaket av MLM, var konsentrasjonene av proinflammatoriske cytokiner lave i serumet til Balb/c-mus inokulert med PBS og utfordret med MLM (IFN- , 625 ± 442 pg/mL; TNF- , 697 ± 436 pg/ mL; IL -6, 68 ± 48 pg/ml; IL -17, 95 ± 67 pg/ml). Derimot hadde de moderate nivåer av antiinflammatoriske cytokiner i serumet (IL-10, 1763 ± 124 pg/mL og IL-4, 1250 ± 173 pg/mL). Selv om mus ble beskyttet av BCGph-priming og suksessiv boosting med hIFN- 2b, var de systemiske mengdene av proinflammatoriske cytokiner ikke statistisk forskjellig fra de hos mus inokulert med PBS og utfordret med MLM. Uventet ble konsentrasjonen for IL-4 (1875 ± 352 pg/mL, p < 0,05) og IL-10 (4250 ± 271 pg/mL) signifikant økt i serumet til disse musene sammenlignet med med mus inokulert med PBS og utfordret med MLM (tabell 1). Disse resultatene tyder på at vår vaksinasjonsprotokoll kan aktivere antiinflammatoriske veier for å forhindre vevsskade.

3.4. Nedsatt treg-akkumulering i drenerende lymfeknuter (DLN) hos mus som er primet med BCGphipps eller forsterket med hIFN- 2b

Tatt i betraktning at Tregs produserer IL-10 [61,62], bestemte vi oss for å kvantifisere CD3 pluss FOXP3 pluss Tregs i de drenerende lymfeknutene (DLN), som ligger nær vaksinasjonsstedet. I de uinfiserte musene (PBS) var Tregs fortsatt til stede (113 ± 9,8 CD3 pluss FOXP3 pluss Treg/200 × felt) (Figur 4A). Som forventet ble Tregs signifikant økt hos mus utfordret med MLM som ikke mottok vaksinen (BCGph) eller hIFN- 2b (214 ± 30 CD3 pluss FOXP3 pluss Tregs/200 × felt) (Figur 4B). Tilsvarende ble lavere nivåer av Tregs observert i musene primet med BCGph (160 ± 26 CD3 pluss FOXP3 pluss Tregs/200 × felt) (Figur 4C) og musene som mottok hIFN- 2b (162 ± 33 CD3 pluss) FOXP3 pluss Tregs/200 × felt) (Figur 4D); musene primet med BCGph og boostet med hIFN- 2b (127 ± 16 CD3 pluss FOXP3 pluss Tregs/200 × felt) (Figur 4E) hadde en lignende tetthet av Tregs enn uvaksinerte mus uten hIFN- 2b øker. Etter blindt å telle CD3 pluss FOXP3 pluss Tregs i DLN-ene til våre eksperimentelle mus, fant vi imidlertid at Tregs ble betydelig redusert i DLN-ene til mus etter BCGph-priming (p=0.0013), hIFN- 2 b-inokulering (p=0.0074), eller kombinert BCGph-priming og hIFN- 2b-forsterkning (p=0.0013) sammenlignet med mus utfordret med MLM (Figur 4E).

Figur 4. Nedsatt akkumulering av regulatoriske T-celler (Tregs) i de drenerende lymfeknutene (DLN-er) til mus primet med BCGphipps og forsterket med hIFN- 2b. Mus ble ofret, og DLN-ene ble samlet åtte uker etter utfordring med MLM. DLN ble farget med antistoffer spesifikke for CD3 (rød) og FOXP3 (grønne kjerner) for å oppdage CD3 pluss FOXP3 pluss Tregs ved immunfluorescens. (A) Basal akkumulering av Tregs i DLN-ene til uvaksinerte mus; (B) Tregs i DLN-ene ble økt etter MLM-utfordring og relativt redusert i (C) BCGph-primet, (D) hIFN- 2b-inokulert og (E) BCGph-primet-hIFN- 2b forsterkede mus; (F) morfometrisk analyse viser en betydelig reduksjon i tregs i DLN-ene til BCGph-primede/hIFN- 2b-forsterkede mus. Målestokk=100 µm, n=6 mus/gruppe * p < 0.05; ** p < 0.005; *** p < 0,0005 ble ansett for å være statistisk signifikant.

3.5. BCGphipps-priming og hIFN- 2b-forsterkning påvirker GCs-responser i muse-DLN-er

Det er spesielle Tregs lokalisert i GC-ene kjent som T-follikulære regulatoriske celler (TFRT-de modulerer begge GC-responsene og forhindrer generering av autoreaktive plasmaceller (28,33). De reduserte Tregs-verdiene i DLN-ene antydet at GC-responser kunne slippes løs i mus primet med BCGph og forsterket med hlFN-a 2b. I samsvar med fraværet av antigen stimulering, oppdaget vi ikke GC i DLN-ene til uinfiserte mus. Figur 5A. Små GC-er var tilstede i DLN-ene til uprimede mus, utfordret med MMLigure 5B).

