ISG15-avhengig aktivering av sensoren MDA5 motvirkes av SARS-CoV-2 Papain-lignende protease for å unngå verts medfødt immunitet
Nov 08, 2023
Aktivering av de RIG-I-lignende reseptorene, retinsyreinduserbart gen I (RIG-I) og melanomdifferensieringsassosiert protein 5 (MDA5) etablerer en antiviral tilstand ved å oppregulere interferon (IFN)-stimulerte gener (ISG). Blant disse er ISG15, hvis mekanistiske roller i medfødt immunitet fortsatt er gåtefulle. I denne studien rapporterer vi at ISG15-konjugering er avgjørende for antivirale IFN-responser mediert av den virale RNA-sensoren MDA5. ISGylering av kaspaseaktiverings- og rekrutteringsdomenene til MDA5 fremmer oligomeriseringen og utløser derved aktivering av medfødt immunitet mot en rekke virus, inkludert koronavirus, flavivirus og picornavirus. Den ISG15-avhengige aktiveringen av MDA5 antagoniseres gjennom direkte de-ISGylering mediert av den papainlignende proteasen til SARS-CoV-2, et nylig oppstått koronavirus som har forårsaket COVID-19-pandemien . Arbeidet vårt viser en avgjørende rolle for ISG15 i den MDA5-mediert antivirale responsen og identifiserer også en sentral immununnvikelsesmekanisme for SARS-CoV-2, som kan være målrettet for utvikling av nye antivirale midler og vaksiner for bekjempe covid-19.
cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet
Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter
【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Viral forstyrrelse av vertens immunhomeostase overvåkes av det medfødte immunsystemet, som er avhengig av reseptorer som registrerer fare- eller patogenassosierte molekylære mønstre (PAMPs) 1–3. De RIG-I-lignende reseptorene (RLR) RIG-I og MDA5 er sentrale for virusdeteksjon ved å kartlegge cytoplasmaet for virale eller vertsavledede immunstimulerende RNA4. Bindingen av RNA til det C-terminale domenet (CTD) og helikase til RIG-I og MDA5 fører til deres signal-primede konformasjon som muliggjør rekruttering av flere enzymer5. Disse enzymene modifiserer RLR-er på flere domener og steder, og post-translasjonelle modifikasjoner (PTM-er) er spesielt godt studert for caspase-aktiverings- og rekrutteringsdomenene (CARDs), signalmodulene. Proteinfosfatase 1 (PP1) / defosforylerer RIG-I- og MDA5-KORTENE6. Når det gjelder RIG-I, fremmer defosforylering Lys63-koblet polyubiquitinering av CARD-ene av TRIM25 (tredelt motiv som inneholder 25) og andre E3-ligaser7,8, som stabiliserer den oligomere formen av RIG-I, og dermed muliggjør mitokondriell antiviral -signalerende protein (MAVS) binding. Sammenlignet med de for RIG-I, er de individuelle trinnene i MDA5-aktivering og kritiske PTM-er mindre godt forstått. RLR-aktivering induserer produksjonen av type I og III IFN-er som igjen forplanter antiviral signalering ved å oppregulere ISGs9,10. Blant disse er ISG15, et ubiquitin-lignende protein som kan kovalent konjugeres til lysinrester av målproteiner, en PTM-prosess kalt ISGylation11. Selv om ISG15-konjugering har blitt anerkjent for å virke antiviralt12, er mekanismer for vertsprotein ISGylering som kan forklare den brede antivirale restriksjonsaktiviteten til ISG15 foreløpig ukjent. Årsaken til den pågående COVID-19-pandemien, alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SCoV2), tilhører Coronaviridae-familien som inneholder flere andre menneskelige patogener. Koronavirus har en eksepsjonell evne til å undertrykke IFN-mediert antiviral respons, og lav IFN-produksjon hos SCoV2-infiserte pasienter korrelert med alvorlig sykdom13. Blant de koronavirale IFN-antagonistene er den papainlignende proteasen (PLpro) som har deubiquitinerende og de-ISGylerende aktiviteter14,15. I denne studien identifiserer vi en viktig rolle for ISGylering i MDA5-aktivering. Vi viser videre at SCoV2 PLpro interagerer med MDA5 og antagoniserer ISG15-avhengig MDA5-aktivering via aktiv de-ISGylering, og avslører at SCoV2 allerede har utviklet seg for å unnslippe immunovervåking av MDA5.
Resultater
MDA5, men ikke RIG-I, signalering krever ISG15.
For å identifisere PTM-er for MDA5-KORTENE som kan regulere MDA5-aktivering, utsatte vi affinitetsrenset MDA5–2CARD smeltet til glutation-S-transferase (GST–MDA5–2CARD), eller GST alene, for væskekromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (LC) –MS/MS), og fant at spesifikt GST–MDA5–2CARD ble renset sammen med ISG15, som dukket opp som to bånd som migrerte saktere (med ~15 og 30 kDa) enn umodifisert GST–MDA5– 2CARD (utvidet data) Fig. la). Immunoblotting (IB) bekreftet at GST–MDA5–2CARD er modifisert av ISG15 (Utvidede data Fig. 1b). Vi bestemte deretter relevansen av ISG15 for MDA5-indusert signalering. Mens FLAG-MDA5-ekspresjon i villtype (WT) muse-embryonale fibroblaster (MEF-er) induserte IFN-budbringer-RNA og protein samt Ccl5-transkripter på en doseavhengig måte, førte FLAG-MDA5-ekspresjon i Isg15-/- MEF til ablated antiviralt gen og proteinekspresjon (fig. la og utvidede data fig. 1c). Tilsvarende ble antiviral geninduksjon sterkt redusert i ISG15 knockout (KO) HeLa (menneskelige) celler sammenlignet med WT kontrollceller (fig. 1b og utvidet data fig. 1d), utelukker en artsspesifikk effekt. Derimot induserte FLAG-RIG-I sammenlignbare mengder utskilt IFN-protein samt Ifnb1- og Ccl5-transkripsjoner i Isg15-/- og WT MEF-er (fig. 1a og utvidede data, fig. 1c). IFNB1- og CCL5-transkripter samt IFN-proteinproduksjon ved FLAG–RIG-I var like eller svakt forbedret i ISG15 KO HeLa-celler sammenlignet med WT-celler (fig. 1b og utvidede data, fig. 1d), i samsvar med tidligere rapporter om at ISGylering var negativt påvirker RIG-I-signalering16,17
Fig. 1|ISGylering er nødvendig for MDA5, men ikke RIG-I, signalering. a,b, ELISA av IFN- fra supernatanter av MEF (WT eller Isg15−/−) (a) og HeLa-celler (WT eller ISG15 KO) (b) transient transfektert med økende mengder FLAG-merket MDA5 eller RIG-I for 40 t. Helcellelysater (WCL) ble probet av IB med anti-ISG15, anti-FLAG og anti-aktin (belastningskontroll). c, ELISA av IFN- fra supernatanter av WT eller Isg15−/− MEF som ble simulert stimulert eller transfektert med EMCV RNA (0.1 eller 0.4 µg ml−1), HMW-poly (I: C) (0,5 µg ml−1 ) eller RABVLe (1 pmol ml−1 ), eller infisert med SeV (10 hemagglutinasjonsenheter (HAU) ml−1 ) i 24 h. d, RT–qPCR-analyse av Ifnb1, Ccl5 og Tnf mRNA i WT og Isg15−/− MEF stimulert som i c. e, IRF3-fosforylering i WCL-ene til NHLF-er som ble transfektert med de indikerte siRNA-ene i 30 timer og deretter spottstimulert eller transfektert med EMCV RNA (0,4 µg ml−1) eller RABVLe (1 pmol ml−1) i 6 timer, vurdert av IB med anti-pSer396-IRF3 og anti-IRF3. f, ELISA av IFN- fra supernatanter av NHLF som ble transfektert med de angitte siRNAene i 30 timer og deretter spottstimulert eller transfektert med EMCV RNA (0,4 µg ml−1) eller RABVLe (1 pmol ml−1), eller infisert med SeV (10 HAU ml−1) i 16 timer. g, ELISA av IFN- fra supernatantene til PBMC-er som ble transdusert i 40 timer med de indikerte lentivirale shRNA-partiklene og deretter infisert med mutEMCV (MOI=10) eller SeV (200 HAU ml−1) i 8 timer. h, RT–qPCR-analyse av IFNA2 og IL-6 mRNA i PBMC-er som ble transdusert og infisert som i g. Data representerer minst to uavhengige eksperimenter med lignende resultater (gjennomsnitt ± sd av n= 3 biologiske replikater i a–d og f, og gjennomsnitt av n= 2 biologiske replikater i g og h). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.
