Isolering av et ekstrakt fra den myke korallsymbiotiske mikroorganismen Salinispora Arenicola som utøver cytobeskyttende og antialdringseffekter Del 1

Abstrakt: Celler har utviklet et svært integrert system som er ansvarlig for proteomstabilitet, nemlig proteostasenettverket (PN). Siden tap av proteostase er et kjennetegn på aldring og aldersrelaterte sykdommer, kan aktiveringen av PN-moduler sannsynligvis utvide helsespennet. Her presenterer vi data om bioaktiviteten til et ekstrakt (SA223-S2BM) renset fra stammen Salinispora arenicola TM223-S2 som ble isolert fra den myke korallen Scleronephthya lewinsohni; denne korallen ble samlet på en dybde på 65 m fra det mesofotiske Rødehavets økosystem EAPC (sør Eilat, Israel). Behandling av humane celler med SA223-S2BM-aktiverte proteostatiske moduler reduserte oksidativ belastning og ga beskyttelse mot oksidativt og genotoksisk stress. Videre forbedret SA223-S2BM proteasom- og lysosomal-kathepsin-aktivitetene i Drosophila-fluer og viste hudbeskyttende effekter som bevist ved effektiv hemming av hudens aldringsrelaterte enzymer, elastase og tyrosinase. Vi foreslår at SA223-S2BM-ekstraktet utgjør en sannsynlig lovende kilde for å prioritere molekyler med antialdringsegenskaper.

Glykosid av cistanche kan også øke aktiviteten til SOD i hjerte- og levervev, og redusere innholdet av lipofuscin og MDA i hvert vev betydelig, effektivt rense ulike reaktive oksygenradikaler (OH-, H₂O₂, etc.) og beskytte mot DNA-skader forårsaket av OH-radikaler. Cistanche-fenyletanoidglykosider har en sterk renseevne for frie radikaler, en høyere reduserende evne enn vitamin C, forbedrer aktiviteten til SOD i sædsuspensjon, reduserer innholdet av MDA og har en viss beskyttende effekt på sædmembranfunksjonen. Cistanche-polysakkarider kan øke aktiviteten til SOD og GSH-Px i erytrocytter og lungevev hos eksperimentelt senescent mus forårsaket av D-galaktose, samt redusere innholdet av MDA og kollagen i lunge og plasma, og øke innholdet av elastin, har en god rensende effekt på DPPH, forlenger hypoksitiden hos eldre mus, forbedrer aktiviteten til SOD i serum og forsinker den fysiologiske degenerasjonen av lunge hos eksperimentelt eldre mus. Med cellulær morfologisk degenerasjon har eksperimenter vist at Cistanche har den gode antioksidantevnen og har potensial til å være et medikament for å forebygge og behandle aldringssykdommer. Samtidig har echinacoside i Cistanche en betydelig evne til å rense DPPH-frie radikaler og har evnen til å rense reaktive oksygenarter og forhindre frie radikal-indusert kollagen-nedbrytning, og har også en god reparasjonseffekt på anionskader av tymin frie radikaler.

Klikk på cistanches herba

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Nøkkelord: aldring; antioksidantresponser; marine mikroorganismer; proteostase nettverk; Salinispora arenicola

1. Introduksjon

Aldring er preget av en tidsavhengig nedgang i funksjonskapasitet og stressmotstand, samt av økt dødelighet og sykelighet [1]. Aldring er ikke bare en passiv prosess, da den reguleres av evolusjonære konserverte molekylære og cellulære signalhendelser [2,3]. Organismer utfordres konstant av både interne (metabolsk-relaterte) og eksterne (diett- eller miljøavledede) stressfaktorer, noe som kan føre til gradvis akkumulering av skadede biomolekyler og til slutt kompromittere cellulær homeostase [4,5]. Proteiner er involvert i alle pivotale cellulære funksjoner og derfor er proteomhomeostase (proteostase) avgjørende for cellulær funksjonalitet og overlevelse [6].

Proteomintegriteten opprettholdes av proteostasenettverket (PN), som strekker seg til alle subcellulære rom og reguleres på celle-, vev- og organismenivå for å sikre organismehelse og lang levetid [7]. Å opprettholde proteostase krever at celler koordinerer og regulerer funksjonene til syntese, folding, sortering, transport og nedbrytning av alle polypeptider [8,9]. Disse cellulære funksjonene utføres for det meste av tre store sammenkoblede grener av PN, nemlig nettverket av molekylære chaperoner, ubiquitin-proteasom-(UPP), og autophagy-lysosom-(ALP) proteolytiske veier [10,11].