Figur 5. BCGphipps-priming og hFN-a 2b-forsterkning påvirker GC-responser i DLN etter MLM-utfordring. Mus ble avlivet åtte uker etter utfordring med ML M. Drenerende lymfeknuter (DLNs) ble farget med antistoffspesifiserer prolifererende cellekjerneantigen (PCNA, røde kjerner), peanøttagglutinin (PNA, grønn) og CD45R (B22{{13 }}, hvit) for å identifisere GC-er som inneholder kompakte klynger av PCNA*PNA pluss *B220lav GC B-celler. GC B-celler i DL Ns av (A) uprimede og uutfordrede mus; (B) mus inokulert med PBS og utfordret med MLM; (C) mus primet med BCGph og utfordring med MLM; (D) mus forsterket intramuskulært med hlFN-a 2b og utfordret med MLM; (E) mus primet med BCGphboosted med hlFN-a 2b, og utfordret med ML M; (F) GC ble målt i individuelle DL Ns av eksperimentelle mus beregne den gjennomsnittlige GC-størrelsen. Målestokk=100 um.=6 mus/gruppe. " p < 0.05, * p < 0.005; *** y < 0.0005 ble ansett for å være statistisk signifikant.

Figur 5. BCGphipps-priming og hlFN-a 2b-forsterkning påvirker GC-responser i DLN etter ML M-utfordringen. Mus ble avlivet åtte uker etter utfordring med ML M. Drenerende lymfeknuter (DLNs) ble farget med antistoffer spesifikke for prolifererende cellekjerneantigen (PCNA, røde kjerner), peanøttagglutinin (PNA, grønn) og CD45R (B22{{ 13}}, hvit) for å identifisere GC-er som inneholder kompakte klynger av PCNAPNA pluss pluss B220lav GC B-celler. GC B-celler i DL Ns av (A) uprimede og uutfordrede mus; (B) mus inokulert med PBS og utfordret med MLM; (C) mus primet med BCGph og utfordret med MLM; (D) mus boostet intramuskulært med hlFN-a 2b og utfordret med MLM; (E) mus primet med BCGphboosted med hlFN-a 2b, og utfordret med MLM; (F) GC ble målt i individuelle DLN-er av eksperimentelle mus for å beregne gjennomsnittlig GC-størrelse. Målestokk=100 um. 1=6 mus/gruppe. " y < 0.05. * y < 0.005, *** y < 0.0005 ble ansett for å være statistisk signifikant.

Interessant nok hadde mus primet med BCGph betydelig større GC-er enn mus utfordret med MLM (Figur 5C). Musene immunisert med hlFN-a 2b (figur 5D) hadde GCs med en sammenlignbar størrelse som de hos mus utfordret med MLM. Musene primet med BCGph og forsterket med hlFN-a 2b hadde GC-er med en mellomstørrelse (figur 5E). For å ha en mer kvantitativ vurdering av GC-svarene i DLN-ene, beregnet vi den gjennomsnittlige GC-størrelsen i individuelle DLN-seksjoner. I samsvar med våre observasjoner fant vi en betydelig reduksjon i den gjennomsnittlige GC-størrelsen i DLN-ene etter hlFN-a 2b-injeksjon og i BCGph-priming/hIFN-a 2b-forsterkningsprotokollen (figur 5E).

3.6. Sammenlignbare nivåer av glykolipidspesifikke antistoffer hos mus utsatt for M. lepraemurium etter BCGphipps-priming og hIFN- 2b-forsterkning

I henhold til forskjellene observert i GC-dannelse og organisering, målte vi konsentrasjonen av antistoffer spesifikke for glykolipider ekstrahert fra MLM. Globalt viser resultatene våre at de systemiske mengdene av forskjellige klasser og isotyper av glykolipidspesifikke antistoffer ikke ble påvirket av vaksinasjon, suksessiv administrering av hIFN- 2b eller BCGph priming/hIFN- 2b-protokollen ( Tabell 2). Mus som kun ble forsterket med hIFN- 2b fremkalte en høyere mengde IgG- og IgG1-antistoffer i serumet. Imidlertid var IgG og Ig G1 antistoffnivåer ikke statistisk signifikante sammenlignet med de andre eksperimentelle gruppene (tabell 2).

4. Diskusjon

I denne studien har vi vist at vår prime-boosting-protokoll basert på subkutan BCGphipps-priming og suksessiv intramuskulær boosting med økende mengder hIFN- 2b beskyttet mus mot intradermal utfordring med MLM.

Den prime-boosting-protokollen forhindret MLM-vekst i huden og forbedret lokal patologi ved å redusere NT-produksjonen og nøytrofil betennelse (figur 3E). Det resulterte også i induksjon av antiinflammatoriske cytokiner (IL-4 og IL-10) som sannsynligvis motvirket overdreven betennelse i huden og manifesterte seg systemisk. Uventet, selv om det terapeutiske regimet reduserte CD3 pluss FOXP3 pluss tregs i DLN-ene (Figur 4E), ble ikke GC-responsene drastisk forbedret (Figur 5E), og serumkonsentrasjonene av glykolipidspesifikke antistoffer var like i alle eksperimentelle grupper unntatt i mus som kun er inokulert med hIFN- 2b (tabell 2). Ikke desto mindre støtter våre eksperimentelle data den potensielle bruken av BCG-priming adjuvant med intramuskulær IFN 2b-boosting, som en lovende immunterapi som fortjener utforskning ved menneskelig spedalskhet.