Vi testet deretter effekten av ISG15-gensletting på aktiveringen av endogen MDA5 og RIG-I av deres respektive ligander. IFN-produksjon samt IFNB1-, CCL5- og TNF-genekspresjon indusert av transfeksjon av encefalomyocarditis virus (EMCV) RNA eller høymolekylært (HMW)-poly(I:C), som begge hovedsakelig detekteres av MDA5, ble sterkt svekket i Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa og ISG15 KO HAP-1 celler sammenlignet med deres respektive kontrollceller (fig. 1c,d og utvidede data fig. 1e–g). Viktigere er at ablasjonen av antiviral geninduksjon av EMCV RNA eller HMW-poly(I:C) i ISG15 KO-celler ikke skyldtes opphevet MDA5-genekspresjon; tvert imot ble MDA5-mRNA-ekspresjon forbedret i ISG15 KO-celler sammenlignet med WT-celler (Utvidede data Fig. 1f,g). I motsetning til stimulering med MDA5-agonister, førte stimulering av Isg15−/− MEFs og ISG15 KO HeLa-celler ved rabiesvirusleder RNA (RABVLe) transfeksjon eller Sendai virus (SeV) infeksjon, som er RIG-I stimuli, til IFN-produksjon og antiviralt genuttrykk sammenlignbart med WT-celler (fig. 1c,d og utvidede data, fig. 1e). For å utelukke potensielle klonale effekter som kan være assosiert med ISG15-gen-slettede celler, utførte vi forbigående gendempende eksperimenter i primære normale humane lungefibroblaster (NHLF). ISG15-demping, lik MDA5 knockdown, førte til et nesten fullstendig tap av fosforylering av IFN-regulatorisk faktor 3 (IRF3) – et kjennetegn på RLR-signalaktivering – etter stimulering med EMCV RNA, men ikke RABVLe ished IFN-produksjon så vel som antiviral transkriptekspresjon i NHLF-er transfektert med EMCV-RNA, men ikke i celler stimulert med RABVLe eller SeV (fig. 1f og utvidede data, fig. 1h). Liten hårnål (sh)RNA-mediert demping av ISG15 eller MDA5 i primære humane perifere mononukleære blodceller (PBMCs) reduserte også betydelig antiviralt protein og transkripsjonsuttrykk etter infeksjon med en rekombinant mutant EMCV (mutEMCV) mangelfull i MDA5-antagonisme18,19, sammenlignet med infiserte PBMC-er transdusert med ikke-målrettet kontroll-shRNA (fig. 1g, h og utvidede data fig. 1i). Derimot påvirket ikke ISG15- eller MDA5-uttømming cytokinresponser i PBMC-er etter SeV-infeksjon (fig. 1g, h og utvidede data fig. 1i). Disse resultatene viser at ISG15 er avgjørende for immunsignalering av MDA5, men ikke RIG-I. MDA5-KORTene er ISGylert ved Lys23 og Lys43.
cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret
For å bekrefte MS-analysen vår som identifiserte MDA5–2CARD ISGylering, testet vi først om endogen MDA5 også er modifisert av ISG15. Endogent MDA5 ble robust ISGylert i celler transfektert med HMW-poly(I:C), eller infisert med dengue-virus (DENV) eller Zika (ZIKV)-virus som registreres av MDA5 (ref. 5) (fig. 2a). Spesielt ble endogen MDA5 også ISGylert i uinfiserte celler, selv om det var på svært lave nivåer (Utvidede data Fig. 2a), noe som stemmer overens med tidligere funn om at mange vertsproteiner også ISGyleres ved lave nivåer under normale (uinfiserte) forhold20. I celler behandlet med anti-IFNAR2 for å blokkere IFNAR-signal-mediert ISG-oppregulering, førte ISG15- eller MDA5-demping til en sammenlignbar reduksjon av IFNB1-genuttrykk etter mutEMCV-infeksjon (utvidet data fig. 2b), noe som indikerer at ISG15-avhengig MDA5-signalering skjer selv i fravær av IFNAR-signalering.
t MDA5Δ2CARD (inneholder helicase og CTD), er det primære stedet for MDA5 ISGylering som viser to fremtredende bånd for ISGylated 2CARD (fig. 2b). Rekonstituering av ISG15 KO HeLa-celler med enten WT ISG15, eller en ukonjugerbar ISG15-mutant der de to glysinene som trengs for konjugering ble erstattet med alanin (ISG15-AA)21, viste kovalent ISG15-konjugering (fig. 2c) . Mutasjon av individuelle lysinrester i GST–MDA5–2CARD til arginin avslørte at enkeltstedsmutasjon av Lys23 og Lys43 reduserte ISGylering merkbart (Utvidede data Fig. 2c), mens deres kombinerte mutasjon (Lys23Arg/Lys43Arg) nesten opphevet ISGylering (Fig. 2d) ). Full-lengde FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg viste også markant redusert ISGylering (fig. 2e og utvidede data fig. 2d); den gjenværende ISGyleringen sett i FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg skyldes sannsynligvis ytterligere mindre steder i 2CARD og/eller Δ2CARD. Merk at Lys23Arg/Lys43Arg-mutasjonen ikke påvirket MDA5–2CARD SUMOylation5 (utvidet data fig. 2e). Videre, mens RIG-I–2CARD var robust ubiquitinert (som representerer kovalent Lys63-linked ubiquitination7), viste verken MDA5–2CARD WT eller Lys23Arg/Lys43Arg-mutanten påvisbare nivåer av ubiquitinering (utvidet data fig. 2f). Samlet indikerer disse resultatene at MDA5-KORTENE gjennomgår ISGylering på to hovedsteder, Lys23 og Lys43.
KORT ISGylering er nødvendig for MDA5-aktivering.