Molekylære chaperoner sikrer riktig proteinfolding og konformasjonsvedlikehold, og de samarbeider også med nedbrytningsveiene [12]. UPP er hovedstedet for kvalitetskontroll av proteinsyntese og er involvert i resirkulering av normale kortlivede proteiner og av ikke-reparerbare feilfoldede eller utfoldede proteiner [6], mens ALP er ansvarlig for gjenkjennelse og fjerning av proteinaggregater og skadede organeller [1. 3]. Tap av proteostase er et kjennetegn på aldring [14], så vel som en viktig risikofaktor for mange aldersrelaterte menneskelige patologier, inkludert kreft, diabetes, kardiovaskulære lidelser og nevrodegenerative sykdommer [15]. Derfor anses PN-aktivering som en lovende tilnærming for å forsinke utbruddet og/eller progresjonen av aldring og aldersrelaterte sykdommer [16–18].

Aldring av huden er preget av strukturelle og funksjonelle endringer i (blant annet) ekstracellulære matrisekomponenter, som elastin [19]. Elastase er enzymet som er involvert i nedbrytningen av elastin, noe som resulterer i utvikling av rynker og tap av elastisitet [20]. Tyrosinase er et nøkkelenzym i melaninsyntesen, som er ansvarlig for pigmentering av (blant annet) menneskelig hud [21,22]. Imidlertid er overdreven aktivering av tyrosinase assosiert med flere hudsykdommer, som hyperpigmentering og melanom [22,23]. Derfor utgjør elastase- og tyrosinaseinhibering en fremtredende tilnærming mot aldring av huden.

Naturlige produkter (NP) har en lang historie – godt dokumentert, før fødselen av moderne vitenskap og teknologi, i ulike kulturer – med å behandle menneskelige sykdommer [24–26]. Dermed kan NP-er tjene som svært berikede utgangsmaterialer og stillaser for utvikling av medikamenter; Faktisk er over halvparten av alle legemidler enten NP-er, NP-deriverte eller NP-inspirerte [27–29]. Den marine verden, som huser mest biologisk mangfold, er stort sett uutforsket og kan derfor være den største ressursen for å oppdage nye NP-er [30]. Blant organismene som lever i marine miljøer, er myke koraller lovende leverandører av bioaktive NP og er kjent for å være vert for mange forskjellige mikroorganismer [31,32].

Gitt disse fakta, utfører vi for tiden en omfattende screening med høy gjennomstrømning av NP-er for å identifisere bioaktive molekyler som potensielt kan forsinke cellulær senescens og/eller in vivo-aldring. I studien som presenteres her, undersøkte vi et metanolisk ekstrakt, nemlig SA223-S2BM, av Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2-stammen ved å bruke in vitro-analyser, så vel som cellebaserte og in vivo bio-guidede tilnærminger. S. arenicola TM223-S2-stammen ble isolert fra den myke korallen Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (opprinnelig kalt Scleronephthya lewinsohni av Verseveldt og Benayahu, 1978), som ble bærekraftig hentet fra det mesofotiske Rødehavets økosystem (EAPC) sør Eilat, Israel) på en dybde på 65 m. SA223-S2BM-metanolekstraktet aktiverte cytobeskyttende mekanismer både i menneskeceller og Drosophila melanogaster (D. melanogaster) fluer og utøvde in vitro hudbeskyttende egenskaper. Derfor kan SA223-S2BM-ekstraktet være kilden for den sannsynlige identifiseringen av molekyler med potensielle cytobeskyttende og antialdringsegenskaper.