De kliniske manifestasjonene av spedalskhet korrelerer med det immunologiske spekteret påvist hos pasienter og varierer fra LL til TT [2,4,14,18]. Generelt kjennetegnes vertsimmunitet mot M. leprae hovedsakelig av en polarisert T-hjelperrespons (Th1/Th2). På den ene siden av spekteret, selv om LL er preget av energi, er det fortsatt en viss reaktivitet mot mykobakterielle antigener og produksjon av IL-4 og IL-10. I motsetning til dette, i TT, fører en dominerende Th1-respons til den IFN-drevne aktiveringen av makrofager, som akselererer elimineringen av basillene. Mus infisert med MLM utvikler typisk lepromatøslignende spedalskhet uten en klar dominans for humoral eller cellulær immunitet [18–20].

Beskyttende antistoffer fremkalt av infeksjon eller vaksinasjon [63] produseres ved en prosess som kalles affinitetsmodning, som finner sted i germinale sentre dannet i sekundære (milt, lymfeknuter) eller tertiære lymfoide organer (TLO) generert i perifert vev [23,25] . Det er nettopp i GCene hvor produksjonen av minne B-celler og langlivede antistoff-utskillende plasmaceller bidrar til generering av langsiktig immunitet mot fremtidige møter med patogener. Den effektive induksjonen av GC-responser avhenger av samarbeidet mellom flere celletyper, inkludert B-celler, T-follikulære hjelpeceller (TFH), tingible kroppsmakrofager og follikulære dendritiske celler (FDCs) [64]. Faktisk utløser vaksiner vellykkede GC-responser, og ektopiske germinale sentre i lymfeknuter [24,25,31,49].

Dessuten opprettholder T-follikulære hjelpeceller og T-follikulære regulatoriske celler [27–30] den delikate balansen mellom induksjon av effektive antistoffresponser og autoimmunitet. Selv om vi ikke utelukket autoimmunitetsinduksjon i studien vår, fokuserte vi fortsatt på effektene av prime-boost-protokollen med BCGph og hIFN- 2b på Tregs fra DLN-ene. Beskyttede mus hadde betydelig færre CD3 pluss FOXP3 pluss tregs i DLN-ene. Det kreves imidlertid ytterligere studier for å avgjøre om noen av disse tregene er T-follikulære hjelpeceller som regulerer GC-reaksjoner [27–30]. Disse resultatene kan antyde at effektiv induksjon av beskyttende immunitet kombinert med en liten reduksjon av tregs i DLN-ene er nødvendig for å kontrollere mykobakteriell vekst og for å forhindre patologisk betennelse i huden.

Tidligere studier har rapportert de systemiske og mukosale effektene av type I IFN på T-follikulære hjelpeceller og T-follikulære regulatoriske celler [19,32,64]. Faktisk øker type I IFN indirekte TFH i lymfeknuter ved å stimulere T-celle-priming av dendritiske celler [34]. Type I IFN fremmer også isotypebytte i GC-er. I tillegg viste en nylig studie at type I IFN utløser den CXCL13-drevne dannelsen av TLO i lungene [49].

Dermed kan induksjonen av CXCL13 av type I IFN øke rekrutteringen av naive B-celler til sekundære lymfoide organer og øke produksjonen av antistoff-utskillende plasmaceller, globalt forbedre langvarig hukommelse og plasmacellers immunologiske responser [23–25,64 ], spesielt i nærvær av adjuvanser som poly IC [65]. I tillegg induserer type I IFN-administrasjon GC-dannelse i lungene til pasienter som er plaget av autoimmune sykdommer [31] eller tuberkulose [66,67]. Dermed kan CXCL13-blokade hjelpe til med å behandle disse kroniske inflammatoriske lidelsene [49]. I denne sammenhengen observerte vi en veldig mild reduksjon i GC-størrelsen i DLN-er av beskyttede prime-forsterkede mus (Figur 5E). Ytterligere forskning er imidlertid nødvendig for å bedre definere korrelasjonen mellom GC-dannelse og beskyttelsen indusert i de prime-forsterkede musene. Under de eksperimentelle innstillingene for priming med BCGph og intramuskulær hIFN- 2b boosting (51), opplevde musene i vår studie høyere beskyttelse ved BCGph-hIFN- 2b (80 prosent) administrering enn ved BCGph alene (60 prosent), som bestemt av fraværet eller den lille størrelsen på hudlesjonene (figur 2) og en sammenlignbar mengde IgG- og IgG1-antistoffer spesifikke for glykolipider av MLM (tabell 2). Resultatene våre står i kontrast til den økte mengden IgG hos mus beskyttet av vaksinasjon med en annen BCG-stamme (Pasteur) [41]. Disse dataene tyder på at typen BCG-stamme som brukes til å formulere vaksinen kan påvirke utfallet av den humorale immunresponsen mot MLM eller M. leprae [51].

Videre har flere studier i tuberkulose vist de potensielle og gunstige effektene av den heterologe prime-boost-strategien i induksjon av beskyttende immunrespons [68–70]. Dessuten er det velkjent at typen og ruten for immunisering påvirker omfanget av antistoffet og cellulære immunresponser. Overraskende nok viser beskyttede mus signifikant høyere IL-4 og IL-10 i serum sammenlignet med mus behandlet kun med PBS, BCGph eller hIFN- 2b alene (tabell 1). Hvordan antiinflammatoriske cytokiner påvirker beskyttende immunitet ved spedalskhet er for tiden under undersøkelse i vårt laboratorium. Imidlertid har flere studier vist at effektiv cellulær immunitet mot mykobakterier er avhengig av en delikat balanse mellom beskyttelse og forebygging av patologi [71]. I tillegg er det bevis på induksjon av begge cytokintyper i andre eksperimentelle modeller [72–75].

