Kuwanon T og Sanggenon A isolert fra Morus Alba utøver antiinflammatoriske effekter ved å regulere NF-κB og HO-1/Nrf2 signalveier i BV2- og RAW264.7-celler

For mer info. ta kontakt medtina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt: Vi har tidligere undersøkt metanolekstraktet av Morus alba bark og karakteriserte 11 forbindelser fra ekstraktet: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T(3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6), mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) og norartokarpanon (11). Her undersøkte vianti-inflammatoriskeffekter av disse forbindelsene på mikrogliaceller (BV2) og makrofager (RAW264.7). Blant dem hemmet 3 og 4 markant den lipopolysakkarid(LPS)-induserte produksjonen av nitrogenoksid i disse cellene, noe som tyder på de antiinflammatoriske egenskapene til disse to forbindelsene. Disse forbindelsene hemmet produksjonen av prostaglandin E2, interleukin-6 og tumornekrosefaktor-c, og uttrykket av induserbar nitrogenoksidsyntase og cyklooksygenase-2 etter LPS-stimulering. Forbehandling med 3 og 4 hemmet aktiveringen av den nukleære faktor kappa B-signalveien i begge celletyper. Forbindelsene induserte også ekspresjonen av hem oksygenase(HO)-1 gjennom aktivering av nukleær faktor erytroid 2-relatert faktor 2. Undertrykkelse av aktiviteten til HO-1 reverserte de antiinflammatoriske effektene forårsaket ved forbehandling med 3 og 4, noe som tyder på at de antiinflammatoriske effektene ble regulert av HO-1. Til sammen er 3 og 4 potensielle kandidater for å utvikle terapeutiske og forebyggende midler forinflammatoriske sykdommer.

Nøkkelord: Morus alba; kuwanon T; sanggenon A; BV2; RAW264.7 celler; anti-inflammatoriske effekter

Klikk her for å lære flere produkter

1. Introduksjon

Morus alba, en medisinplante som tilhører familien Moraceae, har blitt brukt til behandling av lungebetennelsestilstander i tradisjonell medisin [1]. Rotbarken inneholder forskjellige aktive komponenter som umbelliferon, scopoletin, muciner, tanniner,flavonoider(morusin, mulberrin, mulberrichromene, cyclomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E og kuwanon H)[2], 2-arylbenzofuraner (moracenin D, moracin P, moracin O og mulberrofuran O), og prenylerte flavonoider (licoflavone C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin og Kuwana U) [3,4]. M. alba-ekstrakter og aktive forbindelser kan lindre lungesykdommer, som avslørt av nyere studier [5-7]. I tillegg til den farmakologiske effekten av M.alba på lungene, utøver isoprenylerte flavonoider (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G og mulberrofuran C) hepatobeskyttende effekter i t-BHP-induserte HepG2-celler [8]. Prenyl-flavonoider (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T og morusin) og triterpenoider (betulinsyre, avail og -sitosterol) hemmer vesentlig differensieringen av 3T3-L1-adipocytter [9]. Morinhydrat, den viktigste flavonoidbestanddelen av M. alba, lindrer kronisk uforutsigbar stressindusert hukommelsessvikt, noe som indikerer at denne forbindelsen kan øke antioksidantforsvarssystemet og hemme nevroinflammatoriske veier [10]. Disse studiene tyder på at bestanddelene i M.alba er potensielle kandidater for behandling av ulike sykdommer.

Betennelse, en kompleks selvforsvarsrespons på skadelige stimuli, spiller en viktig rolle i immunforsvaret gjennom aktivering av flere immunceller, inkludert makrofager, monocytter, leukocytter, mastceller og andre celletyper [11]. Makrofager er de mest tallrike og mest utbredte immuncellene i kroppen, og mikroglia er fastboende makrofager i sentralnervesystemet (CNS) [12]. Makrofager og mikrogliaceller er nøkkelspillere i den inflammatoriske responsen. De kan aktiveres som respons på stimuli som lipopolysakkarid (LPS), cytokiner og kjemokiner, og indusere inflammatoriske tilstander [13]. Under inflammatoriske tilstander forårsaker overdreven aktiverte makrofager og mikrogliaceller unormal regulering av pro-inflammatoriske mediatorer (nitrogenoksid (NO), prostaglandin E2(PGE,), induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS) og cyklooksygenase (COX)-2 ) og pro-inflammatoriske cytokiner (interleukin (IL)-6 og tumornekrosefaktor (TNF)-a), gjennom aktivering av den nukleære faktor kappa B (NF-B) signalveien [14,15]. Økte nivåer av pro-inflammatoriske mediatorer forverrer ytterligere progresjonen av inflammatoriske sykdommer, som ytterligere øker aktiveringen av inflammatoriske faktorer, og dermed resulterer i en ond sirkel[16]. Derfor er regulering av inflammatoriske mediatorer avgjørende for behandling og forebygging av inflammatoriske sykdommer.

