Lamivudin forbedrer kognitiv nedgang hos SAMP8-mus: Integrering av in vivo farmakologisk evaluering og nettverksfarmakologi

Taxol alternative kinesiske urter Cistanche

Nøkkelord:Aspergillus favus · Jojoba · Endofytiske sopp · Gullnanopartikler · Taxol · -Bestråling · Ernæringsoptimalisering

Introduksjon

Taxol er en av de mest kommersialiserte bredspektretkreftmedisiner[1]. Aktiviteten til Taxol utdyper seg fra dens unike spesifisitet for binding med de cellulære tubulin-subenhetene heterodimer, fremmer tubulinpolymerisasjon, og forstyrrer dermed den mitotiske delingen av tumorceller [2]. Taxol viste en sterk aktivitet mot bryst, lunge, hode og nakke, livmorkreft og avanserte former for Kaposis sarkom [3]. Taxol ble først produsert fra barken av barlind Taxus brevifolia "familie Taxaceae" [4, 5]; imidlertid lavere utbytte av Taxol som er<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as astma,betennelse, ogkreft[32]. Derfor var hovedmålet med dette arbeidet å utforske et nytt soppisolat fra jojobaplante med unik metabolsk stabilitet for Taxol-produksjon, for å evaluere de forskjellige tilnærmingene for å maksimere deres Taxol-utbytte, samt å forbedre den antiproliferative aktiviteten til ekstraherte Taxol-forbindelser. via konjugering med gullnanopartikler, mediert av gammabestråling.

Materialer og metoder

Isolering og dyrking av endofytiske sopp

Ulike deler av jojoba (Simmondsia chinensis) som blader, bark, kvister og knopper ble samlet inn fra fakultetet for landbruk, Kairo University, og brukt som kilde for endofytiske sopp. Plantedelene ble samlet og vasket under rennende vann fra springen, overflatesterilisert med 70 prosent etanol i 1 min og deretter skylt med sterilt vann [28]. De overflatesteriliserte plantedelene ble kuttet i små biter under sterile forhold og plassert på plater med potet dekstrose agar (PDA) medium, Czapek's-Dox og maltekstrakt agar medium [33–36], og platene ble inkubert ved 30 grader for 10 dager. Effektiviteten av overflatesterilisering av plantedelene ble vurdert ved sentrifugering av skyllevannet, deretter ble 500 ul sterilt vann tilsatt til bunnfallet og sådd ut i PDA-medium [37]. De rensede endofytiske soppisolatene ble inokulert på PDA-skråninger i 7 dager og lagret ved 4 grader

Screening, ekstraksjon og kvantifisering av taxol fra endofytiske sopp

De gjenvunnede endofytiske soppene som bor i jojoba ble screenet for Taxol-produksjon ved å dyrke på potet dekstrosebuljong (PDB) [38]. En plugg av hvert av de 7 dager gamle isolatene for morsomme jenter ble inokulert i 100 ml PDB/250 ml Erlenmeyer-oppgaver, inkubert i 15 dager ved 30±1 grad, under risteforhold (120 rpm). Etter inkubering ble kulturene filtrert, og filtratet ble endret med 0,2 prosent natriumbikarbonat for å utfelle fettsyrer. Taxol har blitt ekstrahert med diklormetan, og den organiske fasen ble samlet og inndampet til tørrhet, og restene ble løst opp i metanol på nytt [17, 39]. Taxol ble separert og identifisert ved TLC ved bruk av Merck 1 mm (20×20 cm) forhåndsbelagte silikagelplater (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Tyskland), detektert ved UV-belysning ved 254 nm [39]. De antatte flekkene av Taxol ble skrapet av fra TLC-silikagelplatene og oppløst i metanol, vortexet kraftig i 10 minutter og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 minutter. De utfelte silikapartiklene ble fjernet, og supernatanten ble tatt for Taxol-kvantifisering og renhetskontroll ved HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Korea) av C18 reversfasekolonne (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3,5 μm, Kat. # 959 963–902). Den mobile fasen som ble brukt var metanol/acetonitril/vann (25:35:40, v/v/v) med en strømningshastighet på 1,0 ml/min i 20 minutter [40], og taksolfraksjoner ble målt ved 227 nm, og deres kjemisk identitet og konsentrasjoner ble bekreftet fra retensjonstid og absorpsjonstoppareal sammenlignet med autentisk prøve.