Når de sammenlignet deres signaltransduserende evne, viste MDA5–2CARD Lys23Arg og Lys43Arg enkeltstedsmutanter delvis redusert IFN-promoteraktivering sammenlignet med WT MDA5–2CARD, mens Lys23Arg/Lys43Arg-mutanten hadde en dypt redusert signalaktivitet, som var nesten like sterk som for de signaleringsdefekte mutantene Ser88Glu og Ser88Asp6 (utvidet data fig. 2g). Derimot viste en mutant der Lys68, som er lysinresten som er mest proksimal til Lys43 og Lys23, substituert med arginin (Lys68Arg) sammenlignbar ISG15-konjugering og signalkompetanse med WT 2CARD (Utvidet data Fig. 2c,g). MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, i motsetning til WT MDA5–2CARD, klarte heller ikke å indusere IRF3-dimerisering (Utvidede data Fig. 2h). FLAG–MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg eller Lys23Arg/Lys43Arg viste også reduserte, eller nesten opphevede, IFN-promoter-aktiverende evner, sammenlignet med FLAG–MDA5 WT (fig. 2f). MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg viste en dyp signaldefekt selv når den ble uttrykt i høye mengder, mens WT MDA5 induserte antivirale transkripsjoner på en doseavhengig måte (fig. 2g). I samsvar var STAT1-fosforylering, et kjennetegn på IFNAR-signalering, samt ISG-proteinekspresjon sterkt indusert av MDA5 WT, men ikke Lys23Arg/Lys43Arg (fig. 2h). Komplementering av MDA5-genredigerte humane astrocytter (SVGAer) med MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg eller Ser88Glu førte til sterkt reduserte IFNB1-, CCL5- og ISG-transkripter sammenlignet med celler som uttrykker WT MDA5 (fig. 2i og utvidede 2i-data) . Disse resultatene viser at ISGylering ved Lys23 og Lys43 er avgjørende for MDA5-mediert cytokinrespons.
cistanche fordeler for menn styrker immunforsvaret
Defosforylering av PP1 regulerer MDA5 ISGylering.
I likhet med RIG-I, er MDA5 fosforylert i CARD-ene i uinfiserte celler, noe som forhindrer autoaktivering; defosforylering av RIG-I og MDA5 av PP1 / er avgjørende for å frigjøre RLR-er fra deres signal-undertrykte tilstander6,22–24. Defosforylering av RIG-I tillater Lys{10}}koblet ubiquitinering av CARD-ene, noe som fremmer RIG-I-multimerisering og signalering5. Detaljene om hvordan CARD-defosforylering (ved Ser88) utløser MDA5-aktivering har forblitt unnvikende, og derfor testet vi om defosforylering regulerer MDA5 ISGylering. Demping av PP1 / sterkt redusert MDA5–2CARD ISGylering (utvidet data fig. 3a). Videre hadde de fosfomimetiske Ser88Glu- og Ser88Asp-mutantene redusert ISGylering, mens fosfo-null-Ser88Ala-mutanten viste sterkere ISGylering enn WT MDA5–2CARD (utvidet data fig. 3b). Motsatt hadde MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg sammenlignbar Ser88-fosforylering (utvidet data fig. 3c). Sammen antyder disse dataene at MDA5-defosforylering ved Ser88 går foran CARD ISGylering. Vi brukte deretter meslingviruset V-protein (MeV-V), som antagoniserer MDA5 Ser88-defosforylering gjennom PP1 / antagonisme25. MeV-V-ekspresjon forbedret Ser88-fosforyleringen (indikerende på ablatert defosforylering) av GST – MDA5 – 2CARD eller FLAG – MDA5 på en doseavhengig måte, som tidligere vist25. Forbedret fosforylering ved MeV-V korrelert med en nedgang i ISGylering (Utvidet data Fig. 3d,e). I motsetning til WT MeV-V, viste en mutant MeV-V som har opphevet PP1-binding og MDA5-defosforyleringsantagonisme (MeV-VΔtail)25, liten effekt på MDA5–2CARD ISGylering (utvidet data) Fig. 3f), som styrker inhiberingen av ISGylering som primært skyldes PP1-hemming, og ikke andre antagonistiske effekter, av MeV-V. V-proteinene fra Nipah- og Hendra-virusene (NiV-V og HeV-V) forbedret også MDA5 Ser88-fosforylering og tilsvarende dempet MDA5 ISGylering (Utvidet data Fig. 3g,h), noe som tyder på at flere paramyxovirale V-proteiner hemmer MDA5 ISGylering gjennom manipulasjon av Ser88-fosforylering, selv om de nøyaktige mekanismene for individuelle V-proteiner gjenstår å bestemme. Til sammen antyder disse dataene at MDA5 CARD ISGylering er avhengig av defosforylering ved Ser88.
ISGylering fremmer MDA5-sammenstillinger av høyere orden.
RLR-aktivering krever RNA-binding, RLR-oligomerisering og deres translokasjon fra cytosol til mitokondrier for interaksjon med MAVS5. For å belyse mekanismen som ISGylering påvirker MDA5-aktivitet med, undersøkte vi først om ISGylering påvirker RNA-binding. Endogen MDA5 renset fra WT eller Isg15−/− MEFs interagerte like godt med HMW-poly(I:C) in vitro (utvidet data fig. 4a). MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg viste sammenlignbar binding til HMW-poly(I:C), noe som indikerer at ISGylering ikke påvirker RNA-bindingsevnen til MDA5 (utvidet data fig. 4b). Da vi overvåket translokasjonen av MDA5 fra cytosol til mitokondrier etter EMCV RNA-stimulering, fant vi at ISG15-demping, men ikke so.C-transfeksjon, opphevet MDA5-translokasjon (fig. 3a). I motsetning til dette var RIG-I-translokasjon etter RABVLe-transfeksjon effektiv i både ISG15-depleted og si. C-transfekterte celler (fig. 3b). Disse dataene indikerte at ISGylering regulerer MDA5-translokasjon eller et trinn oppstrøms for den. Siden cytosol-til-mitokondrier-translokasjonen av MDA5 krever interaksjon med 14-3-3η26, sammenlignet vi 14-3-3η-binding av WT og mutant MDA5. Evnen til MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg til å binde 14-3-3η var lik den til WT MDA5 eller Lys68Arg-mutanten (utvidet data fig. 4c). Mens EMCV RNA-stimulering effektivt induserte MDA5-oligomerisering i WT MEF-er, ble dannelsen av MDA5-oligomerer fjernet i ISG-15--mangelfulle MEF-er (fig. 3c). ISG15 knockdown i 293T-celler opphevet også oligomeriseringen av FLAG–MDA5–2CARD (fig. 3d). Motsatt, samuttrykk av ISGyleringsmaskinkomponentene, Ube1L og UbcH8, forbedret MDA5–2CARD-oligomeriseringen sterkt i si. C-transfekterte celler, men ikke i ISG15-utarmede celler (fig. 3d), noe som indikerer at ISGylering er nødvendig for MDA5-oligomerdannelse. Til støtte for dette konseptet viste FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg nesten opphevet oligomerisering, mens WT MDA5 oligomeriserte effektivt (fig. 3e). Vi sammenlignet også effekten av Lys23 Arg/Lys43Arg-mutasjonen med effekten av oligomeriseringsforstyrrende mutasjoner som lokaliserer enten til grensesnittet mellom MDA5-monomerer og hindrer RNA-bindingsmediert MDA5-filamentering (Ile841Arg/Glu842Arg og Asp848Ala/Phe849,8a,Phe849,88) eller til KORTENE (Gly74Ala/Trp75Ala) og forstyrre 2CARD-oligomerisering27. I motsetning til WT MDA5, viste Lys23Arg/Lys43Arg-mutanten, lik MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala, mangelfull oligomerisering og, i samsvar med dette, opphevet IFN-promoter-aktiverende evne (fig. 3f, g). Introduksjon av Lys23Arg/Lys43Arg i Ile841Arg/Glu842Arg- eller Asp848Ala/Phe849Ala-bakgrunnen, som begge i seg selv reduserte MDA5-oligomerisering og signalering, opphevet også MDA5-oligomerdannelse og IFN-induksjon (fig. 3f). Ettersom LGP2 letter MDA5-kjernedannelse på dobbelttrådet RNA og derved MDA5-oligomerisering29,30, sammenlignet vi LGP2-bindingen til MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg. MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg interagerte med LGP2 like effektivt som WT MDA5 (utvidet data fig. 4d), noe som styrker forslaget om at CARD ISGylering fremmer MDA5-oligomerisering uavhengig av RNA-bindingsmediert filamentering. Samlet fastslår disse resultatene at ISGylering letter CARD-oligomerisering og høyere-ordens MDA5-sammenstillinger.