Hem oksygenase (HO)-1 er et hastighetsbegrensende enzym som katalyserer nedbrytningen av hem til biliverdin, jernholdig ion (Fe2 pluss) og karbonmonoksid (CO)[17]. HO-1-induksjon reguleres av aktivering av nukleær faktor erytroid 2-relatert faktor 2(Nrf2). HO-1 kan induseres som respons på oksidativt stress og betennelse for å beskytte vev og opprettholde homeostase i kroppen[18]. Derfor er målretting av HO-1-induksjon en av de potensielle strategiene for behandling av inflammatoriske sykdommer.

I vår pågående streben etter å utforske kandidat(er) fra naturlige produkter for å behandle inflammatoriske sykdommer, presenterer vi heranti-inflammatoriske effekterav 11 1 forbindelser isolert fra M.alba i LPS-induserte BV2- og RAW264.7-celler.

2. Resultater

2.1. Effekter av 11 forbindelser isolert fra M.alba på levedyktigheten til BV2- og RAW264.7-celler

I den forrige studien ble rotbarken til M.alba ekstrahert i vandig metanol, og de oppnådde ekstraktene ble suksessivt fordelt i EtOAc, n-BuOH og H2O2. Gjentatt SiO2, ODS og Sephadex LH-20 kolonnekromatografi av EtOAc-fraksjonen ga 11 forbindelser, slik som kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A(4), sanggenon M(5), sanggenol A(6),mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10) og norartokarpanon (11)[6,19,20]. De kjemiske strukturene til 11 forbindelser isolert fra M.alba er illustrert i figur 1. For å bestemme de cytotoksiske effektene av disse forbindelsene, en 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl){{ 26}}.5-difenyltetrazoliumbromid(MTT)-analyse ble utført, BV2- og RAW264.7-celler ble behandlet med de angitte konsentrasjonene av forbindelsene i 48 timer, ved konsentrasjoner på opptil 80 μM. (Figur 2). Forbindelse 2, 3 og 4 hadde toksiske effekter ved 80 μM, forbindelse 5 hadde toksiske effekter ved 40 μM. Basert på resultatet av toksisitetsevalueringen ble et ikke-toksisk konsentrasjonsområde valgt for påfølgende studier på de antiinflammatoriske effektene (forbindelse 2, 3,4 ved 40 uM, forbindelse 5 ved 200 μM og andre forbindelser ved 80 μM) .

2.2. Effekter av 1-forbindelser isolert fra M. alba på uttrykket av inflammatoriske faktorer og iNOS-protein i BV2- og RAW264.7-celler

NO er ​​en fri radikal i kardiovaskulær, nervøs ogimmunforsvar. Den opprettholder intracellulær homeostase, transporterer nevrotransmittere og regulerer antiinflammatorisk aktivitet og cytotoksisitet. Men når en stor mengde NO produseres, har det skadelige effekter på kroppen, inkludert vasodilatasjon, cytotoksisitet og vevsskade [21,22]. Vi undersøkte deretter effekten av disse forbindelsene på nitrittproduksjon i LPS-induserte BV2- og RAW264.7-celler. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av forbindelser i 2 timer før stimulering med LPS (1 ug/mL) i 24 timer. Blant forbindelsene var det bare forbindelse 3 (kuwanonT) og 4(sanggenon A) som hemmet nitrittproduksjon signifikant i både BV2- og RAW264.7-cellelinjer (figur 3). I tillegg gjennomførte vi et ekstra eksperiment for å sammenligne den hemmende effekten av nitrittproduksjon mellom den LPS-behandlede gruppen etter den sammensatte forbehandlingen og den sammensatte-behandlede gruppen etter LPS-forbehandlingen. Som et resultat var det ingen forskjell i den hemmende effekten av nitrittproduksjon mellom de to eksperimentelle gruppene (tilleggsfigur S1). Derfor, i denne studien, ble følgende eksperimenter utført ved bruk av forbehandling med forbindelser innen 2 ~ 3 timer før behandling av LPS.