Morfologisk og molekylær identifisering av de gjenvunnede endofytiske soppene

De endofytiske soppisolatene ble identifisert til deres artsnivåer basert på deres makro- og mikromorfologiske egenskaper ved å dyrke på PDA, Czapek's-Dox og maltekstraktmedier i henhold til referansens nøkler [33–36]. Identiteten til de mest potente Taxol-produserende soppisolatene ble ytterligere molekylært bekreftet basert på sekvensen av intern transkribert spacer (ITS) [41, 42]. Soppgenomisk DNA (gDNA) ble ekstrahert ved å pulverisere mycelet (~0,2 g) i flytende nitrogen, deretter dispensere i 1 ml CTAB ekstraksjonsbuffer (2 prosent CTAB, 2 prosent PVP40, { {21}},2 prosent 2-merkaptoetanol, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl i 100 mM Tris-HCl, pH 8,0). PCR-primersettene var ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ og ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. PCR-reaksjonen inneholder 10 ul 2×PCR-masterblanding (i-Taq™, kat.nr. 25027), 2 ul gDNA, 1 ul av hver primer (10 pmol/ul), og fullført til 20 ul med steril destillert vann. PCR ble programmert til initial denaturering ved 94 grader i 2 minutter, denaturering ved 94 grader i 30 s, annealing ved 55 grader i 10 s, forlengelse ved 72 grader i 30 s i 35 sykluser, og siste forlengelse ved 72 grader i 2 min. PCR-amplikonene ble analysert med 1,5 prosent agarosegel i 1×TBE-buffer (Ambion Cat# AM9864), ved bruk av 1 kb DNA-stige (Kat. # PG010-55DI) og visualisert med geldokumentasjonssystem. Amplikonene ble renset og sekvensert av Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, versjon 6.0 med de samme primersettene. De oppnådde sekvensene ble BLAST-søkt ikke-redundant på NCBI-databasen, importert til MEGA 6.0-programvare og justert med Clustal W muskelalgoritmen [43] og det fylogenetiske treet ble konstruert med nabosammenføyningsmetoden til MEGA 6.0 [44].

Kjemisk struktur av den ekstraherte taxolen

De antatte flekkene av Taxol ble skrapet av fra TLC-silikagelplatene og renset, og renheten og konsentrasjonen ble bestemt ved UV–Vis-analysene ved λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Series) sammenlignet med autentisk Taxol [39]. Blanke medier under de samme forholdene ble brukt som en negativ baseline for de spektrofotometriske analysene. FT-IR-spekteret til de rensede Taxol-prøvene ble analysert med JASCO FT-IR 3600 spektrofotometer. Taxol-prøven ble malt med KBr-pellets, presset inn i skiver under vakuum, og absorpsjonen ble målt i området 400 til 4000 cm−1 [3], sammenlignet med den autentiske. Den kjemiske strukturen til ekstrahert Taxol ble bekreftet fra HNMR-spektroskopi (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) sammenlignet med autentisk Taxol. Prøvene ble oppløst i CDCl3, kjemiske skift er gitt i ppm (δ-skala), og koblingskonstantene er uttrykt i hertz (Hz).

Effekten av forskjellige typer medier på Taxol-produksjonen

To agarplugger (9 mm) fra 7 dager gamle kulturer av hvert soppisolat ble inokulert i tre eksemplarer i 100 ml medium/250 ml Erlenmeyer-kolbe med potetdekstrose (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D og maltekstrakt (ME) ) buljongmedier. Uinokulerte kontroller fra hvert medium som er fri for soppsporer ble brukt som en negativ kontroll, inkubert ved 30 grader i 15 dager under de samme forholdene. Etter inkubering ble soppkulturer filtrert, og Taxol ble ekstrahert og bestemt som nevnt ovenfor.

Bioprosessoptimalisering av ernæringsforholdene for å maksimere Taxol-utbyttet

Optimalisering av mediumsammensetningen for å maksimere Taxol-utbyttet av det potente fungal-isolatet ble utført ved hjelp av responsoverflatemetodikk ved bruk av Placket-Burman-design etterfulgt av sentral komposittdesign [17–20, 45]. Fra RSM-designene ble de positive og signifikante variablene som påvirker Taxol-produksjonen av det potente soppisolatet vurdert ved bruk av den statistiske programvarepakken fra Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA). Hvert eksperiment ble kjørt i tre biologiske replikater og gjennomsnittsverdiene ble vurdert. Etter inkubering ved de ønskede forholdene ble soppbiomasse filtrert, og Taxol ble ekstrahert og kvantifisert ved TLC og HPLC som beskrevet ovenfor.