Fig. 2|MDA5-aktivering krever ISGylering ved Lys23 og Lys43. en endogen MDA5 ISGylering i NHLF-er som ble mock-behandlet, transfektert med HMW-poly(I:C) (0.1 µg ml−1 ) i 40 timer (venstre) eller infisert med DENV eller ZIKV (MOI {{ 10}} for hver) i 48 timer (til høyre), bestemt av IP med anti-MDA5 (eller en IgG-isotypekontroll) og IB med anti-ISG15. b, ISGylering av FLAG-merket MDA5–2CARD og MDA5Δ2CARD i forbigående transfekterte HEK293T-celler som også uttrykte V5–ISG15, HA–Ube1L og FLAG–UbcH8, vurdert av FLAG PD og IB med anti-V5 ved 40 timer etter transfeksjon. c, Endogen MDA5 ISGylering i ISG15 KO HeLa-celler stabilt rekonstituert med vektor, WT ISG15 eller ISG15-AA og co-transfektert med HA–Ube1L og FLAG–UbcH8 etter IFN-behandling (1,000 U ml−1) i 24 timer, bestemt ved IP med anti-MDA5 og IB med anti-ISG15. d, ISGylering av GST–MDA5–2CARD WT og Lys23Arg/ Lys43Arg i HEK293T-celler som ble co-transfektert med V5–ISG15, HA–Ube1L og FLAG–UbcH8 i 24 timer, bestemt av GST PD og IB med anti-V5. e, ISGylering av FLAG–MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg i HEK293T-celler som ble co-transfektert med V5–ISG15, HA–Ube1L og FLAG–UbcH8, bestemt av FLAG PD og IB med anti-V5. f, IFN-luciferase-reporteraktivitet i HEK293T-celler som ble transfektert i 40 timer med vektor, FLAG-MDA5 WT eller mutanter. Luciferase-verdier presenteres som fold induksjon i forhold til verdiene for vektortransfekterte celler, satt til 1. WCL-er ble probet av IB med anti-FLAG og anti-aktin. g, RT–qPCR-analyse av IFNB1- og CCL5-mRNA i HEK293T-celler som var forbigående transfektert med enten vektor eller økende mengder FLAG–MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg. h, STAT1-fosforylering og ISG (IFIT1 og -2) proteinoverflod i WCL-ene til HEK293T-celler som var forbigående transfektert med vektor eller FLAG–MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, bestemt av IB. I, RT–qPCR-analyse av de indikerte antivirale genene i MDA5 KO SVGA-er som var forbigående rekonstituert med enten tom vektor eller FLAG-merket MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg eller Ser88Glu. Data representerer minst to uavhengige eksperimenter med lignende resultater (gjennomsnitt ± sd av n=3 biologiske replikater i f, g og i). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Fig. 3|CARD ISGylation fremmer dannelsen av høyere ordens MDA5-sammenstillinger. a,b, Cytosol-mitokondrier-fraksjonering av WCL-er fra NHLF-er som ble transfektert i 30 timer med ikke-målrettet kontroll-siRNA (si. C) eller ISG15--spesifikk siRNA (si.ISG15), og deretter mock-behandlet eller transfektert med EMCV RNA (0,4 µg ml−1) (a) eller RABVLe (1 pmol ml−1) (b) i 16 timer. IB ble utført med anti-MDA5 (a), anti-RIG-I (b), anti-ISG15 og anti-aktin (a og b). -Tubulin og MAVS fungerte som renhetsmarkører for henholdsvis den cytosoliske og mitokondriefraksjonen (a og b). c, Endogen MDA5-oligomerisering i WT og Isg15−/− MEF som ble transfektert med EMCV RNA (0,5 µg ml−1) i 16 timer, og vurdert ved SDD–AGE og IB med anti-MDA5. WCL-er ble videre analysert ved SDS-PAGE og undersøkt av IB med anti-MDA5 og anti-aktin. d, Oligomerisering av FLAG–MDA5–2CARD i HEK293T-celler som ble transfektert med de angitte siRNA-ene, enten med eller uten HA–Ube1L og FLAG–UbcH8 i 48 timer, bestemt av NativePAGE og IB med anti-FLAG. WCL-er ble videre analysert ved SDS-PAGE og undersøkt av IB med anti-FLAG, anti-HA, anti-ISG15 og anti-aktin. e, Oligomerisering av FLAG–MDA5 WT og Lys23Arg/Lys43Arg i forbigående transfekterte MDA5 KO HEK293-celler, vurdert ved SDD–AGE og IB med anti-FLAG. WCL-er ble videre analysert ved SDS-PAGE og IB med anti-FLAG og anti-aktin. f, Oligomerisering av FLAG-merket MDA5 WT og mutanter i forbigående transfekterte MDA5 KO HEK293-celler, vurdert av NativePAGE og IB med anti-MDA5. WCL-er ble videre analysert ved SDS-PAGE og undersøkt av IB med anti-MDA5 og anti-aktin. g, IFN-luciferase-reporteraktivitet i MDA5 KO HEK293-celler som ble transfektert i 24 timer med enten tom vektor eller FLAG-merket MDA5 WT eller mutanter. Luciferaseaktivitet presenteres som fold induksjon i forhold til verdiene for vektortransfekterte celler, satt til 1. Data representerer minst to uavhengige eksperimenter med lignende resultater (gjennomsnitt ± sd av n=3 biologiske replikater i g). ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
ISGyleringsavhengig MDA5-signalering begrenser virusreplikasjon.
Vi vurderte deretter om ISGylering av MDA5 er nødvendig for dens evne til å begrense virusreplikasjon. FLAG–MDA5 WT, men ikke Lys23Arg/Lys43Arg, hemmet kraftig (med ~2log) EMCV-replikasjon (fig. 4a). Tilsvarende begrenset MDA5 KO HEK293-celler rekonstituert med WT MDA5, men ikke celler komplementert med Lys23Arg/Lys43Arg-mutanten, effektivt DENV-replikasjon (fig. 4b). Vi rekonstituerte også MDA5 KO-astrocyte SVGA-er, en fysiologisk relevant celletype for ZIKV-infeksjon, med enten vektor, eller MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, og vurderte deretter ZIKV-replikasjon over et 40-t tidsforløp. ZIKV-replikasjon ble svekket ~100- ganger i celler rekonstituert med WT MDA5 sammenlignet med vektoruttrykkende celler. Derimot begrenset ikke celler komplementert med MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg ZIKV, i likhet med celler som uttrykker MDA5 Ser88Glu (fig. 4c). WT MDA5, men ikke Lys23Arg/Lys43Arg, begrenset også SCoV2-replikasjon, men i mindre grad enn det som ble sett for de andre testede virusene (fig. 4d).