Våre samlede resultater tyder på at suksessen til prime-boost-protokollen vår avhenger av induksjonen av en balansert immunrespons som effektivt eliminerer MLM i huden og begrenser vevsskade ved å indusere anti-inflammatoriske cytokiner (IL-4 og IL10) som beskytter sannsynligvis immunceller [76,77]. Faktisk modulerer IL-10 produsert av induserte Tregs betennelse ved slimhinneoverflater, spesielt de som er relatert til inflammatorisk tarmsykdom [77,78]. Disse funnene garanterer en detaljert kinetisk studie av B-celleaktivering, GC-dannelse og -regulering, generering av T-follikulære regulatoriske celler og NF-KB-aktivering i vårt prime-boost-system med BCGph og hIFN- 2b etterfulgt av MLM-infeksjon for å ha en mer mekanistisk forståelse av rollene til immunceller og NF-KB-veier i induksjonen av beskyttende immunitet i huden og lymfeknuter etter MLM-utfordring.

5. Konklusjoner

Fra disse dataene kan vi konkludere at den påfølgende intramuskulære boostingen med hIFN- 2b forbedrer M. bovis BCG-vaksinasjon, beskytter mot intradermal utfordring med MLM og avslører de lovende adjuvansegenskapene til human IFN-a 2b i sammenheng med BCG vaksinasjon for å forhindre spedalskhetsinfeksjoner i endemiske områder. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om den terapeutiske effekten av BCGphipps i kombinasjon med en farmasøytisk presentasjon av hIFN- 2b i en preklinisk modell av spedalskhetslignende sykdom.

Forfatterbidrag:

Studiedesign, GGG, OR-E., SOI-T. og JR-M.; studiegjennomføring, GGG, OR-E., SOI-T. og JR-M.; dataanalyse: GGG, OR-E., SOI-T. og JR-M.; datatolkning, GGG, OR-E., SOI-T. og JR-M.; utkast til manuskript, GGG, OR-E., SOI-T. og JR-M.;revidering av manuskriptinnhold, GGG, OR-E., SOI-T. og JR-M.; GGG, OR-E., SOI-T. og JR-M. ta ansvar for integriteten til dataanalysen. Alle forfattere har lest og godtatt den publiserte versjonen av manuskriptet.

Finansiering:

GGG og OR-E. ble støttet av SNI, CONACYT (Mexico City, Mexico). GGG fikk støtte fra Perfil Prodep 2019–2022, og JR-M. ble støttet av interne midler fra Department of Medicine University of Rochester Medical Center og RO1AI111914.

Uttalelse fra institusjonell revisjonskomité:

Alle dyreforsøk ble utført etter godkjenning av Institutional Animal Care and Management Committee (ZOO-010-2020). CIE-ENCB ZOO 016/2014, 7. mars 2014.

Erklæring om informert samtykke:

Ikke aktuelt.

Datatilgjengelighetserklæring:

Data vil bli delt etter institusjonelle retningslinjer.

Anerkjennelser:

Vi er takknemlige til Ricardo Villalobos for hjelp med IHC, og Rogelio Hernandez Pando (INCMNSZ, Mexico City), som ga BCGphipps-stammen.

Interessekonflikter:

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Referanser

1. HVEM. Verdens helseorganisasjon: Tuberkulose—Globale fakta 2011/2102. Genève: WHO Stop TB Dep. 2012. Tilgjengelig på nettet: http://www.who.int/tb/publications/2011/factsheet_tb_2011.pdf (åpnet 1. februar 2021).

2. Fin, PE spedalskhet: Hva blir "eliminert"? Okse. Verdens helseorgan. 2007, 85, 1–2. [CrossRef]

3. Rambukkana, A. Hvordan målretter Mycobacterium leprae det perifere nervesystemet? Trender Microbiol. 2000, 8, 23–28. [CrossRef]

4. Rodriguez, JIA; Triellato, GL; Meirelles, NML; Teixeira, CC; Lyon, S.; Esteves, ARM Klassifiseringsmetoder for spedalskhet: En sammenlignende studie i en henvisningskarakter i Brasil. Int. J. Infect. Dis. 2016, 45, 118–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Geluk, A.; van der Ploeg, J.; Teles, OBR; Kees, L.; Franken, MC; Prins, C.; Wouter, DJ; Sarno, NE; Sampaio, EP; Otenhoff, THM Rasjonell kombinasjon av peptider avledet fra forskjellige Mycobacterium leprae-proteiner forbedrer følsomheten for immundiagnose av M. leprae-infeksjon. Clin. Vacc. Immunol. 2008, 15, 522–533. [CrossRef] [PubMed]

6. Geluk, A.; Bobosha, K.; Schip, JJVDP-V.; Spencer, JS; Banu, S.; Martins, MVSB; Cho, SN; Franken, KLMC; Kim, HJ; Bekele, Y.; et al. Nye biomarkører med relevans for spedalskhetsdiagnose som kan brukes i områder som er hyperendemiske for spedalskhet. J. Immunol. 2012, 188, 4782–4791. [CrossRef]

7. Geluk, A. Biomarkører for spedalskhet: Vil du foretrekke T (celler)? Lepr. Rev. 2013, 84, 3–12. [CrossRef] [PubMed]

8. Alcaïs, A.; Alter, A.; Antoni, G.; Orlova, M.; Nguyen, VT; Singh, M.; Vanderborght, PR; Katoch, K.; Mira, MT; Vu, HT; et al. Trinnvis replikering identifiserer en lavproduserende lymfotoksinallel som en viktig risikofaktor for tidlig debut av spedalskhet. Nat. Genet. 2007, 39, 517–522. [CrossRef] [PubMed]

