Laccase-mediatorsystem som bruker en naturlig mediator som blekemiddel for avfarging av melanin del 1

Abstrakt: I denne studien ble et laccase-mediator system (LMS) ved bruk av en naturlig mediator utviklet som et blekemiddel for melaninavfarging. Syv naturlige mediatorer ble brukt for å erstatte syntetiske mediatorer og med suksess overvinne det lave redokspotensialet til laccase og begrenset tilgang til melanin til det aktive stedet for laccase. Melaninavfargingsaktiviteten til laccaser fra Trametes versicolor (lacT) og Myceliophthora thermophila (lacM) ble betydelig forbedret ved bruk av naturlige mediatorer inkludert acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon, som viste lav cytotoksisitet. Metoksy- og ketongruppene til naturlige mediatorer spiller en viktig rolle i avfarging av melanin. Spesifisitetskonstantene til lacT og lacM for melaninavfarging ble forsterket med henholdsvis 247 og 334 når acetosyringon ble brukt som mediator. LMS ved bruk av blonder og acetosyringon kan også avfarge melaninet som finnes i cellulosehydrogelfilmen, som etterligner hudtilstanden. Videre kunne LMS avfarge ikke bare syntetiske eumelaninanaloger fremstilt ved oksidasjon av tyrosin, men også naturlig melanin produsert av melanomceller.

I følge relevante studier,cistancheer en vanlig urt som er kjent som "mirakelurten som forlenger livet". Hovedkomponenten ercistanoside, som har ulike effekter som f.eksantioksidant, anti-inflammatorisk, ogfremme av immunfunksjonen. Mekanismen mellom cistanche ogbleking av hudenligger i antioksidanteffekten til cistancheglykosider. Melanini menneskelig hud produseres ved oksidasjon av tyrosin katalysert avtyrosinase, og oksidasjonsreaksjonen krever deltakelse av oksygen, så de oksygenfrie radikalene i kroppen blir en viktig faktor som påvirker melaninproduksjonen. Cistanche inneholdercistanoside, som er en antioksidant og kan redusere dannelsen av frie radikaler i kroppen, dermedhemmer melaninproduksjonen.

Klikk på Rou Cong Rong fordeler for bleking

For mer info:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Introduksjon

Laccaser (EC 1.10.3.2, benzendiol: dioksygenoksidoreduktaser) er multikobberproteiner som katalyserer oksidasjonen av ulike fenoliske og ikke-fenoliske forbindelser via en radikalkatalysert reaksjonsmekanisme ved reduksjon av molekylært oksygen [1,2]. Laccaser har blitt brukt som biokatalysatorer for biologiske nedbrytningsprosesser, slik som bioremediering av fargestoffer [3,4], farmasøytiske midler [5,6], ugressmidler [7] og delignifisering [8–10]. Laccaser har også blitt brukt til å katalysere polymeriseringen av fargestoffforløpere og organiske forbindelser [11]. Spesielt deres attraktive egenskaper, som lav substratspesifisitet, bruk av oksygen som den endelige elektronakseptoren, generering av vann som et biprodukt, og ingen etterspørsel (eller ingen produksjon) av peroksider, gjør dem interessante innen bioteknologi og miljøfelt [1,11,12].

Fire kobberioner på det aktive stedet er involvert i den katalytiske aktiviteten til laccase. "Blå" kobber (T1-sted) oksiderer substratet, og den trinukleære kobberklyngen (T2/T3) mottar elektronene fra T1-stedet for å redusere det molekylære oksygenet [1,12,13]. Spesielt regnes redokspotensialet til T1-stedet Cu som en viktig faktor for å bestemme den katalytiske evnen til laccaser [14]. Laccaser har et relativt lavt redokspotensial (0.4–0.8 V) sammenlignet med ligninolytiske peroksidaser (over 1 V) som manganperoksidase og ligninperoksidase. Laccaser kan ikke direkte oksidere ikke-fenoliske substrater med redokspotensial over 1,3 V [13,14]. Derfor, for å overvinne begrensningene til laccase, laccase-mediator systems (LMS) som bruker små molekylære forbindelser, slik som 2,20 -azinobis(3- etylbenztiazolin-6-sulfonat) (ABTS), { {24}}hydroksybenzotriazol (HOBt), fiolsyre (VLA), N-hydroksyftalimid (HPI), N-hydroksyacetanilid (NHA) og TEMPO, som fungerer som redoksmediatorer, har blitt foreslått [15–17].