2. Materialer og metoder

2.1. SA223-S2BM-ekstraktets opprinnelse og isolasjon

2.1.1. Korallsamling

Den myke korallen S. Levinson ble samlet inn av en ROV H800 (ECA Robotics) operert av Sam Rothberg R/V fra Interuniversity Institute for Marine Sciences i Eilat (IUI). In situ ble fotografering utført av et svart-hvitt-kamera med lite lys VS300 (ECA Robotics) og 1CAM Alpha HD-kamera (SubC Imaging). Prøver ble tatt med ROV-armen fra det mesofotiske revet i Eilat, utenfor oljebryggeterminalen (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E), ved 65 m, 7. mars 2017. Samlingsstedet er preget av en moderat skråning med steinete flekker omgitt av sandbunn. Ved oppsamling ble materialet umiddelbart frosset ved -80 ◦C. Et kupongprøve ble bevart i 70 prosent etanol for taksonomisk identifikasjon og deponert ved Steinhardt naturhistorisk museum, Tel Aviv University (SMNHTAU_Co_37500).

2.1.2. Belastningsisolering og identifikasjon

S. arenicola TM223-S2 ble isolert fra en 1 mL prøve av S. Levinson. Den innsamlede myke korallprøven ble malt i sterilt sjøvann og oppvarmet til 50 ◦C i 1 time. Den resulterende suspensjonen ble seriefortynnet, sådd ut på selektivt isolasjonsagarmedium og inkubert ved 28 ◦C i minst 6 uker. Salinispora-stammen ble isolert, og kolonien ble renset på marin buljongagar (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) og konservert ved -20 ◦C i en 10 prosent glyserolløsning.

2.1.3. Filogeniundersøkelse

Fylogenisk analyse ble utført ved bruk av et fragment av 16S rRNA-genet amplifisert fra det genomiske DNAet til S. arenicola TM223-S2. Det genomiske DNA fra stammen TM223-S2 ble isolert ved bruk av et DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen), i henhold til produsentens instruksjoner. 16S ribosomale RNA-fragmentet ble amplifisert ved PCR ved bruk av primere 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56,3 ◦C), og 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T ( Tm: 57,5 ​​◦C). Amplikoner ble sekvensert ved Sanger-sekvensering og sekvensene ble justert mot 16S ribosomale RNA-databasen til Targeted Loci-prosjektet til NCBI ved bruk av MUSCLE. Justeringen ble manuelt inspisert, og hull ble fjernet. Evolusjonshistorien ble utledet ved å bruke den maksimale sannsynlighetsmetoden og Tamura-Nei-modellen [33] med 1000 replikater. Det første treet for det heuristiske søket ble oppnådd automatisk ved å bruke nabo-sammenføynings- og BioNJ-algoritmer på en matrise med parvise avstander estimert ved bruk av MCL-tilnærmingen (maximal composite likelihood) og deretter velge topologien med en overlegen log-sannsynlighetsverdi. Evolusjonsanalyser ble utført i MEGA X versjon 10.1.7 [34].

2.1.4. Dyrkingsforhold

S. arenicola TM223-S2-sporer ble konservert ved -20 ◦C i 10 prosent glyserol. Før dyrking ble stammen gjenopplivet i 15 dager på en 15 cm Petri-plate som inneholdt MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) supplert med 2 prosent agar (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) , USA). Sterilt sjøvann (4 × 10 ml) ble helt på plateoverflaten, og sporene og myceliet ble gjenvunnet fra platen ved forsiktig riping av overflaten med en skalpell for å generere inokulumet. Flytende fermentering (LSF) ble utført i en 2 L Erlenmeyer-kolbe i 20 dager ved 28 ◦C og 130 rpm omrøring. Amberlite XAD16-harpiks (30 g/L) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Nederland) ble tilsatt før sterilisering for å tillate in situ-fanging av de mikrobielle metabolittene. Fem milliliter av inokulumet ble brukt til å inokulere 1 L på MB inneholdende 30 g Amberlite XAD16-harpiks. Agar-state gjæring kombinert med fast-fase ekstraksjon (SPE) [35] ble utført på MB medium (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) supplert med 2 prosent agar (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) over 20 dager ved 28 ◦C. Sterilisert Amberlite XAD16 (35 g) blandet med 35 ml inokulum ble fordelt homogent på overflaten av 1 MB agar Petri-plate (25 cm × 25 cm).

For LSF ble XAD16-harpiksen separert fra buljongkulturen via filtrering og vasket med vann før den ble eluert med etylacetat (100 ml) og deretter med metanol (100 ml). Eluatene ble konsentrert til tørrhet i vakuum og solubilisert i DMSO ved 10 mg/ml konsentrasjon. Det resulterende ekstraktet, SA223-S2LAE (ekstrahert ved bruk av etylacetat), ble brukt for biologiske evalueringer.