Produksjonen av NO økes av de pro-inflammatoriske proteinene induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS). Imidlertid svekker overekspresjon av iNOS alvorlig sykdommens patofysiologi [23]. Forbindelsene 3 og 4 hemmet ekspresjonen av iNOS på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 4). Vi undersøkte effekten av forbindelsene 3 og 4 på LPS-indusert ekspresjon av inflammatoriske faktorer i BV2- og RAW264.7-celler. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av forbindelsene 3 og 4 i 2 timer før stimulering med LPS (1 ug/ml) i 24 timer. Begge forbindelsene hemmet signifikant LPS-indusert ekspresjon av PGE2, TNF og IL-6 i BV2- og RAW264.7-celler (figur 5). Resultatene så ut til å vise at forbehandling med forbindelse 3 og 4 undertrykte den LPS-induserte betennelsen i BV2- og RAW264.7-celler.

2.3. Effekter av forbindelse 3 og 4 på NF-xB-translokasjon i BV2- og RAW264.7-celler

NF-kB er en transkripsjonsfaktor som regulerer iNOS-ekspresjon [24]. Normal NF-kB forblir i sin inaktive form ved å danne komplekser med regulatoriske proteiner som IKB. Imidlertid, når det aktiveres av LPS, brytes IkBa ned av fosforylering, og NF-kB (som p65) blir translokert til kjernen [25], noe som fremmer det inflammatoriske mediatorgenet og induserer ekspresjonen av inflammatoriske faktorer [26]. For ytterligere å undersøke den hemmende effekten av forbindelsene 3 og 4 på produksjonen av pro-inflammatoriske faktorer i LPS-aktiverte BV2- og RAW264.7-celler, undersøkte vi ekspresjonen nukleær translokasjon av p65 i celler behandlet med forbindelsene 3 og 4, LPS, eller begge ved bruk av et anti-p65 FITC-merket antistoff. DAPI ble brukt til kjernefysisk farging. I kontrollgruppen ble p65-ekspresjon påvist i cytosolen. I de LPS-induserte cellene ble imidlertid p65-akkumulering oppdaget i kjernen, som indikert i de sammenslåtte bildene av DAPI- og p65-farging. Videre, sammenlignet med de LPS-induserte cellene, reduserte forbindelsene 3 og 4 markant den LPS-medierte økningen i NF-KB (p65) DNA-bindende aktivitet (Figur 6A, B) og kjernefysisk translokasjon (Figur 6C-F). Disse funnene indikerer at forbindelsene 3 og 4 er negative regulatorer av LPS-stimulert NF-kB nukleær translokasjon.

2.4. Effekter av forbindelsene 3 og 4 på Nrf2/HO-1-banen i BV2 og RAW264.7

Cells Heme oksygenase-1(HO-1)er et mål for nukleær faktor E2-relatert faktor 2(Nrf2), Nrf2/HO-1-veien er et kraftig antioksidantsignalsystem for å fremme fritt jern i karbonmonoksid (CO), biliverdin og hem [27]. Karbonmonoksid, en gassformig metabolitt av hemkatabolisme, viser regulatoriske effekter av vasodilatasjon og proinflammatoriske responser [28]. Dessuten er HO-1 også kjent for å spille en viktig rolle i å beskytte celler mot betennelse og oksidativt stress og for å regulere nitrittproduksjonen i aktiverte makrofager [29]. Vi utførte Western blotting for å undersøke om forbindelsene 3 og 4 øker ekspresjonsnivået av HO-1, der den velkjente HO-1-induktoren koboltprotoporfyrin (CoPP) ble brukt som en positiv kontroll som øker HO{{ 16}} proteinuttrykk. [30]. Resultatene viste at forbindelsene 3 og 4 også oppregulerte ekspresjonen av HO-1 (figur 7). Vi undersøkte videre om forbindelsene 3 og 4 regulerer aktiveringen av Nrf2. Translokasjonen av Nrf2 til kjernen ble økt på en tidsavhengig måte, noe som indikerer at forbindelsene 3 og 4 signifikant oppregulerte Nrf2/HO-1-banen i BV2- og RAW264.7-celler (figur 8).