9. Avanzi, C.; Singh, P.; Truman, RW; Suffys, PN Molekylær epidemiologi av spedalskhet: En oppdatering. Infisere. Genet. Evol. 2020, 86, 104581. [CrossRef]

10. Lastoria, JC; Abreu, MA Spedalskhet gjennomgang av epidemiologiske kliniske og etnopatogene aspekter-del 1. Bras. Dermatol. 2014, 89, 205–218. [CrossRef]

11. Rojas-Espinosa, O. Aktuelle emner om profiler av vertsimmunologisk respons på mykobakterielle infeksjoner; Gjennomgå bok; Tomioka, H., red.; Forskningsveiviser: Trivandrum, India, 2009; s. 97–140.

12. Adams, LB; Pena, TM; Sharma, R.; Hagge, AD; Schurr, E.; Truman, RW Innsikt fra dyremodeller om immunogenetikken til spedalskhet. En anmeldelse. Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 2012, 107, 197–208. [CrossRef]

13. Rojas-Espinosa, O.; Becerril-Villanueva, E.; Wek-Rodriguez, K.; Arce-Paredes, P.; Reyes-Maldonado, E. Parese av de bakre lemmer hos Mycobacterium lepraemurium-infiserte mus skyldes beinskade og ikke fra nervepåvirkning. Clin. Exp. Immunol. 2005, 140, 436–442. [CrossRef]

14. Modlin, LR Den medfødte immunresponsen ved spedalskhet. Curr. Opin. Immunol. 2010, 22, 48–54. [CrossRef]

15. Oliveira, RB; Ochoa, MT; Sieling, PA; Rea, TH; Rambukkana, A.; Sarno, EN; Modlin, RL Uttrykk av tolllignende reseptor 2 på menneskelige Schwann-celler: En mekanisme for nerveskade ved spedalskhet. Infisere. Immun. 2003, 71, 1427–1433. [CrossRef] 16. MacMicking, J.; Xie, QW; Nathan, C. Nitrogenoksid og makrofagfunksjon. Annu. Rev. Immunol. 1997, 15, 323–350. [CrossRef]

17. Evans, T.; Buttery, L.; Carpenter, A.; Springall, DR; Polak, J.; Cohen, J. Cytokinbehandlede humane nøytrofiler inneholder induserbar nitrogenoksidsyntase som produserer nitrering av inntatte bakterier. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 9553–9554. [CrossRef] [PubMed]

18. Fonseca, AB; Simon, MD; Cazzaniga, RA; de Moura, TR; de Almeida, RP; Duthie, MS; Reed, SG; de Jesus, AR Påvirkningen av medfødte og adaptive immunresponser på de differensielle kliniske resultatene av spedalskhet. Infisere. Dis. Fattigdom 2017, 6, 5–13. [CrossRef] [PubMed]

19. Sadhu, S.; Khaitan, BK; Joshi, B.; Sengupta, U.; Nautiyal, AK; Mitra, DK Gjensidighet mellom regulatoriske T-celler og Th17-celler: Relevans for polarisert immunitet ved spedalskhet. PLoS Negl. Trop. Dis. 2016, 10, e0004338. [CrossRef] [PubMed]

20. Rojas-Espinosa, O.; Wek-Rodríguez, K.; Arce-Paredes, P. Effekten av eksogen peroksidase på utviklingen av murin spedalskhet. Int. J. Lepr. Andre Mycobact. Dis. 2002, 70, 191–200.

21. Ischiropoulos, H. Biologisk tyrosinitrering: en patofysiologisk funksjon av nitrogenoksid og reaktive oksygenarter. Arch. Biochem. Biofys. 1998, 356, 1–11. [CrossRef]

22. Ungt, DB spedalskhetslipid gir nøkkelen til Schwann-celleinntreden. Trender Microbiol. 2001, 9, 52–54. [CrossRef]

23. Bannard, O.; Cyster, JG Germinal-sentre: Programmert for affinitetsmodning og antistoffdiversifisering. Curr. Opin. Immunol. 2017, 45, 21–30. [CrossRef] [PubMed] 24. Victora, DG; Nussenweig, MC Germinal sentre. Annu. Rev. Immunol. 2012, 30, 429–457. [CrossRef] [PubMed]

25. Cirelli, KM; Crotty, SH Germinal senterforbedring ved utvidet antigentilgjengelighet. Curr. Opin. Immunol. 2017, 47, 64–69. [CrossRef]

26. Good-Jacobson, KL; Szumilas, CG; Chen, L.; Sharpe, AH; Tomayko, MM; Shlomchik, MJ PD-1 regulerer overlevelse av kimsenter B-celler og dannelsen og affiniteten til langlivede plasmaceller. Nat. Immunol. 2010, 11, 535–542. [CrossRef]

27. Wollenberg, I.; Agua-Doce, A.; Hernández, A.; Almeida, C.; Oliveira, VG; Faro, J.; Graca, L. Regulering av Germinal Center Reaction av Foxp3 pluss follikulære regulatoriske T-celler. J. Immunol. 2011, 187, 4553–4560. [CrossRef] [PubMed]