For SPE ble XAD16-harpiksen gjenvunnet ved forsiktig å skrape agarplatens overflate. Den gjenvunne harpiksen ble vasket med vann for å eliminere biomassen før den ble eluert med etylacetat (100 ml) og deretter med metanol (100 ml). Eluatene ble konsentrert til tørrhet i vakuum og solubilisert i DMSO ved 10 mg/ml konsentrasjon. De resulterende ekstraktene, SA223-S2BAE (ekstrahert ved bruk av etylacetat) og SA223-S2BM (ekstrahert ved bruk av metanol), ble brukt for biologiske evalueringer.

2.2. Elastase- og tyrosinaseinhibitoriske aktiviteter

Den elastasehemmende aktiviteten til det prioriterte ekstraktet ble evaluert ved bruk av elastase fra porcin pancreas (PPE) type IV (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) og substratet N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland), som tidligere beskrevet [36]. Kapasiteten til ekstraktet til å hemme den katalytiske virkningen av tyrosinase i oksidasjonen av L-DOPA til dopakrom ble bestemt, som tidligere rapportert [37].

2.3. Cellelinjer, cellekulturbetingelser og cellelevedyktighetsanalyse

Humane forhudsfibroblaster (BJ-celler) ble kjøpt fra American Tissue Culture Collection (ATCC), mens humane udødeliggjorte keratinocytter (HaCaT-celler) ble hentet fra Elabscience, Inc. Begge cellelinjene ble dyrket i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) (Thermo Fisher) Scientific Inc., Waltham, MA, USA) supplert med 10 prosent (v/v) føtalt bovint serum (FBS) og 1 prosent (v/v) ikke-essensielle aminosyrer og ble opprettholdt under forhold med 5 prosent CO2, 95 prosent luftfuktighet og 37 ◦C. I alle eksperimentelle prosedyrer som ble brukt, ble celler subkulturert ved å bruke en trypsin/EDTA-løsning (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Effekten av SA223-S2BM-ekstraktet på cellelevedyktighet ble estimert ved å bruke MTT-analysen, som tidligere rapportert [38]. Cellebehandling med hydrogenperoksid (H2O2) og doksorubicin (DXR) ble utført som beskrevet i figurlegender; H2O2 og DXR ble hentet fra Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland).

2.4. Drosophila Lines and Longevity Assay

I denne studien brukte vi Drosophila w1118-stammen kjøpt fra Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, USA). Fluer ble holdt ved 25 ◦C og 60 prosent fuktighet på en 12 timers lys: 12 timers mørk syklus. I alle presenterte eksperimenter ble bare somatiske vev (hode og thorax) av fluer analysert, siden reproduktive vev viser distinkt regulering av proteostatiske mekanismer og aldringshastigheter sammenlignet med somatisk vev [39].

Levetiden til fluer ble analysert som beskrevet før [40] ved å bruke hunn- og hannfluer (likt antall per kjønn) som ble dyrket i hetteglass som inneholdt (eller ikke) det undersøkte ekstraktet. Fluer ble overført til hetteglass med fersk mat annenhver dag og dødsfall ble målt daglig. For overlevelseskurver og statistisk analyse ble Kaplan-Meier-prosedyren og log-rank (Mantel-Cox) test brukt; signifikans ble akseptert ved p < 0,05.

2.5. Måling av reaktive oksygenarter (ROS)

Celler eller fluevev ble inkubert med CM-H2DCFDA-fargestoffet (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) i en konsentrasjon på 10 µM i PBS i 30 minutter i mørket (37 ◦C og 25 ◦C, henholdsvis). Etter fjerning av fargestoff ble celler eller flues vev inkubert med PBS i 15 minutter i mørket (henholdsvis 37 ◦C og 25 ◦C), lysert i lyseringsbuffer [150 mM NaCl, 1 prosent (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8,0] og sentrifugert ved 14, 000 g i 15 minutter (4 ◦C). Etterpå ble proteininnholdet målt med Bradford-analysen (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), og den produserte fluorescensen ble målt i en Spark® multimodus mikroplate-leser (Tecan Trading AG, Männedorf, Sveits) ved eksitasjon og emisjonsbølgelengder på henholdsvis 490 og 540 nm. Hydrogenperoksid (H2O2) ble brukt som en positiv kontroll, da det er allment kjent for å forårsake oksidativ skade/stress [41].