Fig. 4|ISGylering er nødvendig for viral restriksjon av MDA5. EMCV-titere i supernatanten til HEK293T-celler som ble transfektert i 40 timer med enten vektor, eller FLAG–MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, og deretter infisert med EMCV (MOI=0.001) i 24 h, bestemt ved TCID50-analyse. b, prosentandel av DENV-infiserte MDA5 KO HEK293-celler som ble transfektert i 24 timer med enten vektor, eller FLAG–MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, og deretter spottbehandlet eller infisert med DENV (MOI=5) i 48 timer , vurdert av FACS ved bruk av anti-flavivirus E (4G2). SSC, sidespredning. c, ZIKV-titere i supernatanten av MDA5 KO SVGA-er som ble transfektert i 30 timer med vektor- eller FLAG-merket MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg eller Ser88Glu og deretter infisert med ZIKV (MOI=0.1) i de angitte tidene bestemt ved plakkanalyse. pfu, plakk-dannende enheter; hpi, timer etter infeksjon. d, SCoV2-titere i supernatanten til HEK293T–hACE2-celler som ble transfektert i 24 timer med enten tom vektor, eller FLAG–MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, og deretter infisert med SCoV2 (MOI=0.5) i 24 h, bestemt ved plakkanalyse. e, Skjematisk av den eksperimentelle tilnærmingen for å "frikoble" rollen til ISG15 i MDA5-mediert IFN-induksjon fra dens rolle i å dempe IFNAR-signalering. sup. supernatant. f, NHLF 'donor' celler ble transfektert i 40 timer med de angitte siRNAene og deretter infisert med mutEMCV (MOI=0.1) i 16 timer. Cellesupernatanter ble UV-inaktivert og overført til Vero-mottakerceller. Etter 24 timer ble cellene infisert med ZIKV (MOI=0.002–2) i 72 timer, og ZIKV-positive celler ble bestemt ved immunfarging med anti-flavivirus E (4G2) og TrueBlue peroksidase-substrat. g, RIG-I KO HEK293 'donor' celler ble transfektert med si. C eller si.ISG15 sammen med enten vektor eller FLAG–MDA5 WT eller Lys23Arg/Lys43Arg, i 24 timer, etterfulgt av EMCV-infeksjon (MOI=0.001) i 16 timer. UV-inaktiverte cellesupernatanter ble overført til Vero 'mottaker' celler i 24 timer, etterfulgt av infeksjon med EMCV (MOI=0.001–0.1) i 40 timer. EMCV-induserte cytopatiske effekter ble visualisert ved Coomassie Blue-farging. Data representerer minst to uavhengige eksperimenter med lignende resultater (gjennomsnitt ± sd av n= 3 biologiske replikater i a–d). *P< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
Vi bestemte deretter effekten av ISG15-demping på MDA5s evne til å hemme virusreplikasjon. Selv om MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg ikke klarte å undertrykke EMCV-replikasjon uavhengig av ISG15-demping, begrenset WT MDA5 effektivt EMCV-replikasjon i si. C-transfekterte celler og, uventet, også i ISG15-utarmede celler (utvidet data fig. 5a). I en undersøkelse av den underliggende mekanismen til disse uventede resultatene fant vi at de EMCV-infiserte cellene som uttrykte WT MDA5 hadde markert økte nivåer av ISG-proteinekspresjon når ISG15 ble stilnet sammenlignet med infiserte celler transfektert med WT MDA5 og si. C (Utvidet data Fig. 5b). Tilsvarende ble forhøyet ISG-transkript og proteinekspresjon observert i ISG-15--mangelfulle celler som ble transfektert med EMCV-RNA eller infisert med mutEMCV, til tross for opphevelse av IFN-induksjon (Utvidede data Fig. 5c,d). I kontrast opphevet MDA5-knockdown både IFN- og ISG-proteinekspresjon, som forventet (utvidet data fig. 5d). Vi la merke til at proteinoverfloden av USP18, et deubiquitinerende enzym som negativt regulerer IFNAR-signalering31, ble sterkt redusert i ISG15-utarmede celler etter EMCV-infeksjon sammenlignet med infiserte celler som ble transfektert med si. C eller MDA5-spesifikt siRNA (utvidet data fig. 5b,d), som er i samsvar med den rapporterte rollen til ISG15 for å forhindre nedbrytning av USP1832. Sammen antyder disse dataene at i eksperimentelle innstillinger for ISG15-genmålretting (det vil si silencing eller KO) er den antivirale effekten av MDA5 ISGylering maskert av avvikende ISG-oppregulering på grunn av ablasjonen av ISG15s hemmende effekt på IFNAR-signalering.
Fig. 5|SCoV2 PLpro binder seg til og de-ISGylates MDA5–2CARD. en båndrepresentasjon av krystallstrukturen til SCoV2 PLpro: ISG15-komplekset (Protein Data Bank, tilgangsnr. 6YVA). Nøkkelrester som medierer sted 1-interaksjon (Asn156 og Arg166/Glu167) eller sted 2-interaksjon (Phe69) i PLpro, så vel som dets katalytisk aktive sete (Cys111), er indikert. b, ISGylering av GST–MDA5–2CARD i HEK293T-celler som ble co-transfektert i 20 timer med vektor eller V5-merkede SCoV2 PLpro WT eller mutanter, sammen med FLAG–ISG15, HA–Ube1L og FLAG–UbcH8, bestemt av GST PD og IB med anti-FLAG og anti-GST. WCL-er ble undersøkt av IB med anti-V5, anti-HA, anti-FLAG og anti-aktin. c, Binding av HA-merket MDA5 eller RIG-I til V5-merket SCoV2– PLpro eller FLAG-merket MeV-V (positiv kontroll) i forbigående transfekterte HEK293T-celler, bestemt av HA PD og IB med anti-V5 eller anti-FLAG, og anti-HA. WCL-er ble undersøkt av IB med anti-V5 og anti-FLAG. d, Oligomerisering av FLAG–MDA5–2CARD i HEK293T-celler som ble co-transfektert med vektor, eller V5-merket SCoV2 PLpro WT eller Cys111Ala i 24 timer, vurdert av NativePAGE og IB med anti-FLAG. WCL-er ble videre analysert med SDS-PAGE og undersøkt av IB med anti-FLAG, anti-V5 og anti-aktin. e, ISGylering av GST–MDA5–2CARD i HEK293T-celler som også uttrykte FLAG–ISG15, HA–Ube1L og FLAG–UbcH8, og ble co-transfektert i 40 timer med vektor eller den indikerte V5-merket koronaviral PLpro proteiner, bestemt av GST PD og IB med anti-FLAG, anti-V5 og anti-GST. Data representerer minst to uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Vi brukte deretter en virusbeskyttelsesanalyse som eksperimentelt kobler MDA5-signalering i virusinfiserte celler fra nedstrøms IFNAR-signalering i de samme cellene (fig. 4e). Supernatanter fra mutEMCV-infiserte 'donor' celler som enten var si. C transfektert, eller tømt for enten ISG15 eller MDA5, ble ultrafiolett (UV) inaktivert og deretter overført til uinfiserte "mottaker"-celler. 'Primede' mottakerceller ble deretter infisert med ZIKV for å direkte overvåke den antivirale effekten av MDA5-mediert IFN-produksjon av donorceller. Mens supernatantene fra si. C-transfekterte "donor"-celler hemmet ZIKV-replikasjon kraftig, og supernatantene fra ISG15 eller MDA5 knockdown-celler begrenset ZIKV-infeksjon minimalt (fig. 4f). Tilsvarende ble kultursupernatantene fra EMCV-infiserte donorceller transfektert med WT MDA5 sammen med si. C førte til større beskyttelse av mottakerceller fra virusutfordringen enn fra celler som uttrykker WT MDA5 og utarmet for ISG15 (fig. 4g). Samlet viser disse dataene at ISGylering er viktig for MDA5-mediert begrensning av en rekke RNA-virus.