28. Litterman, MA; Pierson, W.; Lee, SK; Kallies, A.; Kawamoto, S.; Rayner, TF; Srivastava, M.; Divekar, DP; Beaton, L.; Hogan, JJ; et al. FOXP3 pluss follikulære regulatoriske T-celler kontrollerer responsen fra germinalsenteret. Nat. Med. 2011, 17, 975–982. [CrossRef]

29. Miles, B.; Connick, E. Kontroll av germinalsenteret ved hjelp av follikulære regulatoriske T-celler under infeksjon. Front. Immunol. 2018, 9, 2704–3710. [CrossRef]

30. Fu, W.; Liu, X.; Lin, X.; Feng, H.; Sun, L.; Li, S.; Chen, H.; Tang, H.; Lu, L.; Jin, W.; et al. Mangel på T-follikulære regulatoriske celler fremmer autoimmunitet. J. Exp. Med. 2018, 215, 815–825. [CrossRef]

31. Pitzalis, C.; Jones, GW; Bombardieri, M.; Jones, SA Ektopiske lymfoid-lignende strukturer ved infeksjon, kreft og autoimmunitet. Nat. Rev. Immunol. 2014, 14, 447–462. [CrossRef]

32. Aloulou, M.; Carr, EJ; Gador, M.; Bignon, A.; Liblau, RS; Fazilleau, N.; Linterman, MA Follikulære regulatoriske T-celler kan være spesifikke for det immuniserende antigenet og stamme fra naive T-celler. Nat. Commun. 2016, 7, 10579–10589. [CrossRef]

33. Vinuesa, CG; Sanz, I.; Cook, MC Dysregulering av germinale sentre ved autoimmun sykdom. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 845–857. [CrossRef]

34. Cucak, H.; Yrlid, U.; Reizis, B.; Kalinke, U.; Johansson-Lindborn, B. Type I Interferon-signalering i dendrittiske celler stimulerer utviklingen av lymfeknute-residente T-follikulære hjelpeceller. Immunitet 2009, 31, 491–501. [CrossRef]

35. Desvignes, L.; Wolf, AJ; Ernst, JD Dynamiske roller av type I og type II IFNs i tidlig infeksjon med Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 2012, 188, 6205–6215. [CrossRef]

36. Teles, MBR; Graeber, GT; Krutzik, RS; Montoya, D.; Schenk, M.; Lee, JD; Komisopoulou, E.; Kelly-Scumpia, K.; Chun, R.; Iyer, SS; et al. Type I interferon undertrykker type II interferon-utløste humane antimykobakterielle responser. Science 2013, 339, 1448–1453. [CrossRef]

37. Ji, DX; Yamashiro, LH; Chen, KJ; Mukaida, N.; Kramnik, I.; Darwin, KH; Vance, RE Type I interferon-drevet mottakelighet for Mycobacterium tuberculosis er mediert av IL-1Ra. Nat. Microbiol. 2019, 4, 2128–2135. [CrossRef]

38. Manca, C.; Tsenova, L.; Bergtold, A.; Freeman, SH; Tovey, M.; Musser, MJ; Barry, EM, 3.; Freedman, HV; Kaplan, G. Virulens av et klinisk isolat fra Mycobacterium tuberculosis hos mus bestemmes ved manglende evne til å indusere Th1-type immunitet og er assosiert med induksjon av IFN-/. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 98, 5752–5757. [CrossRef] [PubMed]

39. Telesca, C.; Angelico, M.; Piccolo, P.; Nosotti, L.; Morrone, A.; Longhi, C.; Carbone, M.; Baiocchi, L. Interferon-alfa-behandling av hepatitt D induserer tuberkuloseforverring hos en innvandrer. J. Infect. 2007, 54, e223–e226. [CrossRef] [PubMed]

40. Giacomini, E.; Remoli, ME; Gafa, V.; Pardini, M.; Fattorini, L.; Coccia, EM IFN- forbedrer BCG-immunogenisitet ved å virke på DC-modning. J. Leukoc. Biol. 2008, 85, 462–468. [CrossRef] [PubMed]

41. Rivas-Santiago, CE; Guerrero, GG IFN- Forsterkning av Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Güerin-vaksine fremmet Th1-type cellulær respons og beskyttelse mot M. tuberculosis-infeksjon. BioMed Res. Int. 2017, 2017, 6760. [CrossRef]

42. Guerrero, GG; Rangel-Moreno, J.; Islas-Trujillo, S.; Rojas-Espinosa, O. Successive Intramuscular Boosting with IFN-Alpha Protects Mycobacterium bovis BCG-vaksinerte mus mot M. lepraemurium-infeksjon. BioMed Med. Res. Int. 2015, 2015, 414027.