Placket-Burman-design

Placket-Burman-designet har blitt ofte brukt for optimalisering av mediekomponenten for soppvekst og produksjon av bioaktive sekundære metabolitter, ved å evaluere de signifikante variablene som påvirker Taxol-produksjonen [18, 20, 46]. Valget av faktor var basert på medier brukt i kvalitativ og kvantitativ screening. Elleve faktorer er inkludert; maltekstrakt, pepton, sukrose, soyton, glutamin, biffekstrakt og temperatur, pH, inkubasjonstid og ristehastighetsverdier og faktorer ble variert over to nivåer, og minimums- og maksimumsnivåområdene ble valgt. Den statistiske Design-Expert 7.0 ble brukt til å generere et sett med 12 eksperimenter. For hvert eksperiment ble Taxol-produksjonen bestemt i tre biologiske replikater, og gjennomsnittet av Taxol-utbyttet ble vurdert.

Regresjonsanalyse av dataene ble utført ved bruk av statistisk programvare. Effekten av hver variabel ble beregnet (Biometrika, 2020), ved å bruke følgende ligning:

hvor, E er effekten av en testvariabel, M pluss og M− er Taxol-konsentrasjonen av forsøk ved at parameteren var på henholdsvis høyere og lavere nivåer, og N er antall eksperimenter som ble utført. Effekten av hver variabel på produksjonen ble bestemt ved å beregne deres respektive E-verdier.

Der Tot høy er den totale responsen på høyt nivå, Tot lav er den totale responsen på lavt nivå, og Nei er antall forsøk.

Sentralt sammensatt design og interaksjoner mellom faktorer som påvirker Taxol-produksjonen

De mest signifikante positive faktorene som påvirker Taxol-produksjonen av den valgte soppisolasjonen ble optimalisert ved bruk av en responsoverflatetype CCD-modell eksperimentell design [47]. Ved å bruke CCD ble konsentrasjonene av mediumkomponentene optimalisert, og deres studerte interaksjoner ble brukt til å generere totalt 20 eksperimenter for de tre variablene. For å bestemme de optimale nivåene av variablene for Taxol-produksjon fra det potente soppisolatet, ble tredimensjonale (3D) responsoverflatekurver plottet for å studere interaksjonen mellom de forskjellige faktorene og for å bestemme den variable tilstanden til hver faktor som påvirker Taxol-produksjonen. 3D-grafene ble utført ved å holde tre faktorers konstanter på et ideelt nivå og plotte den oppnådde responsen av Taxol-utbytte for varierende nivåer av de to andre faktorene.

Effekt av gammabestråling på taxolutbytte

De potente endofytiske isolatene som produserer Taxol ble utsatt for -bestråling med 60koboltkilde (gammacelle 4000-A-India) ved forskjellige gammastrålingsdoser (0.25–3.0 kGy) sammenlignet til kontroll av den ikke-bestrålte kulturen; en dosehastighet på 1,2 kGy/t ved forsøkstidspunktet. De optimaliserte media ble inokulert av den bestrålte kulturen under standard kulturbetingelser, sammenlignet med den ikke-bestrålte sporens inokulum som kontroll. Kulturene ble inkubert ved 30±2 grader i 15 dager på en roterende rister (120 rpm). Etter inkubering ble kulturene filtrert og Taxol ble ekstrahert, renset og kvantifisert ved TLC og HPLC som beskrevet ovenfor.

Syntese og karakterisering av gullnanopartikler (AuNPs); Konjugering med Taxol

Antikreftaktivitet av Taxol

Aktiviteten til de rensede Taxol- og Taxol-PVP-AuNPs-konjugatene mot leverkarsinom (HPG2) og brystkarsinom (MCF7) ble bestemt av 3- (4,5-dimetyltiazol- 2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)-analyse [48]. 96-brønnplaten ble sådd med 103 celler per brønn og inkubert over natten ved 37 grader, deretter ble forskjellige konsentrasjoner av medikamentet tilsatt, og platene ble re-inkubert i 48 timer. MTT-reagenset (25 ul) ble tilsatt og inkubert i 2 timer, og den lilla fargen til det utviklede formazankomplekset ble målt ved λ570 nm. IC50-verdien ble uttrykt ved mengden medikament som reduserte veksten av 50 prosent av et initialt antall tumorceller som normaliserte seg til positiv kontroll.