2.6. RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese, og kvantitativ sanntids-PCR-analyse (Q-RT-PCR)

Totalt RNA ble ekstrahert fra celler ved bruk av RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) og kvantifisert med et BioSpec-nano-spektrofotometer (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan). Deretter ble 1 µg RNA omdannet til cDNA ved bruk av FastGene Scriptase II cDNA Kit (NIPPON Genetics, Düren, Tyskland). For å utføre kvantitative sanntids PCR-analyser ble 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Estland) og PikoRealTM Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) brukt. Spesifikke primere for de humane genene som ble studert var som beskrevet tidligere [42]. HMBS-genet ble brukt som en normalisator.

2.7. Immunoblotting-analyse og måling av proteasom- og katepsinaktivitet

Immunoblotting-studier ble utført som tidligere beskrevet [43]. Primære og pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffer ble påført i 1 time ved romtemperatur og immunoblots ble utviklet ved bruk av et forbedret kjemiluminescensreagenssett (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Immunoblots kvantifisering ble utført ved å skanne densitometri og ImageJ-programvare [44].

Enzymatisk aktivitet for proteasomer og katepsiner i celler eller flues vev ble målt ved et VersaFluor™ Fluorometer System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) ved bruk av Suc-LLVY-AMC (chymotrypsin-lignende aktivitet, CT-L) og Z-FR-AMC fluorpeptider (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA), henholdsvis som tidligere beskrevet [42,45,46]. 6-bromoindirubin-30 -oksim (6BIO) ble brukt som en positiv kontroll, siden det er kjent å aktivere UPP både i menneskeceller og Drosophila-fluer [42,47]; stoffet Rapamycin, ble brukt som en positiv kontroll for ALP og katepsininduksjon [48].

2.8. Antistoffer brukt

Primære antistoffer mot 5 (sc-55009) proteasomunderenheten, NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), Clusterin (CLU) (sc{{7} }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) og GAPDH (sc-25778), samt de sekundære antistoffene som er konjugerte pepperrotperoksidase, ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Dallas, TX, USA). De primære antistoffene mot 53BP1 (4937), phospho-Histone H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) og phosphor-p53Ser15 (9286) ble oppnådd fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Antistoffet mot SQSTM1/p62 (BML-PW9860) ble kjøpt fra Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, USA).

2.9. Statistiske analyser

Eksperimenter ble utført i det minste i duplikater. MS Excel ble brukt til de statistiske analysene. Statistisk signifikans ble evaluert ved hjelp av Students t-test (t-test). Datapunkter tilsvarer gjennomsnittet av de uavhengige eksperimentene og feilstolper angir standardavviket (SD); signifikans ved p < 0.05 eller p < 0,01 er angitt i grafer med henholdsvis én eller to stjerner.

3. Resultater

3.1. Identifikasjon av Actinomycete assosiert med Soft Coral S. Levinson

Den målrettede mikrobielle stammen ble isolert fra korallen S. Levinson, som er en myk korall som er endemisk til Rødehavet. Koloniene til denne korallen finnes typisk på dype steder, både i de øvre mesofotiske korallrevenes økosystemer (30–60 m) og i de nedre mesofotiske korallrevenes økosystemer (60–105 m) [49]. Dessuten er det en myk korall av azooksantellat som får sine energibehov ved filtermating, og derfor finnes den i habitater som er utsatt for sterke vannstrømmer.

Fra den fylogenetiske analysen basert på 16S rRNA-sekvensen, ble isolatet TM223-S2 funnet å tilhøre Salinispora-slekten (figur 1).

Siden S. arenicola kan skilles fra S. Pacifica og S. tropica basert på 16S rRNA-sekvensen [50], kalte vi dette isolatet S. arenicola TM223-S2 med et Genbank-aksessnummer MW446171. Stammen ble dyrket som rapportert i Materialer og Metoder og ekstrahert med henholdsvis etylacetat og metanol. Foreløpig biologisk undersøkelse indikerte at ekstraktet fra den flytende kulturen, SA223-S2BAE, og etylacetatekstraktet fra den faste kulturen, SA223-S2LAE, var blottet for noen betydelig biologisk aktivitet (figur S1). Derfor ble bare metanolekstraktet fra den faste kulturen assosiert med fastfaseekstraksjon, SA223-S2BM, brukt i denne studien.

3.2. The Extract SA223-S2BM viser ingen toksisitet i menneskelige celler og aktiverer nøkkelkomponenter i PN

Først undersøkte vi effekten av SA223-S2BM på levedyktigheten til BJ-fibroblaster i normal hud og human-udødeliggjorte HaCaT-keratinocytter ved å utføre MTT-toksisitetsanalysen. For dette formålet ble celler inkubert i 24 timer med økende konsentrasjoner av ekstraktet, og som vist i figur 2A1, A2, utøver ikke ekstraktet en cytotoksisk effekt på noen av de to cellelinjene som ble undersøkt ved konsentrasjoner opp til 10 µg/ml ; ved høyere konsentrasjoner (over 10 µg/mL), reduserer ekstraktet cellelevedyktigheten hovedsakelig i HaCaT-celler.

Vi studerte deretter effekten av ekstraktet på cellulære veier, som sikrer proteomstabilitet til cellen. Vi observerte at kortvarig (24 timer) eksponering av BJ-fibroblaster for det studerte ekstraktet signifikant induserte ekspresjonen av PSMB7-proteasomgenet (ved en konsentrasjon på 10 µg/mL), mens det parallelt hadde en tendens til å øke ekspresjonen av PSMB6-genet i samme konsentrasjon (figur 2B1). I tillegg induserte ekstraktet ekspresjonen av 20S-proteasom-genet, PSMB6, og av 19S-proteasom-genet, RPN11 ved en konsentrasjon på 1 µg/ml i HaCaT-celler (figur 2B2). Videre førte behandling av BJ-fibroblaster med ekstraktet i 24 timer til en mild induksjon av ekspresjonsnivåene til 20S 5-proteasom-underenheten ved en konsentrasjon på 1 µg/ml (figur 2C). Til støtte for funnene våre økte eksponering for ekstraktet signifikant den kymotrypsinlignende proteasomaktiviteten både i BJ-fibroblaster og HaCaT-keratinocytter etter 24 timers inkubasjon (figur 2D1, D2); de forskjellige resultatene av de undersøkte konsentrasjonene av ekstraktet blant BJ- og HaCaT-celler kan tilskrives celletypespesifikke effekter.

I tillegg avslørte Q-RT-PCR-ekspresjonsanalyser at behandling av BJ-fibroblaster med ekstraktet i 24 timer induserte ekspresjonsnivåene til ALP-relaterte gener, kalt CTSB, CTSL, CTSD og SQSTM1, ved en konsentrasjon på 10 µg/mL ( Figur 3A1). Videre observerte vi at eksponering av HaCaT-celler for ekstraktet i 24 timer førte til induksjon av ekspresjonsnivåene til gener involvert i ALP-funksjonalitet (CTSB, CTSL, CTSD og SQSTM1) (Figur 3A2).

I tråd med disse funnene bemerket vi oppregulering av de autofagi-relaterte proteinene BECN1 og SQSTM1/p62 etter eksponering av BJ-fibroblaster for ekstraktet i en konsentrasjon på 1 µg/ml (Figur 3B1); økte ekspresjonsnivåer av proteinene BECN1 og SQSTM1/p62 ble også observert i HaCaT-keratinocytter ved begge studerte konsentrasjoner (figur 3B2). I samsvar med det fant vi at ekstraktet forbedret lysosomale katepsiners enzymatiske aktivitet i både BJ- og HaCaT-celler (figur 3C1, C2); igjen, de forskjellige resultatene av de undersøkte konsentrasjonene av ekstraktet blant BJ- og HaCaT-celler kan tilskrives celletypespesifikke effekter.

Videre undersøkte vi effekten av ekstraktet på sentrale molekylære chaperones uttrykksnivåer. Således avslørte immunoblotting-analyser at ekstraktet induserte ekspresjonsnivåene til de molekylære chaperonene CLU (ved begge studerte konsentrasjoner) i BJ-celler (figur 3D1), så vel som av HSP27 (1 µg/ml) og HSP70 (ved begge studerte konsentrasjoner) i HaCaT-celler (figur 3D2).

【For mer informasjon:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】