Disse mediatorene tillater oksidasjon av voluminøse forbindelser via forskjellige oksidasjonsveier. Laccase-ABTS-systemet oksiderer substrater ved å generere et kationisk ABTS-radikal via en elektronoverføringsmekanisme (ET). LMS-er med HOBt, VLA, HPI eller NHA produserer nitroksylradikaler via mekanismen for hydrogenatomoverføring (HAT) [1,12,17]. Videre reagerer mediatorer som TEMPO og dets analoger via ioniske veier for å generere oksoammoniumioner [1,12,18]. Bruken av disse mediatorene kan oksidere et bredt spekter av forbindelser i forskjellige applikasjoner, som for eksempel nedbrytning av fargestoffer [3,4], medikamentnedbrytning [5,6] og nedbrytning av lignin [8–10]. Ikke desto mindre har bruken av syntetiske mediatorer i industrielle felt vært begrenset på grunn av deres potensielle toksisitet, høye kostnader og enzyminaktiveringseffekt. Nylig har lignin-avledede fenoliske molekyler som naturlige mediatorer (f.eks. syringaldehyd, acetosyringon, vanillin, acetovanillon, metylvanillat, ferulinsyre, sinapinsyre, p-kumarsyre, etc.) blitt studert for å erstatte syntetiske mediatorer [1,12] . Fordelene med naturlige mediatorer er lave kostnader og lav toksisitet fordi de er hentet fra naturlige og fornybare kilder [19].

Melanin er en gruppe naturlige pigmenter produsert ved melanogenese gjennom oksidativ polymerisering av tyrosin av melanocytter. Naturlig melanin kan klassifiseres i fem kategorier av eumelanin, pheomelanin, alle melanin, pheomelanin og neuromelanin [20]. Nylig har ulike medisinske og elektrokjemiske anvendelser som bruker melanin eller melaninforløpere blitt studert [20,21]. Menneskelig hudfarge bestemmes for det meste av tilstedeværelsen av melanin. I kosmetikkindustrien har direkte depigmentering av melanin ved bruk av enzymer blitt foreslått for utvikling av hudblekende midler. Flere peroksidaser har blitt studert for å avfarge melanin. Woo et al. viste at syntetisk melanin kan avfarges direkte av ligninperoksidase fra P. chrysosporium [22]. Keneko- og Mohorˇciˇc-gruppene rapporterte også om enzymatisk avfarging av melanin med manganperoksidase isolert fra sopp (Sporotrichum pruinose og Phlebia radiata) [23,24]. Kim et al. rapporterte at rå enzymblandinger som inneholder manganperoksidase, ligninperoksidase og lakkase viste melanin-depigmenteringsaktivitet [25]. Når peroksidaser avfarger melanin, krever de hydrogenperoksid (H2O2) som en kofaktor som kan irritere huden. Derfor, for å redusere bruken av H2O2, ble glukoseoksidase eller laccase introdusert i enzymkombinasjonssystemet [26,27]. Laccaser kan avfarge melanin uten bruk av hydrogenperoksid. Khammuang og Sarnthima rapporterte at laccase fra Lentinus polycarpous Lév viste melanin-avfargingsaktivitet ved bruk av ABTS, vanillin og vanillinsyre som mediatorer [28].

2. Materialer og metoder

2.1. Materialer

2.2. Melanin avfarging av LMS

Den mettede melaninløsningen (1,4 mg/ml) ble fremstilt ved oppløsning av 3 mg syntetisk melanin i 1,3 ml 10 mM NaOH. Løsningen ble sentrifugert ved 85 00 rpm i 5 minutter for å fjerne uoppløst melanin, og supernatanten ble fortynnet med 0.1 M sitronsyrefosfatbuffer (pH 3, 4, 5, 5.5, 6 eller 7) og brukes som en substratløsning for LMS. Konsentrasjonen av melanin i substratløsningen var 63 µg/ml og spektrofotometrisk bekreftet ved 475 nm. 0,8 mL melaninsubstratløsning ble blandet med 0,1 mL mediatorløsning (0–1 mM) i et 1,5 mL Eppendorf-rør. Melanin-avfargingsreaksjonen ble initiert ved å tilsette 0,1 ml laccase-løsning (15,8 µg (0,6 U) lacT eller 19,2 µg (1,8 U) lacM) til en blanding av melanin og mediatoren ved 25 ◦C i et ristevannbad ved 120 rpm. . Etter reaksjonen ble reaksjonsblandingen sentrifugert, og absorbansen til supernatanten ble målt ved 475 nm. Avfargingsutbyttet (prosent) ble beregnet ved å bruke følgende ligning:

Avfarging ( prosent ) {{0}} (A0 − At)/A0 × 100, (1)

2.3. Kinetisk studie av melaninavfarging av LMS

2.4. Cytotoksisitet av naturlige mediatorer

B16F10 melanomcellelinjen (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) ble brukt til å bestemme cytotoksisiteten til naturlige mediatorer for LMS. En nøytral rød (NR) analyse ble utført for å måle cytotoksisiteten til mediatorene [29]. NR måler levedyktigheten til levende cellelysosomer. Melanomceller med en konsentrasjon på 3 × 104 celler ble dispensert i hver brønn i en 96-brønnplate. Etter 24 timers dyrking ble cellene behandlet med naturlige mediatorer (1, 2, 5, 10, 22 og 46 mM). Etter ytterligere dyrking i 2 dager ble cellene behandlet med 50 µg/ml NR-løsning oppløst i DMEM og inkubert i 3 timer. Etter fjerning av supernatanten gjennom sug, ble en NR-desorberingsløsning (1 prosent iseddik, 49 prosent etanol og 50 prosent destillert vann) brukt for fargeekstraksjon. Etter ekstraksjonsprosessen ble endringen i absorbans målt ved 540 nm.

2.5. Forberedelse og avfarging av melanin/cellulosehydrogelfilmen

For å måle avfargingsaktiviteten til LMS for melanin/cellulosefilmen ble den forberedte hydrogelfilmen kuttet i et 1 × 2 cm ark. Hydrogelfilmen ble nedsenket i 4 ml 0.1 M sitronsyrefosfatbuffer (pH 5,5); deretter ble 0,5 mL 1 mM acetosyringon og 0,5 mL blondeløsning (2,5 U) tilsatt bufferen. Avfargingsreaksjonen ble utført i et vannbad med risting ved 120 pm og 25 ◦C i 3 timer. Etter reaksjonen ble filmen vasket med destillert vann og festet til innsiden av kyvetten for å måle endringen i spektrene i området 400–800 nm ved bruk av et UV/Vis-spektrofotometer. Kontrollreaksjoner uten lacM eller mediatorer ble også utført under de samme betingelser. Frigjøring av melanin fra filmen eller fargeendring av melanin/cellulosefilm ble ikke påvist under reaksjonsbetingelsene. Videre ble endringen i fargeparametere (L*, a* og b*-verdier) av melanin/cellulosefilmen etter avfargingsreaksjonen ved LMS også registrert ved bruk av et kolorimeter (KONICA MI NOLTA, Tokyo, Japan). ∆L (metrisk lyshetsforskjell), ∆E (total fargeforskjell), YI (gulhetsindeks) og WI (hvithetsindeks) ble oppnådd ved å bruke følgende ligninger [30–32]:

2.6. Fremstilling av naturlig melanin

Naturlig melanin ble oppnådd fra B16F10 melanomceller. Cellene ble behandlet med alfa-melanocytt-stimulerende hormon for å produsere melanin. Etter 4 dagers inkubering ble cellene fanget ved bruk av trypsin-EDTA og sonikert i 10 minutter. Supernatanten ble oppnådd ved sentrifugering ved 8000 rpm i 10 minutter og deretter justert til pH 1,5 ved bruk av 6 M HCl. Løsningen ble kokt ved 100 ◦C i 4 timer for å hydrolysere de resterende proteinfraksjonene. Løsningen som inneholdt naturlig melanin ble vasket med aceton, etterfulgt av kloroform og etanol, og deretter vasket med avionisert vann for å eliminere rester, slik som celler, mediekomponenter og proteinfraksjoner [33,34]. Alle vaskeprosesser ble utført mer enn to ganger. Til slutt ble naturlig melanin oppnådd ved frysetørking og brukt som et substrat for LMS.