Fig. 6|SCoV2 PLpro hemmer ISG15-mediert MDA5-signalering via dens de-ISGylase-aktivitet. a, RT–qPCR-analyse av IFNB1-, IFNL1-, ISG15-, MDA5- og RIG-I-transkripter i NHLF-er som ble transfektert med de angitte siRNA-ene i 40 timer og deretter transfektert med falsk RNA eller SCoV2-RNA (0,4 µg ml −1) i 24 timer. b, Binding av SCoV2 Nsp3 til endogen MDA5 i A549–hACE2-celler som ble infisert med SCoV2 (MOI=0.5) i 24 timer, bestemt av IP med anti-MDA5 (eller en IgG-isotypekontroll) etterfulgt av IB med anti-Nsp3 og anti-MDA5. WCL-er ble undersøkt av IB med anti-Nsp3 og anti-aktin. c, Endogen MDA5 ISGylering i A549–hACE2-celler som var falske infiserte eller infiserte med SCoV2 (MOI=0.5) i 40 timer i nærvær av PLpro-hemmer (GRL-0617; 50 µM) eller bærer kontroll (dimetylsulfoksid), bestemt av IP med anti-MDA5 (eller en IgG-isotypekontroll), etterfulgt av IB med anti-ISG15 og anti-MDA5. Proteinoverflod av IFIT1, RSAD2, ISG15 og aktin i WCL-ene ble undersøkt av IB. Effektiv virusreplikasjon ble verifisert av IB med anti-Nsp3 og anti-Spike (S). d, RT–qPCR-analyse av IFNB1-, CCL5- og IFIT1-transkripter, og EMCV genomisk RNA (gRNA), i HeLa-celler som ble forbigående transfektert i 24 timer med vektor, eller V5–SCoV2 PLpro WT eller mutanter, og deretter infisert med mutEMCV (MOI=0.5) i 12 timer. e, EMCV-titere i supernatanten til RIG-I KO HEK293-celler som ble transientert i 24 timer med vektor eller FLAG–MDA5, sammen med V5-merket SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala eller Arg166Ser/Glu167Arg og deretter infisert, med EMCV (MOI=0.001) i 16 timer, bestemt ved plakkanalyse. f, Proteinoverflod av de angitte ISG-ene i WCL-ene fra eksperimentet i e, bestemt av IB med de angitte antistoffene. Data representerer minst to uavhengige eksperimenter med lignende resultater (gjennomsnitt ± sd av n= 3 biologiske replikater i a, d og e). *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).
SCoV2 PLpro retter seg mot MDA5 for de-ISGylering.
Koronavirus som SARS-CoV (SCoV), MERS-CoV og den nylig fremkomne SCoV2 koder for en PLpro som medierer spaltning av viral polyprotein33. I tillegg har PLpro deubiquitinerende og de-ISGylerende aktiviteter. SCoV2 PLpro ble nylig vist å modulere antivirale responser primært via dens de-ISGylase-aktivitet15. Siden MDA5 er kjent for å være en viktig sensor for å oppdage koronavirus34,35, og fordi dataene våre viste at ISGylering er nødvendig for MDA{10}}mediert virusrestriksjon, undersøkte vi om SCoV2 PLpro enzymatisk fjerner MDA5 ISGylering for å motvirke medfødt immunitet. SCoV2 PLpro WT, men ikke dens katalytisk inaktive mutant (PLpro Cys111Ala)15, opphevet ISGyleringen av GST–MDA5–2CARD og FLAG–MDA5 (fig. 5a,b og utvidede data, fig. 6a). PLpro Asn156Glu- og Arg166Ser/Glu167Arg-mutantene, som er marginalt og alvorlig svekket i ISG15-binding ved "site 1"-grensesnittet, henholdsvis14,36, påvirket ISGylering litt eller ikke. I motsetning til dette ble PLpro Phe69Ala, der 'sted 2'-grensesnittet som fortrinnsvis bestemmer binding til ubiquitin, men ikke ISG15, forstyrret14,36, redusert MDA5 ISGylering like kraftig som WT PLpro (fig. 5a,b og utvidede data fig. 6a ). SCoV2 PLpro undertrykte imidlertid ikke RIG-I–2CARD ubiquitinering (utvidet data fig. 6b). Vi fant at PLpro interagerte spesifikt med MDA5, men ikke RIG-I, det samme gjorde MeV-V som binder MDA5 og fungerte som en kontroll37 (fig. 5c). Lave mengder PLpro hemmet signalering av MDA5, men ikke RIG-I, mens høyere mengder PLpro undertrykte antiviral signalering av begge RLR-er (utvidet data, fig. 6c). Dette styrker MDA5 som et direkte mål for PLpro. De-ISGylering av IRF3 står sannsynligvis for den hemmende effekten som høyere doser av PLpro har på RLR-signalering15,38. Når man undersøkte effekten av PLpro på MDA5–2CARD-oligomerisering, blokkerte PLpro WT, men ikke Cys111Ala, MDA5–2CARD-oligomerisering effektivt (fig. 5d), noe som indikerer at SCoV2 PLpro hemmer den ISGyleringsavhengige MDA5-oligomer-aktiviteten via dens enzymatiske aktivitet. PLpro-enzymene til de relaterte -coronavirusene, SCoV, MERS–CoV og murint hepatittvirus (MHV), samt -coronaviruset HCoV-NL63 (NL63) bandt seg også til og reduserte effektivt MDA5–2CARD ISGylering (fig. 5e) , noe som antyder at MDA5-antagonisme av PLpro kan være mye bevart blant koronavirus.
cistanche planteøkende immunsystem
SCoV2 PLpro antagoniserer ISG15-avhengig MDA5-signalering.
Vi bestemte deretter relevansen av ISG15-avhengig MDA5-signalering for antiviral cytokininduksjon fremkalt av SCoV2. Siden SCoV2-infeksjon er kjent for å minimalt indusere type I IFN-er på grunn av effektive virale antagonismer39, isolerte vi totalt RNA fra SCoV2-infiserte celler og deretter re-transfekterte det inn i celler for å stimulere medfødt immunsignalering. SCoV2 RNA, men ikke RNA fra falske behandlede celler, induserte robust IFN-transkripter; denne induksjonen ble imidlertid markant redusert når ISG15 eller MDA5 ble dempet (fig. 6a). RIG-I knockdown påvirket ikke negativt det antivirale genuttrykket fremkalt av SCoV2 RNA, noe som indikerer at SCoV2 RNA-PAMP først og fremst registreres av ISG15-MDA5-aksen (fig. 6a).