43. McNab, F.; Mayer-Barber, K.; Sher, A.; Wack, A.; O'Garra, A. Type I interferon ved infeksjonssykdommer. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 67–103. [CrossRef]

44. O'Shea, JJ; Visconti, R. Type I IFNs og regulering av TH1-responser: Enigmas både løst og dukket opp. Nat. Immunol. 2000, 1, 17–19. [CrossRef]

45. González-Navajas, JM; Lee, J.; David, M.; Raz, E. Immunmodulerende funksjoner av type I-interferoner. Nat. Rev. Immunol. 2012, 12, 125–135. [CrossRef]

46. ​​Le Bon, A.; Tøft, DF Type I interferon som en stimulans for krysspriming. Cytokin Growth Fact Rev. 2008, 19, 33–40. [CrossRef]

47. Bracci, L.; Canini, I.; Puzelli, S.; Sestili, P.; Venditti, M.; Spada, M.; Donatelli, I.; Belardelli, F.; Proietti, E. Type I IFN er en kraftig slimhinneadjuvans for en selektiv intranasal vaksinasjon mot influensavirus hos mus og påvirker antigenfangst på slimhinnenivå. Vaksine 2005, 23, 2994–3004. [CrossRef]

48. Sofa, RB; Atmar, RL; Cate, TR; Quarles, JM; Keitel, WA; Arden, NH; Wells, J.; Niño, D.; Wyde, PR Kontrasterende effekter av type I interferon som slimhinneadjuvans for influensavaksine hos mus og mennesker. Vaksine 2009, 27, 5344–5348. [CrossRef] [PubMed]

49. Denton, AE; Innocentin, S.; Carr, EJ; Bradford, BM; Lafouresse, F.; Mabbott, NA; Mörbe, U.; Ludewig, B.; brudgom, JR; Good-Jacobson, KL; et al. Type I interferon induserer CXCL13 for å støtte dannelse av ektopisk germinal senter. J. Exp. Med. 2019, 216, 621–637. [CrossRef]

50. Toledo, PTG; Batista-Silva, LR; Medeiros, RCA; Lara, FA; Moraes, MO Type I-interferoner, autofagi og vertsmetabolisme ved spedalskhet. Front. Immunol. 2018, 23, 806–817. [CrossRef]

51. Zhang, W.; Zhang, Y.; Zheng, H.; Pan, Y.; Liu, H.; Du, P.; Wan, L.; Liu, J.; Zhu, B.; Zhag, G.; et al. Genomsekvensering og analyse av BCG-vaksinestammer. PLoS ONE 2013, 8, e071243. [CrossRef]

52. Wek-Rodriguez, K.; Silva-Miranda, M.; Arce-Paredes, P.; Rojas-Espinosa, O. Effekt av reaktive oksygenformidlere på levedyktigheten og smitteevnen til Mycobacterium lepraemurium. Int. J. Exp. Pathol. 2007, 88, 137–145. [CrossRef]

53. Kim, SH; Cohen, B.; Novick, D.; Rubinstein, M. Pattedyr type I interferonreseptorer består av to underenheter: IFN-R1 og IFN-R2. Gene 1997, 196, 279–286. [CrossRef]

54. Luo, Y.; Chen, X.; Han, RA; O'Donnell, M. Rekombinant basill Calmette-Guérin (BCG) som uttrykker humant interferon-alfa 2B demonstrerer forbedret immunogenisitet. Clin. Exp. Immunol. 2001, 123, 264–270. [CrossRef] [PubMed]

55. Sun, E.; Nian, X.; Liu, C.; Fan, X.; Han, R. Konstruksjon av rekombinant humant IFN -2b BCG og dets antitumoreffekter på blærekreftceller in vitro. Genet. Mol. Res. 2015, 14, 3436–3449. [CrossRef] [PubMed]

56. Prabhakaran, K.; Harris, EB; Kirchheimer, WF Binding av 14C-merket dopa av Mycobacterium leprae in vitro. Int. J. Lepr. Andre Mycobact. Dis. 1976, 44, 58–64.

57. Draper, P. Purification of Mycobacterium leprae. I Proceedings of Annex 4 of Report of the Fifth Meeting of the Scientific Working Group on the Immunology of Lepra (IMMLEP), Genève, Sveits, 24.–26. juni 1980; Verdens helseorganisasjon: Genève, Sveits, 1980.

58. Ischiropoulos, H.; Nelson, J.; Duran, D.; Al-Mehdi, A. Reaksjoner av nitrogenoksid og peroksynitritt med organiske molekyler og pepperrotperoksidase: Interferens med bestemmelsen av hydrogenperoksid. Free Radic. Biol. Med. 1996, 20, 373–381. [CrossRef]

59. Schön, T.; Hernandez-Pando, R.; Negesse, Y.; Leekassa, R.; Sundqvist, T.; Britton, S. Uttrykk av induserbar nitrogenoksidsyntase og nitrotyrosin i borderline spedalskhetslesjoner. Br. J. Dermatol. 2001, 145, 809–815. [CrossRef]

60. Silva-Miranda, M.; WeK-Rodriguez, K.; Martinez, CE; Rojas-Espinosa, O. Uttrykk av cyklooksygenase-2, alfa-1-syreglykoprotein og induserbar nitrogenoksidsyntase i utviklende lesjoner av murin spedalskhet. Int. J. Exp. Sti. 2006, 87, 485–494. [CrossRef]

61. Hernández-Pando, R.; Schön, T.; Orozco, EH; Serafín, T.; Estrada-Garcia, I. Uttrykk av induserbar nitrogenoksidsyntase og nitrotyrosin under utviklingen av eksperimentell lungetuberkulose. Exp. Giftig. Pathol. 2001, 53, 257–265. [CrossRef]

62. Izcue, A.; Coombes, JL; Powrie, F. Regulerende lymfocytter og tarmbetennelse. Annu. Rev. Immunol. 2009, 27, 313–338. [CrossRef]

63. Sakaguchi, S.; Miyara, M.; Costantino, CM; Hafler, DA FOXP3 pluss regulatoriske T-celler i det menneskelige immunsystemet. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 490–500. [CrossRef]