3. Resultater og diskusjon

3.1. Effekten av mediatorer på melaninavfarging av LMS

Effekten av ulike mediatorer på melanin-avfargingsreaksjonen ved LMS ble undersøkt ved å bruke to laccaser fra T. versicolor (lacT) og M. thermophila (lacM) (Figur 1).Når lacT ble brukt uten mediator for melaninavfarging, var avfargingsutbyttet bare 1 prosent etter 5 timers reaksjon. Når HOBt ble brukt som en mediator for lacT, ble avfargingsutbyttet litt økt til 2 prosent etter 5 timers reaksjon. Bruken av forskjellige syntetiske mediatorer, slik som HOBt, ABTS, VLA og TEMPO, i den laccase-katalyserte oksidasjonen av fenoliske eller ikke-fenoliske forbindelser forbedret reaksjonshastighetene betydelig [10,15]. Når tilgangen til målforbindelser til det aktive stedet til lakkase er begrenset av deres steriske hindring, kan mediatorradikaler dannet av lakkase effektivt oksidere målforbindelsene ved elektronoverføring eller hydrogenatomoverføringsmekanisme [12]. HOBt er en av de mest brukte syntetiske mediatorene i LMS på grunn av dets høye redokspotensial (1,1 V) [6]. Imidlertid er HOBt ikke en god kosmetisk ingrediens på grunn av dens potensielle celletoksisitet og evne til å inaktivere laccase. Dermed valgte vi syv naturlige mediatorer, acetosyringon, syringaldehyd, p-kumarsyre, vanillin, vanillinsyre, vanillylalkohol og acetovanillon, for melaninavfargingsreaksjonen ved LMS. Interessant nok fungerer alle de naturlige mediatorene som mer effektive mediatorer enn HOBt for melaninavfarging ved mangel. Når acetosyringon, syringaldehyd og p-kumarsyre ble brukt, var avfargingsutbyttet henholdsvis 28 prosent, 22 prosent og 18 prosent etter 5 timers reaksjon. Disse resultatene demonstrerer nytten av naturlige mediatorer for melaninavfargingsreaksjonen av LMS. Mediatorene i LMS oksideres til mediatorradikaler av laccase, og mediatorradikalene induserer oksidasjon og avfarging av melanin. Når mangel ble brukt uten en mediator for melaninavfarging i løpet av en tilstrekkelig reaksjonstid, som kunne nå likevektstilstanden, var avfargingsutbyttet 7 prosent etter 24 timers reaksjon. De naturlige mediatorene, bortsett fra vanillinsyre, fungerer som mer effektive mediatorer enn HOBt for melaninavfarging ved lacT etter 24 timers reaksjon. Avfargingsutbyttet etter 24 timers reaksjon ved bruk av vanillinsyre som mediator var lavere enn etter 5 timers reaksjon. Dette kan være forårsaket av den lave stabiliteten til den oksiderte radikalformen av vanillinsyre. Når acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon ble brukt, var avfargingsutbyttet henholdsvis 34 prosent, 30 prosent og 31 prosent etter en 24 timers reaksjon. p-kumarsyre var mer effektiv til å øke den innledende reaksjonshastigheten enn acetovanillon, mens acetovanillon induserte et høyere avfargingsutbytte ved likevektstilstanden enn p-kumarsyre.

Effekten av mediatoren på avfargingsreaksjonen ved LMS ved bruk av lacM var også veldig lik den oppnådd ved LMS ved bruk av lacT. Når blonder ble brukt uten mediator for melaninavfarging, var avfargingsutbyttet bare 2 prosent etter 5 timers reaksjon. HOBt som mediator for lacM forbedret ikke avfargingsutbyttet under 5 timers reaksjonen. Alle de naturlige mediatorene, bortsett fra p-kumarsyre og vanillin, fungerte som effektive mediatorer av melaninavfarging ved lacM. Når acetosyringon og syringaldehyd ble brukt, var avfargingsutbyttet henholdsvis 25 prosent og 22 prosent etter 5 timers reaksjon. p-kumarsyre og vanillin ble brukt som effektive mediatorer for hver, men de kunne ikke effektivt øke avfargingshastigheten i LMS ved bruk av blonder. Dette kan være forårsaket av den lavere substratspesifisiteten til lacM for p-kumarsyre og vanillin. Avfargingsutbyttet etter 24 timers reaksjon av lacM med p-kumarsyre og vanillin var lik de oppnådd med lacT. Dette indikerer at de oksiderte formene av p-kumarsyre og vanillin effektivt kan avfarge melanin, selv om deres oksidasjonshastighet ved lacM var mye lavere enn den med lacT. Når lacM uten mediator ble brukt for melaninavfarging i løpet av tilstrekkelig reaksjonstid, var avfargingsutbyttet 5 prosent etter 24 timers reaksjon. De naturlige mediatorene, bortsett fra vanillinsyre, fungerer også som mer effektive mediatorer enn HOBt for melaninavfarging med lacM etter 24 timers reaksjon. Når acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon ble brukt som mediatorer for lacM, var avfargingsutbyttet henholdsvis 34 prosent, 28 prosent og 31 prosent etter 24 timers reaksjon. Når vanillinsyre ble brukt som mediator for både lacT og lacM, viste den det laveste avfargingsutbyttet. Dette kan være forårsaket av den lave stabiliteten til den oksiderte radikalformen av vanillinsyre. Khammuang og Sarnthima rapporterte at vanillin og vanillinsyre kunne brukes som mediatorer for melaninavfarging ved bruk av laccase fra Lentinus polycarpous [28]. Imidlertid viste de mye lavere avfargingsaktivitet for melanin enn acetosyringon når de ble brukt som mediatorer for lacT og blonder.