Vi fant at SCoV2 ikke-strukturelt protein 3 (Nsp3), som PLpro ligger innenfor, lett interagerte med endogen MDA5 under autentisk SCoV2-infeksjon (fig. 6b). Endogen MDA5 ISGylering var upåviselig i SCoV2-infiserte celler, selv om viruset utløste ISG15-ekspresjon; I infiserte celler behandlet med en spesifikk PLpro-hemmer15, ble imidlertid MDA5 ISGylering og nedstrøms ISG-induksjon kraftig forbedret (fig. 6c), noe som støtter forslaget om at PLpro effektivt undertrykker MDA5 ISGylering og signalering under levende SCoV2-infeksjon. Vi undersøkte deretter effekten av WT og mutant PLpro på aktiveringen av endogen MDA5 under mutEMCV-infeksjon. I samsvar med deres effekt på MDA5 ISGylering (fig. 5b og utvidede data fig. 6a), forhindret SCoV2 PLpro WT og Phe69Ala antiviral transkripsjonsinduksjon, mens MDA5 Arg166Ser/Glu167Arg, som ligner på Cys111Ala-antivirusgenet, ikke påvirket (antiviral genuttrykk). 6d). I samsvar med dette ble mutEMCV-replikasjon forbedret i celler som uttrykker PLpro WT eller Phe69Ala, men ikke i celler som uttrykker PLpro Cys111Ala eller Arg166Ser/Glu167Arg (fig. 6d). På samme måte blokkerte WT PLpro, men ikke Arg166Ser/Glu167Arg- eller Cys111Ala-mutanten, EMCV-begrensning av FLAG-MDA5 (fig. 6e); effekten på virusreplikasjon korrelerte med induserte ISG-proteiner (fig. 6f). Samlet etablerer dette SCoV2 PLpro som en IFN-antagonist som aktivt de-ISGylates MDA5.
Diskusjon
ISG15-konjugering er kjent for å gi antiviral aktivitet til en mengde virus; Imidlertid er bare noen få ekte substrater identifisert12. På den annen side virker ISG15 i sin ukonjugerte form provisalt ved å forsterke USP18-mediert IFNAR-signalhemming31,32,40. Denne studien identifiserer en nøkkelrolle for ISGylering i MDA5-mediert IFN-induksjon. Vårt arbeid understreker også viktigheten av eksperimentell design der å frikoble rollen til ISG15 i MDA5-aktivering fra den i å dempe IFNAR-signalering er avgjørende for å avsløre ISG15s potente antivirale aktivitet. I en infisert organisme er det sannsynligvis summen av flere ISGyleringshendelser (som påvirker både verts- og virusproteiner) som bestemmer utfallet av infeksjon og patogenese, som kan være kontekstavhengig12.
Fordeler med cistanche tubulosa-styrke immunsystemet
Funnene våre indikerer at ISGylering av MDA5 virker analogt med Lys63-koblet ubiquitinering av RIG-I5: begge PTM-er (1) er regulert av PP1-indusert defosforylering og (2) fremmer CARD-oligomerisering og RLR høyere -bestille sammenstillinger. Imidlertid, mens ubiquitin er rikelig i både uinfiserte og infiserte celler, økes ISG15-ekspresjonen sterkt av IFN-stimulering. Ikke desto mindre, selv på basale nivåer, er ISG15 konjugert til mange vertsproteiner20, inkludert MDA5 som vårt arbeid viste, noe som kan være tilstrekkelig for initial MDA5-aktivering. Under virusinfeksjoner som registreres av flere PRR-er, kan MDA5 ISGylering være en "priming"-mekanisme der ISG15-oppregulering av en umiddelbar medfødt sensor (for eksempel RIG-I)41 primer MDA5 til å gå inn i en "kick-start"-modus. Ettersom ISG15 negativt regulerer RIG-I16,17, kan ISGylering utløse 'sensorbytte' der MDA5-aktivering fremmes når ISG15-nivåene øker, mens RIG-I-aktiviteten blir dempet. Vi identifiserte at SCoV2 PLpro antagoniserer MDA5 ISGylering via dens enzymatiske aktivitet etter binding til sensoren; denne strategien er sannsynligvis bevart blant koronavirus, noe som krever videre undersøkelse. Kryo-elektronmikroskopianalyser avslørte at koronaviral Nsp3 er en del av et porekompleks som spenner over endoplasmatiske retikulum-avledede dobbeltmembranvesikler og eksporterer nylig syntetisert viral RNA42. Dermed kan MDA5 plassere seg i umiddelbar nærhet til stedet for viral RNA-eksport for å lette PAMP-deteksjon; PLpro-domenet til Nsp3 (som er på den cytoplasmatiske siden) blokkerer imidlertid MDA5-signalering gjennom direkte de-ISGylering. Noen virus kan også hemme MDA5 ISGylering gjennom dysregulering av MDA5-fosforylering, som vist for MeV-V. Oppsummert avdekker studien vår en fremtredende rolle for ISGylering i aktivering av MDA5-mediert immunitet så vel som dens hemming av SCoV2, og avslører et potensielt molekylært mål for utformingen av terapeutika mot COVID-19.
Referanser
1. Liu, G. & Gack, MU Distinkte og orkestrerte funksjoner av RNA-sensorer i medfødte. Immunity 53, 26–42 (2020).
2. Wu, J. & Chen, ZJ Medfødt immunsansing og signalering av cytosoliske nukleinsyrer. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).
3. Chow, KT, Gale, M.Jr & Loo, YM RIG-I og andre RNA-sensorer i antiviral immunitet. Annu. Rev. Immunol. 36, 667–694 (2018).
4. Schlee, M. Master sensorer av patogent RNA-RIG-I-lignende reseptorer. Immunobiology 218, 1322–1335 (2013).
5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I-lignende reseptorer: deres regulering og roller i RNA-sensing. Nat. Rev. Immunol. 20, 537–551 (2020).
6. Wies, E. et al. Defosforylering av RNA-sensorene RIG-I og MDA5 av fosfatasen PP1 er avgjørende for medfødt immunsignalering. Immunity 38, 437–449 (2013).
7. Gack, MU et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase er avgjørende for RIG-I-mediert antiviral aktivitet. Nature 446, 916–920 (2007).
8. Chiang, C. & Gack, MU Post-translasjonell kontroll av intracellulære patogensansingsveier. Trender Immunol. 38, 39–52 (2017).
9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS Delte og distinkte funksjoner av type I og type III interferoner. Immunity 50, 907–923 (2019).
10. Schoggins, JW Interferon-stimulerte gener: hva gjør de alle? Annu. Rev. Virol. 6, 567–584 (2019).
11. Zhang, D. & Zhang, DE Interferon-stimulert gen 15 og protein-ISGyleringssystemet. J. Interferon Cytokine Res. 31, 119–130 (2011).
12. Perng, YC & Lenschow, DJ ISG15 i antiviral immunitet og utover. Nat. Rev. Microbiol. 16, 423–439 (2018). 13. Hadjadj, J. et al. Nedsatt type I interferonaktivitet og inflammatoriske responser hos alvorlige covid-19-pasienter. Science 369, 718–724 (2020).
14. Klemm, T. et al. Mekanisme og hemming av den papainlignende proteasen, PLpro, av SARS-CoV-2. EMBO J. 39, e106275 (2020).
15. Shin, D. et al. Papain-lignende protease regulerer SARS-CoV-2 viral spredning og medfødt immunitet. Nature 587, 657–662 (2020).
16. Kim, MJ, Hwang, SY, Imaizumi, T. & Yoo, JY Negativ tilbakemeldingsregulering av RIG-I-mediert antiviral signalering ved interferon-indusert ISG15-konjugering. J. Virol. 82, 1474–1483 (2008).
17. Du, Y. et al. LRRC25 hemmer type I IFN-signalering ved å målrette ISG15-assosiert RIG-I for autofagisk degradering. EMBO J. 37, 351–366 (2018).