Antimikrobiell aktivitet av Taxol og Taxol-AuNPs konjugater

Den antimikrobielle aktiviteten til Taxol- og Taxol-AuNPs-konjugater ble vurdert mot forskjellige bakterieisolater; Bacillus subtilis ATCC 6633 og Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og Enterobacter agglomerans, i tillegg til Candida albicans. De testede bakteriecellene ble suspendert i sterilt peptonvann for å oppnå standard inokulum på ~0.5 McFarland (1–1.5)× 1{{10}}8 CFU/ml ved λ6{{18 }}0 nm. Veksthemmingen (mm) av vekst av mikrobielle patogener ble vurdert ved hjelp av agarskive-difusjonsmetode. Sterile standard antibiotikaskiver med en diameter på 6,0 mm ble brukt som positive kontroller. Sterile antibiotikaskiver (6,0 mm) ble lastet med 20 ul metanol og amoksicillin-klavulansyre (AMC) som negativ og positiv kontroll. Platene ble lastet med samme konsentrasjon av Taxol, Taxol-PVP-AuNPs og AuNPs (1,0 ug/ml). Tre biologiske replikater ble fremstilt. Platene ble inkubert ved 37 grader i 24 timer, og inhiberingssonene ble målt. Amoxicillin clavulanic acid (AMC) og nystatin ble brukt for å normalisere den antimikrobielle aktiviteten til Taxol. Inhiberingssonen for vekst ble bestemt ved hjelp av en vernier-skyvelære (mm).

Statistiske analyser

Morfologisk og molekylær identifisering av de potensielle taxolprodusentene

Morfologiske trekk ved det potente soppisolatet som produserer Taxol ble undersøkt i henhold til de makroskopiske og mikroskopiske deskriptive nøklene, som beskrevet i Materialer og metoder, og avslørte dets morfologiske nærhet til A. favus (fig. 2). Soppisolatet ble dyrket på PDA ved 30 grader i 10 dager, og de makroskopiske og mikroskopiske egenskapene avslørte identiteten til slik som konidiale hoder, forgreningsmåte, identiteten til stigmatisering og konidial ontologi, og dannelse av fruktlegemer, ifølge den universelle morfologiske nøkler [33], og ble funnet å være identiske med Aspergillus favus. Det potente Taxol-produserende isolatet A. favus ble videre identifisert basert på deres ITS-sekvenser, ved å bruke gDNA som en mal. PCR-amplikonene (~550 bp) av A. favus ble løst, renset og sekvensert (fig. 2). ITS-sekvensen til A. favus var ikke-redundant blast-søkt på NCBI-databasen, og viste 99 prosent likhet med A. favus, med null E.-verdier og 95 prosent søkedekning. Således, fra de mikroskopiske og molekylære analysene, ble målisolatet bekreftet som A. favus og deponert på GenBank med tilgangsnummer MW485934.1, samt at isolatet er deponert ved Assiut University Mycological Center (AUMC), Egypt med en deponeringsnummer AUMC13892. Det nåværende isolatet hadde 99 prosent likhet med A. favus-isolatene MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Fig. 1 En morfologisk visning av jojobaplante. B Platekulturer av de potente Taxol-produserende endofytiske soppene; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) og A. oryzae Bd (25) på PDA etter 8 dager o inkubasjon ved 30 grader. Soppisolatene ble dyrket på PDB og inkubert ved standardbetingelser, og Taxol ble ekstrahert og kontrollert ved TLC (C). D HPLC-kromatogram av Taxol fra de potente soppisolatene. E Utbytte av Taxol som kvantifisert fra HPLC. F, UV-Vis spektral analyse av ekstrahert Taxol fra soppisolatene. G FT-IR-analyse av ekstrahert Taxol sammenlignet med autentisk

Fig. 2 A Makromorfologiske trekk ved A. favus en endofytt av jojoba etter 3, 5 og 8 dagers vekst på PDA. Mikromorfologiske trekk, konidialt hode av A. favus ved 400X forstørrelse. C PCR-amplikon av A. favus ITS-region på 500 bp, normalisert til 1 kb stige (kat.nr. SM0312). D Fylogenetisk analyse av ITS A. favus ved maksimal sannsynlighetsmetode [44]