For ytterligere å undersøke om de anti-nevroinflammatoriske og antiinflammatoriske effektene av forbindelsene 3 og 4 er korrelert med HO-1-ekspresjon i BV2- og RAW264.7-celler, utførte vi et sett med eksperimenter med tinnprotoporfyrin-IX(SNPP) som er en selektiv aktivitetshemmer av HO-1. Ved å bruke SNPP som kan nedregulere uttrykket av HO-1, prøvde vi å finne ut om HO-1 medierer den hemmende effekten av forbindelsene ovenfor på den inflammatoriske responsen indusert av LPS 【31】. Etter å ha behandlet cellene med 20 μM av forbindelsene 3 og 4 i 2 timer med eller uten 50 uM SNPP ble de behandlet med LPS i 24 timer. Selv om forbindelsene 3 og 4 reduserte nitrittproduksjonen i LPS-induserte BV2- og RAW264.7-celler, ble deres antiinflammatoriske effekter reversert ved SNPP-behandling (Figur 9). SNPP alene påvirket ikke produksjonen av nitrogenoksid (NO) etter LPS-stimulering, noe som tyder på at de antiinflammatoriske effektene av forbindelsene 3 og 4 reguleres av HO-1-ekspresjon.

3. Diskusjon

Den nåværende studien viste at Kuwana T og sanggenon A utøver undertrykt LPS-indusert betennelse i BV2- og RAW264.7-celler. Disse forbindelsene hemmet den LPS-induserte produksjonen av NO, PGE2 og pro-inflammatoriske cytokiner, inkludert IL-6 og TNF-, og uttrykket av iNOS og COX-2 i både BV2- og RAW264.7-celler. Disse resultatene indikerte at Kuwana T og sanggenon A utøvde sine antiinflammatoriske effekter ved å inaktivere NF-kB-signalveien. I tillegg induserte disse forbindelsene ekspresjonen av HO-1 gjennom aktiveringen av Nrf2. I tillegg induserte disse forbindelsene ekspresjonen av HO-1 via Nrf2-aktivering, og denne effekten ble også bekreftet å være relatert til den antiinflammatoriske aktiviteten.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), og tromboksan A2(TXA,)[361. Under inflammatoriske tilstander øker nivåene av iNOS og COX-2, noe som resulterer i overproduksjon av henholdsvis NO og PGE2, og fører til forverring av inflammatoriske lidelser [37]. I denne studien evaluerte vi først 11 forbindelser isolert fra M.alba for å bestemme om NO-produksjonen er hemmet i LPS-stimulerte BV2- og RAW264.7-celler. Resultatene våre viste at kuwanon T og sanggenon A utøvde de sterkeste hemmende effektene i både BV2- og RAW264.7-celler (figur 3). I vår forrige studie hadde moracin M en anti-inflammatorisk effekt på alveolære makrofager, men resultatene våre viste en annen mønster. Men siden hver celle har forskjellige egenskaper, kan forskjellige aktiviteter vises selv med samme mekanisme J38]. Derfor, som i resultatene av denne artikkelen, ble det bekreftet at moracin M ikke hadde noen anti-inflammatorisk aktivitet i BV2- og RAW264.7-celler opp til behandlingskonsentrasjonen. Derfor ble kuwanon T og sanggenon A valgt for videre eksperimenter.

Cytokiner har en kompleks regulatorisk påvirkning på inflammatoriske og immunresponser [39]. Aktivering av makrofager og mikrogliaceller øker sekresjonen av pro-inflammatoriske cytokiner J40, og denne økte sekresjonen fører til ytterligere cytokinfrigjøring [41]. IL-6 er et av de viktigste cytokinene og er en løselig mediator som er ansvarlig for betennelse, immunrespons og hematopoiesis [42]. IL-6-signalering reguleres gjennom to forskjellige mekanismer, inkludert binding til den membranbundne IL-6-reseptoren (mblL6R) og gjenkjennelse av den løselige IL-6-reseptoren (sIL6R)[43]. Begge mekanismene er assosiert med aktivering av glykoprotein (GP)130, som resulterer i aktivering av nedstrøms signalmolekyler, inkludert Janus kinase (IAK)/signaltransduser og aktivator av transkripsjon (STAT)kinaser, fosfoinositid 3-kinase (PI3K) ), og mitogenaktivert proteinkinase (MAPK)[44]. IL-6 brukes til å forutsi og evaluere betennelsesnivåer hos pasienter med kreft, infeksjon, autoimmune sykdommer, bukspyttkjertelsykdommer og kardiovaskulære sykdommer.