18. Hato, SV et al. Te mengovirus lederprotein blokkerer interferon-alfa/beta-gentranskripsjon og hemmer aktivering av interferon regulatorisk faktor 3. Cellemikrobiol. 9, 2921–2930 (2007).
19. Deddouche, S. et al. Identifikasjon av en LGP2-assosiert MDA5-agonist i picornavirus-infiserte celler. eLife 3, e01535 (2014).
20. Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Te ISG15-konjugasjonssystem retter seg bredt mot nylig syntetiserte proteiner: implikasjoner for den antivirale funksjonen til ISG15. Mol. Cell 38, 722–732 (2010).
21. Lenschow, DJ et al. Identifikasjon av interferon-stimulert gen 15 som et antiviralt molekyl under Sindbis-virusinfeksjon in vivo. J. Virol. 79, 13974–13983 (2005).
22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU Fosforyleringsmediert negativ regulering av RIG-I antiviral aktivitet. J. Virol. 84, 3220–3229 (2010).
23. Nistal-Villan, E. et al. Negativ rolle for RIG-I serin 8-fosforylering i reguleringen av interferon-beta-produksjon. J. Biol. Chem. 285, 20252–20261 (2010).
24. Maharaj, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU Konvensjonell proteinkinase C-alfa (PKC-alfa) og PKC-beta regulerer negativt RIG-I antiviral signaloverføring. J. Virol. 86, 1358–1371 (2012).
25. Davis, ME et al. Antagonisme av fosfatase PP1 av meslingvirus V-protein er nødvendig for medfødt immunutslipp av MDA5. Cell Host Microbe 16, 19–30 (2014).
26. Lin, JP, Fan, YK & Liu, HM Te 14-3-3eta chaperone-protein fremmer antiviral medfødt immunitet ved å lette MDA5-oligomerisering og intracellulær omfordeling. PLoS Pathog. 15, e1007582 (2019).
27. Wu, B. et al. Strukturelt grunnlag for dsRNA-gjenkjenning, filamentdannelse og antiviral signalaktivering av MDA5. Cell 152, 276–289 (2013).
28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Cryo-EM-strukturer av MDA5-dsRNA-filamenter i forskjellige stadier av ATP-hydrolyse. Mol. Cell 72, 999–1012 (2018).
29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Den medfødte immunsensoren LGP2 aktiverer antiviral signalering ved å regulere MDA5–RNA-interaksjon og filamentsamling. Mol. Cell 55, 771–781 (2014).
30. Uchikawa, E. et al. Strukturell analyse av dsRNA-binding til antivirale mønstergjenkjenningsreseptorer LGP2 og MDA5. Mol. Cell 62, 586–602 (2016).
31. Malakhova, OA et al. UBP43 er en ny regulator av interferonsignalering uavhengig av dens ISG15 isopeptidaseaktivitet. EMBO J. 25, 2358–2367 (2006).
32. Zhang, X. et al. Human intracellulær ISG15 forhindrer interferon-alfa/beta-overamplifikasjon og auto-inflammasjon. Nature 517, 89–93 (2015).
33. Harcourt, BH et al. Identifikasjon av alvorlig akutt respiratorisk syndrom koronavirus replikaseprodukter og karakterisering av papainlignende proteaseaktivitet. J. Virol. 78, 13600–13612 (2004).
34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Murint coronavirus musehepatittvirus gjenkjennes av MDA5 og induserer type I interferon i hjernemakrofager/mikroglia. J. Virol. 82, 9829–9838 (2008).
35. Menachery, VD et al. Dempning og gjenoppretting av koronavirusmutant med alvorlig akutt respiratorisk syndrom som mangler 2′-O-metyltransferaseaktivitet. J. Virol. 88, 4251–4264 (2014).
36. Bekes, M. et al. Anerkjennelse av Lys48-koblet di-ubiquitin og deubiquitinerende aktiviteter av SARS coronavirus papain-lignende protease. Mol. Cell 62, 572–585 (2016).
37. Childs, K. et al. mda-5, men ikke RIG-I, er et vanlig mål for paramyxovirus V-proteiner. Virology 359, 190–200 (2007).
38. Shi, HX et al. Positiv regulering av interferon regulatorisk faktor 3 aktivering av Herc5 via ISG15 modifikasjon. Mol. Cell Biol. 30, 2424–2436 (2010).
39. Blanco-Melo, D. et al. Ubalansert vertsrespons på SARS-CoV-2 driver utviklingen av COVID-19. Celle 181, 1036–1045 (2020).
40. Speer, SD et al. ISG15-mangel og økt virusresistens hos mennesker, men ikke mus. Nat. Commun. 7, 11496 (2016).
41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. De essensielle, ikke-redundante rollene til RIG-I og MDA5 i å oppdage og kontrollere West Nile-virusinfeksjon. J. Virol. 87, 11416–11425 (2013).
42. Wolf, G. et al. En molekylær pore spenner over den doble membranen til koronavirusreplikasjonsorganellen. Science 369, 1395–1398 (2020).
43. Major, EO et al. Etablering av en linje med humane føtale gliaceller som støtter JC-virusmultiplikasjon. Proc. Natl Acad. Sci. USA 82, 1257-1261 (1985).
44. Hertzog, J. et al. Infeksjon med et brasiliansk isolat av Zika-virus genererer RIG-I-stimulerende RNA og det virale NS5-proteinet blokkerer type I IFN-induksjon og signalering. Eur. J. Immunol. 48, 1120–1136 (2018).
45. Cerikan, B. et al. Celle-iboende tilpasning som oppstår fra kronisk ablasjon av en nøkkel rho GTPase-regulator. Dev. Cell 39, 28–43 (2016).
46. Chan, YK & Gack, MU En fosfomimetisk-basert mekanisme for dengue-virus for å motvirke medfødt immunitet. Nat. Immunol. 17, 523–530 (2016).
47. Riedl, W. et al. Zika-virus NS3 etterligner et cellulært 14-3-3-bindingsmotiv for å antagonisere RIG-I- og MDA5-mediert medfødt immunitet. Cell Host Microbe 26, 493–503 (2019).
48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM STAT3 ubiquitylering og nedbrytning av kusmavirus undertrykker cytokin- og onkogensignalering. J. Virol. 77, 6385–6393 (2003).
49. Oudshoorn, D. et al. HERC6 er den viktigste E3-ligasen for global ISG15-konjugering i museceller. PLoS ONE 7, e29870 (2012).
50. Kim, DK et al. En omfattende, fleksibel samling av SARS-CoV-2-kodingsregioner. G3 (Bethesda) 10, 3399–3402 (2020).
51. Chiang, C. et al. Det humane papillomavirus E6 onkoproteinet retter seg mot USP15 og TRIM25 for å undertrykke RIG-I-mediert medfødt immunsignalering. J. Virol. 92, e01737-17 (2018).
52. Gack, MU et al. Roller til RIG-I N-terminal tandem CARD og spleisevariant i TRIM25-mediert antiviral signaltransduksjon. Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 16743–16748 (2008).
53. Chiang, JJ et al. Viral demaskering av cellulære 5S rRNA-pseudogentranskripsjoner induserer RIG-I-mediert immunitet. Nat. Immunol. 19, 53–62 (2018).
54. Sparrer, KMJ et al. TRIM23 medierer virusindusert autofagi via aktivering av TBK1. Nat. Microbiol. 2, 1543–1557 (2017).