Disse resultatene indikerer at naturlige mediatorer er mer effektive for melaninavfarging av LMS enn HOBt. HOBt har blitt ansett som en effektiv syntetisk mediator for laccase på grunn av dets høye redokspotensial og den katalytiske rollen til N OH-gruppen til HOBt [5]. Effektiviteten til mediatorer for å oksidere målsubstrater er svært avhengig av evnen til å danne stabile radikaler så vel som den steriske hindring forårsaket av voluminøse alkylsubstituenter i stedet for redokspotensialet til mediatorene [19,35]. Den lave stabiliteten til det oksiderte mellomproduktet til HOBt har blitt bestemt gjennom syklisk voltammetri [6]. Derfor kan det lave avfargingsutbyttet ved LMS ved bruk av HOBt være forårsaket av den lave stabiliteten til HOBt under reaksjonsforholdene til laccase. Selv om redokspotensialet til syringaldehyd var lavere enn HOBt, viste syringaldehyd relativt høyere stabilitet enn HOBt [6].

Som vist i figur 2 har de naturlige mediatorene som brukes i dette arbeidet forskjellige substituenter (f.eks. hydroksyl, metoksy, karboksyl, keton eller aldehyd) i forskjellige posisjoner på benzenringen [12,19]. Mediatorer med to metoksygrupper (acetosyringon og syringaldehyd) viste høyere avfargingshastigheter enn de med en metoksygruppe. Avfargingshastigheten oppnådd med p-kumarsyre uten metoksygruppe var avhengig av typen lakkase. P-kumarsyren med lacT viste en høyere avfargingshastighet enn de med en metoksygruppe, mens p-kumarsyren med lacM viste den laveste avfargingshastigheten i 5 timers reaksjonen. Fillat et al. viste også lignende resultater for avfarging av fleksografiske blekk med sopplakkaser med naturlige mediatorer [36]. De fenoliske naturlige mediatorene (acetosyringon, metylsprøyte og syringaldehyd) med to metoksysubstituenter i ringen ble oksidert av laccase raskere enn p-kumarsyre uten metoksygruppe. Dette indikerer at metoksygrupper spiller en viktigere rolle som elektrondonorer enn dobbeltbindingen til sidekjeden til p-kumarsyre. Når mediatorene med én metoksygruppe ble sammenlignet, økte avfargingsutbyttet i følgende rekkefølge: acetovanillon > vanillin > vanillylalkohol > vaniljesyre. Acetovanillon, som har en ketongruppe, viste en høyere avfargingshastighet og utbytte enn mediatorene med aldehyd-, hydroksyl- og karboksylgrupper. Acetosyringon med en ketongruppe viste også en høyere avfargingshastighet og utbytte enn syringaldehyd med en aldehydgruppe.

I de følgende eksperimentene ble acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon, som viste høy melaninavfargingsevne, valgt som mediatorer for LMS for å avfarge melanin. Effekten av mediatoren på avfargingsreaksjonen av LMS ble undersøkt over tid (figur S1). Avfargingsreaksjonen ved bruk av lacT med acetosyringon, syringaldehyd og acetovanillon resulterte i henholdsvis 21 prosent, 18 prosent og 1 prosent avfargingsutbytte etter 1 times reaksjon. Avfargingsreaksjonen ved bruk av lacM med acetosyringon og syringaldehyd resulterte i henholdsvis 19 prosent og 18 prosent avfargingsutbytte etter 1 times reaksjon. Begge laccasene viste lignende reaksjonsprofiler når samme mediator ble brukt. Acetosyringon og syringaldehyd økte avfargingshastigheten betydelig under den første reaksjonen. Disse resultatene viser at acetosyringon og syringaldehyd inneholdende dimetoksygrupper var mer effektive til å øke den initiale hastigheten for avfarging av LMS enn acetovanillon inneholdende en metoksygruppe. Fillat et al. rapporterte også at metoksygruppene i ringstrukturene til mediatorer fungerer som akseleratorer for oksidasjon av substrater [36]. På den annen side var avfargingsutbyttet etter 24 timers reaksjon med acetovanillon lik det med syringaldehyd, selv om acetovanillon forbedret reaksjonshastigheten moderat.

For mer informasjon: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501