TNF-, et annet viktig cytokin, spiller også en viktig rolle i mange immun- og inflammatoriske prosesser, slik som immuncelleproliferasjon, apoptose, nekrose og overlevelse. De biologiske effektene av TNF- reguleres ved binding til to forskjellige reseptorer, tumornekrosefaktorreseptor (TNFR)1 og TNFR2. TNFR1 er hovedmediatoren for TNF-aktivitet i de fleste celler, fordi TNFR2 har mindre bindingsaffinitet for TNF-, noe som resulterer i at TNF- dissosieres lettere fra TNFR2 enn fra TNFR1. Abnormiteter i TNF-signalering og overproduksjon av TNF- fører til utvikling av mange sykdommer, inkludert revmatoid artritt, psoriasis, Crohns sykdom, aterosklerose, sepsis, diabetes og fedme [45,46. Derfor er det viktig å hemme produksjonen av pro-inflammatoriske cytokiner for å undertrykke og forhindre inflammatoriske reaksjoner og utvikling av inflammatoriske sykdommer. I denne studien hemmet kuwanon T og sanggenon A den LPS-induserte produksjonen av IL-6 og TNF- i både BV2- og RAW264.7-celler.

NF-KB er den mest allestedsnærværende transkripsjonsfaktoren[47], og NF-kB-signalering spiller en viktig rolle i uttrykket av gener relatert til inflammatoriske responser, inkludert de som koder for iNOS, COX-2 og pro-inflammatoriske cytokiner [ 48]. I den inaktiverte tilstanden eksisterer NF-kB-underenheter i cytoplasmaet bundet til dets inhibitorprotein, inhibitor kappa B (kB)-. Flere stimuli, inkludert LPS og cytokiner, induserer fosforylering og nedbrytning av IkB-, noe som tillater frigjøring og translokasjon av NF-kB-underenheter inn i kjernen. De translokerte underenhetene binder seg til kB-steder til målgener i DNA, noe som resulterer i induksjon av transkripsjon av gener som koder for pro-inflammatoriske mediatorer [49]. Derfor kan inaktiveringen av NF-kB-banen være et terapeutisk mål for inflammatoriske sykdommer. I denne studien hemmet forbehandling med kuwanon T og sanggenon A den LPS-induserte aktiveringen av NF-kB-signalering ved å hemme den DNA-bindende aktiviteten og kjernefysiske translokasjonen av NF-kB-underenheter (figur 6). Disse resultatene tyder på at de antiinflammatoriske effektene av kuwanon T og sanggenon A utøves via regulering av NF-kB-signalveien.

Under normale forhold binder Nrf2 seg til Kelch-lignende ECH-assosiert protein 1 (Keap1) i cytoplasmaet. Imidlertid dissosierer den fra Keapl, translokerer inn i kjernen og binder seg til antioksidantresponselement(ARE)-steder på DNA, noe som fører til ekspresjon av ulike antioksidantgener, inkludert de som koder for HO-1, NAD(P)H : kinonoksidoreduktase 1(NQO1), peroksiredoksin (Prx) og tioredoksin (Trx)[50]. Spesielt er HO-1 kjent for å være assosiert med anti-inflammatoriske effekter, og aktiviteten er representert ved nivåene av CO, ett av de tre biproduktene som genereres fra hem av den enzymatiske aktiviteten til HO{{12 }} [51]. I denne studien fant vi at kuwanon T og sanggenon A-induserte HO-1-uttrykk ved å aktivere Nrf2 (figur 7 og 8). I tillegg bekreftet vi korrelasjonen mellom den antiinflammatoriske effekten av kuwanon T og sanggenon A og HO-1-uttrykk ved å bruke SNPP, en selektiv hemmer av HO-1-aktivitet. De hemmende effektene av kuwanon T og sanggenon A på NO- og TNF-produksjon og NF-kB-aktivering ble delvis reversert ved samtidig behandling med SNPP (Figur 9). Disse resultatene tyder på at de antiinflammatoriske effektene av kuwanon T og sanggenon A reguleres av HO-1-uttrykk.

4. Materialer og metoder

4.1. Materialer

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) og føtalt bovint serum ble kjøpt fra Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, USA). Alle kjemikalier ble oppnådd fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). De primære antistoffene anti-iNOS, anti- -aktin, anti-p65 og anti-HO-1 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); og anti-kanin og anti-mus sekundære antistoffer fra Millipore

(Billerica, MA, USA). Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)-sett for PGE,, IL-6 og TNF- ble kjøpt fra R&DSystems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Isoleringen og strukturelle bestemmelsen av de 11 forbindelsene fra Morus alba er beskrevet andre steder [19-21].