64. Plotkin, SA Korrelater av beskyttelse indusert av vaksinasjon. Clin. Vaksine Immunol. 2010, 17, 1055–1065. [CrossRef] [PubMed]

65. Wu, H.; Chen, Y.; Liu, H.; Xu, L.-L.; Teuscher, P.; Wang, S.; Lu, S.; Dent, AL Follikulære regulatoriske T-celler undertrykker cytokinproduksjon av follikulære hjelper-T-celler og optimerer IgG-responser hos mus. Eur. J. Immunol. 2016, 46, 1152–1161. [CrossRef] [PubMed]

66. Jeyanathan, M.; Damjanovic, D.; Shaler, CR; Reir.; Wortzman, M.; Yin, C.; Zganiacz, A.; Lichty, D.; Xing, Z. Differensielt påtrykt medfødt immunitet ved mucosal boost vaksinasjon bestemmer antituberkulose immunbeskyttelsesresultater, uavhengig av T-celle immunitet. Slimhinneimmunol. 2013, 6, 612–625. [CrossRef] [PubMed]

67. Jeyanathan, M.; Shao, Z.; Yu, X.; Harkness, R.; Jiang, R.; Li, J.; Xing, Z.; Zhu, T. AdHu5Ag85A Respiratorisk mucosal boost immunisering forbedrer beskyttelsen mot lungetuberkulose hos BCG-primede ikke-menneskelige primater. PLoS ONE 2015, 10, e0135009. [CrossRef]

68. Afhami, S.; Drumond, VA; D'Agositnio, MR; Jeyanathan, M.; Gillgrass, A.; Xing, Z. Fremme immunterapeutiske vaksinestrategier mot lungetuberkulose. Front. Immunol. 2020, 11, 557809. [CrossRef]

69. Torrado, E.; Robinson, RT; Cooper, AM Cellulær respons på mykobakterier: balansering av beskyttelse og patologi. Trender Immunol. 2011, 32, 66–72. [CrossRef]

70. Xu, X.; Gao, W.; Cheng, S.; Yin, D.; Li, F.; Wu, Y.; Sun, D.; Zhou, S.; Wang, D.; Zhang, Y.; et al. Anti-inflammatoriske og immunmodulerende mekanismer av atorvastatin i en murin modell av traumatisk hjerneskade. J. Neuroinflamm. 2017, 14, 167–182. [CrossRef]

71. Azeem, W.; Maukon, BR; Appel, S.; Maegrete, AO; Kalland, KH Doble pro- og anti-inflammatoriske egenskaper ved monocytavledede dendritiske celler. Front. Immunol. 2020, 11, 438–453. [CrossRef]

72. Sultana, S.; Bishay, B. Nøytralisering av TNFR-1 og TNFR-2 modulerer S. aureus-indusert septisk artritt ved å regulere nivåene av pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske cytokiner under utviklingen av sykdommen. Immunol. Lett. 2018, 196, 33–51. [CrossRef]

73. Pornografi, D.; Gilligan, MM; Huang, S.; Gartung, A.; Cortes-Puch, I.; Sime, PJ; Phipps, RP; Serhan, CHN; Hammock, BD Betennelsesoppløsning: En todelt tilnærming til å avverge cytokinstormer i COVID-19 Cancer Metastasis Rev. 2020, 39, 337–340. [CrossRef]

74. Longhi, MP; Trumpfheller, C.; Idoyaga, J.; Caskey, M.; Matos, I.; Kluger, C.; Salazar, AM; Colonna, M.; Steinman, RM Dendrittiske celler krever en systemisk type I interferonrespons for å modne og indusere CD4 pluss Th1-immunitet med poly IC som adjuvans. J. Exp. Med. 2009, 206, 1589–1602. [CrossRef]

75. Khader, SA; Guglani, L.; Rangel-Moreno, J.; Gopal, R.; Junecko, BAF; Fountain, JJ; Martino, C.; Pearl, JE; Tighe, M.; Lin, Y.-Y.; et al. IL-23 er nødvendig for langsiktig kontroll av Mycobacterium tuberculosis og B-cellefollikkeldannelse i den infiserte lungen. J. Immunol. 2011, 187, 5402–5407. [CrossRef] [PubMed]

76. Choreño-Parra, JA; Bobba, S.; Rangel-Moreno, J.; Ahmed, M.; Mehra, S.; Rosa, B.; Martin, J.; Mitreva, M.; Kaushal, D.; Zúñiga, J.; et al. Mycobacterium tuberculosis HN878-infeksjon induserer menneskelignende B-cellefollikler hos mus. J. Infect. Dis. 2020, 221, 1636–1646. [CrossRef] [PubMed]

77. Schmidt, EG; Haribhai, D.; Williams, JB; Aggarwal, P.; Jia, S.; Charbonnier, LM; Yan, K.; Lorier, R.; Turner, A.; Ziegelbauer, J.; et al. IL-10 produsert av iTreg-celler kontrollerer kolitt og patogen eks. Treg-celler under immunterapi. J. Immunol. 2012, 189, 5628–5648. [CrossRef]

78. Rubtsovo, YP; Rasmussen, JP; Chi, Y.; Fontenot, J.; Castelli, I.; Ja, X.; Treuting, P.; Siewe, I.; Roers, A.; Henderson, WRJ; et al. Regulatorisk T-celle-avledet interleukin-10 begrenser betennelse ved miljøgrensesnitt. Immunitet 2018, 28, 546–558. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com