4.2. Cellekultur og levedyktighetsanalyser

BV2- og RAW264.7-celler ble sådd med en tetthet på 5 × 105 celler/ml i RPMI 1640 supplert med 1 prosent antibiotika (penicillin-streptomycin) og 10 prosent varmeinaktivert FBS. Cellene ble dyrket ved 37 grader i en fuktet 5 prosent CO, med en 95 prosent luftatmosfære, i henhold til en tidligere beskrevet metode [52].

4.3. Måling av NO-produksjon

Produksjonen av nitritt, et stabilt sluttprodukt av NO-oksidasjon, ble målt som en indikator på NO-produksjon i cellene. Kort fortalt ble konsentrasjonen av nitritt i de kondisjonerte medier bestemt ved bruk av en metode basert på Griess-reaksjonen [53]. Detaljene i analysen er beskrevet tidligere [54].

4.4. PGE2 Ass4y/

Konsentrasjonen av PGEz i hver prøve ble målt ved å bruke et kommersielt tilgjengelig ELISA-sett, i henhold til en tidligere beskrevet metode [55].

4.5.Måling av IL-6- og TNF-a-nivåer

Kulturmediet ble samlet for å bestemme nivåene av IL-6 og TNF- ved å bruke et kommersielt tilgjengelig sett (BioLegend, San Diego, CA, USA). Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble BV2- og RAW264.7-celler sådd i 24-brønnkulturplater med en tetthet på 20 × 10 celler/brønn. Etter inkubering ble supernatanten samlet og brukt til å måle konsentrasjonene av IL-6 og TNF- med ELISA-sett.

4.6. Western blot-analyse

De pelleterte BV2- og RAW264.7-cellene ble vasket med PBS og lysert i RIPA-buffer. Like mengder proteiner ble kvantifisert ved bruk av proteinanalysefargereagenskonsentrat oppnådd fra Bio-Rad Laboratories (#5000006; Hercules, CA, USA), blandet i prøvebelastningsbufferen og separert ved bruk av SDS-PAGE. De separerte proteinene ble deretter overført til en nitrocellulosemembran. Uspesifikk binding til membranen ble blokkert ved inkubering i en løsning av skummet melk. Membranen ble inkubert med primære antistoffer (som alle ble brukt ved en 1:1000) ved 4 grader over natten og deretter reagert med et pepperrotperoksidase-konjugert sekundært antistoff (som alle ble brukt ved en 1:5000) (Millipore) [ 31].

4.7.NF-xB lokalisering og immunfluorescensanalyse

For å studere lokaliseringen av NF-kB, ble BV2- og RAW264.7-celler dyrket på Lab-Tek II-kammerglass og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av forbindelser i 2 timer før LPS-stimulering (0,5 ug/ml) i 1 h. Cellene ble deretter fiksert i formalin og permeabilisert med kald aceton og probet med anti-p65-antistoffer (1:200), etterfulgt av inkubering med et fluorescein-isotiocyanat-merket sekundært antistoff (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). For å visualisere kjerner ble cellene behandlet med 1 ug/mL 4'6-diamidino-2-fenylindol (DAPI i 30 minutter, vasket med PBS i 5 minutter og behandlet med 50 μL VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Fargede celler ble visualisert og bilder ble tatt med et Zeiss fluorescensmikroskop (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan). [31].

4.8. Statistisk analyse

Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik for tre uavhengige eksperimenter. Enveis variansanalyse, etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstest, ble brukt for å sammenligne forskjeller mellom de tre gruppene. Statistiske analyser ble utført ved å bruke GraphPad Prism-programvaren (versjon 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA),

5. Konklusjoner

Kuwanon T og sanggenon A utøvde antiinflammatoriske effekter i LPS-induserte BV2- og RAW264.7-celler ved å hemme produksjonen av NO, PGE2, IL-6 og TNF- og uttrykket av iNOS og COX{{8} }. Resultatene våre viste at disse hemmende effektene ble mediert via inaktivering av NF-KB-banen ved behandling med kuwanon T og sanggenon A. I tillegg induserte disse forbindelsene ekspresjonen av HO-1 ved å aktivere translokasjonen av Nrf2 inn i kjernen . Funnene våre viste at HO-1-uttrykket indusert av kuwanon T og sanggenon A var assosiert med de undertrykkende effektene mot LPS-indusert betennelse. Samlet gir resultatene våre bevis på at Kuwana T og sanggenon A isolert fra M. Albu kan være kandidater for utvikling av terapeutiske og forebyggende midler for nevroinflammatoriske sykdommer som Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom.