Lysosomal lipidperoksidasjon regulerer tumorimmunitet
Sep 19, 2023
Lysosomal inhibering fremkalt av palmitoyl-protein tioesterase 1 (PPT1)-hemmere som DC661 kan produsere celledød, men mekanismen for dette er ikke fullstendig forstått. Programmerte celledødsveier (autofagi, apoptose, nekroptose, ferroptose og pyroptose) var ikke nødvendig for å oppnå den cytotoksiske effekten av DC661. Hemming av katepsiner, eller jern- eller kalsiumkelering, reddet ikke DC661-indusert cytotoksisitet. PPT1-hemming induserte lysosomal lipidperoksidasjon (LLP), noe som førte til lysosomal membranpermeabilisering og celledød som kunne reverseres av antioksidanten N-acetylcystein (NAC), men ikke av andre lipidperoksidasjonsantioksidanter. Den lysosomale cysteintransportøren MFSD12 var nødvendig for intralysosomal transport av NAC og redning av LLP. PPT1-hemming produserte celle-iboende immunogenisitet med overflateekspresjon av calreticulin som bare kunne reverseres med NAC. DC661-behandlede celler primet naive T-celler og forbedret T-cellemediert toksisitet. Mus vaksinert med DC661-behandlede celler fremkalte adaptiv immunitet og tumoravvisning i "immune varme" svulster, men ikke i "immune kalde" svulster. Disse funnene viser at LLP driver lysosomal celledød, en unik immunogen form for celledød, og viser vei til rasjonelle kombinasjoner av immunterapi og lysosomal hemming som kan testes i kliniske studier.
Fordeler med cistanche tubulosa-Antitumor
Introduksjon
Med oppmuntrende aktivitet i kliniske studier som involverer den lysosomale hemmeren hydroksyklorokin (HCQ) (1), identifisering av palmitoyl-proteintioesterase 1 (PPT1) som det molekylære målet for klorokinderivater (2), og lanseringen av nye PPT1-hemmere i kliniske forsøk (3, 4), er det behov for å forstå mekanismen som lysosomale inhibitorer induserer celledød og effekten av lysosomal hemming på tumorimmunitet. Den kanoniske mekanismen for lysosomal celledød beskrevet for HCQ involverer lysosomal membranpermeabilisering (LMP), lekkasje av katepsiner og aktivering av kaspasemediert apoptose (5, 6). Vi har tidligere vist at den lysosomale inhibitoren DC661 penetrerer celler i det sure tumormikromiljøet og lokaliserer seg til lysosomet mer effektivt enn HCQ (2, 7). DC661 produserer potent celledød på tvers av mange kreftcellelinjer (2). DC661 binder og hemmer PPT1, avsyrer lysosomet og hemmer autofagi. DC661 induserer også LMP og øker nivåene av spaltet kaspase 3 (2, 7). De siste årene har nye mekanismer for celledød som har immunogene konsekvenser blitt definert og inkluderer nekroptose, ferroptose og pyroptose (8). Lysosomavhengig autofagi har vist seg å bryte ned MHC klasse I (9), så vel som komponenter i immunproteasomet (10), noe som tyder på at autofaghemming kan forbedre antigenprosessering. Imidlertid er de immunogene effektene av lysosomal inhibering og påfølgende celledød ikke blitt fullstendig karakterisert. For å adressere dette kunnskapsgapet, undersøkte vi effekten av DC661 på kanoniske celledødsmekanismer for å bestemme om lysosomal celledød er dens form for celledød eller bare en forløper til en av de andre etablerte mekanismene. Vi fant at HCQ og DC661 induserte en signifikant økning i bare et lite antall proteiner i melanomproteomet, og de fleste av disse var autofagi- og apoptose-relaterte proteiner. Hemmere av programmert celledød (apoptose, nekroptose, ferroptose og pyroptose) dempet ikke cytotoksiske effekter etter lysosomal svekkelse av DC661. Lysosomal lipidperoksidasjon (LLP) er en hoveddriver for LMP-indusert celledød assosiert med calreticulin (CALR) uttrykk på celleoverflaten. Denne formen for celledød kan kun reverseres ved å bruke antioksidanten N-acetylcystein (NAC). NAC-aktivitet ble svekket av hemming av lysosomal cysteinimportør MFSD12. LLP fremkalte immunogene fenotyper som fremmet T-celle-mediert drap. Disse funnene viser at lysosomal celledød er en potensielt unik form for immunogen celledød.
cistanche planteøkende immunsystem
Resultater
Lysosomal inhibering induserer betydelige endringer i proteomet assosiert med autofagi og apoptose. For å etablere de cytotoksiske effektene av lysosomale hemmere, vurderte vi levedyktigheten til A375P melanom, RKO kolonkarsinom og MIA PaCa-2 kreftcellelinjer i bukspyttkjertelen behandlet med den vakuolære H+-ATPase-hemmeren bafilomycin-A1 (1) 00 nM); PPT1-hemmere DC661 (3 μM) eller HCQ (10 μM eller 30 μM); palmitatmimetisk heksadecylsulfonylfluorid (HDSF; 60 μM); katepsin-hemmere pepstatin A (PepA; 10 ug/ml), E64 (PepA; 10 ug/ml), eller PepA+E64; og lysosomale membranforstyrrende Leu-Leu-metylesterhydrobromid (20 μM) i 48 timer. Bare bafilomycin-A1 og DC661 forårsaket en betydelig reduksjon i cellelevedyktighet på tvers av kreftcellelinjene (figur 1A og tilleggsfigur 1A; tilleggsmateriale tilgjengelig online med denne artikkelen; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), med DC661 som produserer en mer dyptgripende reduksjon i cellelevedyktighet enn bafilomycin-A1. Basert på disse dataene og de farmakologiske medikamentlignende egenskapene til klorokinderivater, fokuserte vi vår studie på klorokinderivater som verktøy for å forstå lysosomal celledød. En objektiv global proteomanalyse ble brukt på A375P melanomceller behandlet med DC661 (3 μM) eller den mindre potente HCQ (10 μM eller 30 μM) i 24 timer. Av de 4 264 kvantifiserte proteinene med høy konfidens var bare 87 og 55 proteiner signifikant økt med henholdsvis DC661 (3 μM) og HCQ (30 μM); i tillegg ble 14 og 15 proteiner signifikant redusert med henholdsvis DC661 (3 μM) og HCQ (30 μM) (absolutt fold endring på mer enn 2; q < 0,05) med henholdsvis DC661 (3 μM) eller HCQ (30 μM). , sammenlignet med kjøretøykontroll. Den lavere dosen av HCQ (10 μM) viste ingen signifikante proteinendringer sammenlignet med vehikelkontroll. De 50 beste proteinene som ble betydelig økt etter DC661-behandling var hovedsakelig assosiert med autofagi og apoptose, og lignende endringer ble observert for den høyere dosen av HCQ (figur 1B). Av disse grunnene valgte vi å fokusere videre studier på den mer potente DC661. Eksempler på noen av de største proteinendringene assosiert med autofagi og apoptose var skatte-1-bindende protein 1 (TAX1BP1; økt 15-fold); BCL2-interagerende protein 3 (BNIP3; økt 6-fold); nabo til BRCA1 gen 1 protein (NBR1; økt 12- ganger); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; økt 5-fold); nukleær reseptor koaktivator 4 (NCOA4; økt 3- ganger); og LC3B (MAP1LC3B; økt 3- ganger). Apolipoprotein B-100 (APOB; økt 66-fold) ble avledet fra føtalt kalveserum og ble ikke studert videre. Immunoblotting bekreftet at behandling med DC661 eller høyere konsentrasjoner av HCQ ga markerte økninger i uttrykket av autofagi-lastreseptorer NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 og NCOA4 på en dose- og tidsavhengig måte (Supplerende figur 1, B og C). CRISPR/Cas9 KO av PPT1 i A375P-celler fenokopieret effekten av DC661 på disse proteinene sammenlignet med deres WT-kolleger (tilleggsfigur 1D). Imidlertid var uttrykket av autofagi-lastreseptorer og den relative økningen indusert av DC661-behandling varierende på tvers av tykktarmskreft, kreft i bukspyttkjertelen og andre melanomcellelinjer der DC661 viser cytotoksisitet (tilleggsfigur 1E). Dette antydet at autofagi-lastreseptorer i seg selv, selv om de er økt på proteinnivå, er usannsynlig å være ansvarlige for celledød etter DC661-behandling. For å bekrefte dette fokuserte vi på autofagi-lastreseptorer TAX1BP1 og BNIP3 fordi de har kjente proapoptotiske effekter i kreftceller (figur 1C). TAX1BP1 er en autofagi-lastadapter (11) og regulerer også apoptose indusert av proteinsyntesehemmere eller DNA-skadelige midler i kreftceller (12). Nedbrytning av TAX1BP1 av siRNA (Figur 1D) påvirket ikke DC661-indusert cytotoksisitet i kortsiktige (Figur 1E) og langsiktige levedyktighetsanalyser (Figur 1F). Disse resultatene viste at TAX1BP1 ikke spiller en viktig rolle i DC661-mediert cytotoksisitet. BNIP3 er et proapoptotisk protein som svekker mitokondriell bioenergetikk og regulerer mitofagi (13). Effektiv knockdown av BNIP3 (figur 1G) påvirket ikke DC661-indusert cytotoksisitet (figur 1, H og I). Disse resultatene viste at de cytotoksiske effektene av DC661 er uavhengige av BNIP3-ekspresjon. Deretter studerte vi effekten av å utarme celler av kanoniske autofaggener som kreves for autofagosomerproduksjon på DC661-effektivitet ved å slå ned unc-51 som autofagiaktiverende kinase 1 (ULK1) og autofagi-relatert gen 7 (ATG7). Effektiv knockdown av ULK1 eller ATG7 (tilleggsfigur 2, A og B) hemmet autofagisk fluks (tilleggsfigur 2C), men påvirket ikke DC661-indusert cytotoksisitet (figur 1, J–M). Disse resultatene viste at fraværet av det essensielle kjerneautofagi-maskineriet ikke opphever de cytotoksiske effektene av DC661. Lysosomal inhibering av DC661 induserer flere programmerte celledødsveier. Det kanoniske synspunktet er at lysosomal celledød skyldes apoptose (5). Immunoblotting avslørte at DC661-behandling resulterte i aktivering av caspase-3, -7 og -9 og spaltning av PARP-1, noe som bekrefter at DC661 aktiverte apoptose (figur 2A). Pan-caspase-hemmeren Z-VAD-FMK forhindret kaspaseaktivering av DC661, men hemmet ikke akkumuleringen av LC3B og p62, noe som demonstrerer at apoptoseaktivering og autofagiblokkering kan separeres etter lysosomal hemming (Figur 2B). Blokkering av apoptose med ZVAD-FMK forbedret eller begrenset ikke DC661 cytotoksisitet, noe som tyder på at apoptose er unødvendig for lysosomal celledød (figur 2, C og D). De cytotoksiske effektene av DC661 var like i Bax/Bak dobbelt-KO primære benmargsceller som ikke var i stand til å gjennomgå apoptose og WT-celler (figur 2E). Blokkering av apoptose påvirket ikke DC661-indusert cytotoksisitet i tykktarmskreft og kreftceller i bukspyttkjertelen (tilleggsfigur 2, D–F). Fordi vi fant at apoptose var unødvendig for DC661-indusert celledød, undersøkte vi om DC661 induserer nekroptose, en annen form for programmert celledød regulert av reseptorinteragerende proteinkinase (RIPK) og blandet kinasedomene-lignende protein ( MLKL). Nivåene av de fosforylerte og aktiverte formene av RIPK og MLKL ble økt etter DC661-behandling fra 0,1–1 μM (Figur 2F). Ved 3 μM DC661 var det fravær av fosforylert RIPK1, men vedvarende fosforylert MLKL, noe som tyder på at ved denne høyere konsentrasjonen kan flere former for celledød bli involvert. Forbehandling med RIPK1-hemmerne nekrostatin-1 eller nekrostatiner-1 eller MLKL-hemmeren nekrosulfonamid forhindret fosforylering av RIPK1 etter DC661-behandling (1 μM) i melanomceller (figur 2G, men klarte ikke å redde{1G DC2) }}indusert cytotoksisitet i melanomceller (figur 2H) eller tykktarmskreft eller kreftceller i bukspyttkjertelen (tilleggsfigur 2G). Disse funnene tyder på at nekroptose er aktivert, men unødvendig for DC661-mediert celledød.
Figur 1. Lysosomal autofaghemming induserer betydelige endringer i apoptose- og autofagiproteiner. (EN)
Lysosomer er et av de viktigste lagringsstedene for jern. Dysregulert intracellulær jernmetabolisme kombinert med redusert reduktiv kapasitet kan utløse en ikke-apoptotisk celledød kjent som ferroptose. Et kjennetegn på ferroptose er oppregulering av prostaglandin-endoperoksidsyntase 2 (PTGS2), kationtransportregulatorhomolog 1 (CHAC1) og cysteinyl-tRNA-syntetase (CARS) (14). Alle 3 av disse ferroptosemarkørene ble transkripsjonelt oppregulert ved DC661-behandling (figur 3A), noe som tyder på at lysosomal inhibering induserer ferroptose. DC661 induserte et fluorescensskift i C11-BODIPY-behandlede A375P-celler, noe som indikerer lipidperoksidasjon, karakteristisk for ferroptose. Dette DC661-induserte skiftet ble signifikant reversert i nærvær av ferroptosehemmere ferrostatin-1 eller lepperoksstatin-1 administrert i en effektiv konsentrasjon (figur 3B og tilleggsfigur 3A), noe som ytterligere indikerer at DC661 indusert ferroptose. Ferroptoseinhibering reddet imidlertid ikke cytotoksisiteten assosiert med DC661 (figur 3, C og D). Samtidig behandling av kreftceller med jernkelatoren deferoxamine (DFO) og DC661 reddet ikke cytotoksisiteten til DC661 (Figur 3E). Behandling med ferrostatin-1, lepperoksstatin-1 eller DFO reddet ikke DC661-hemming av kortsiktig levedyktighet eller langsiktig klonogen vekst i melanom-, tykktarms- og bukspyttkjertelkreftceller (tilleggsfigur 3, B) –E, og tilleggsfigur 4, A–D). Disse dataene viser at ferroptose er aktivert, men uunnværlig for DC661-mediert celledød. En pyroptose er en form for programmert celledød assosiert med en inflammatorisk respons som involverer aktivering av kaspaser som behandler gastrin (GSDM), som tillater poredannelse på plasmamembranen og påfølgende frigjøring av skadeassosierte molekylære mønstre, for eksempel høy mobilitet gruppeboks 1 (HMGB1). DC661-behandling i flere melanomcellelinjer (A375P, A375, WM35 og WM793) resulterte i aktivering av initiatorcaspase-8 og -9 og bøddel-caspase-7, typisk for pyroptose, og produsert spaltning av full-lengde GSDME, tilsvarende i utstrekning som den kjente pyroptose-induseren PLX4720 og PD0325901 (tilleggsfigur 5A). DC661 produserte en sterkere ekstracellulær frigjøring av HMGB1 enn den kjente pyroptose-induseren, BRAF og MEK-hemming i 1 % FBS (15), noe som gjenspeiler den funksjonelle konsekvensen av aktivert pyroptose. Deretter testet vi om hemming av pyroptose av GSDME KO ville forbedre de cytotoksiske effektene av DC661. DC661-behandling induserte LC3II- og SQSTM1/p62-akkumulering og kaspaseaktivering, men HMGB1-frigjøring ble nesten fullstendig opphevet i GSDME-KO WM35 humane celler, noe som demonstrerte at den funksjonelle konsekvensen av å hemme pyroptose ble oppnådd (Figur 3F). Imidlertid produserte DC661-behandling lik cytotoksisitet i YUMM1.7 WT, tom vektor (EV) og Gsdme KO1- og KO2-celler i både 10% og 1% FBS-forhold (figur 3G og tilleggsfigur 5B). Et vanlig resultat av flere former for celledød er frigjøring av LDH. DC661 ga en signifikant økning i LDH-frigjøring, og dette kunne ikke reverseres ved apoptose, nekroptose eller ferroptose-hemming (tilleggsfigur 5C). Disse resultatene viste at DC661 induserer flere moduser for celledød, inkludert apoptose og pyroptose samt nekroptose og ferroptose, men ingen av disse modusene for celledød er nødvendige for DC661-indusert celledød. Cathepsin-hemming eller kalsiumkelering forhindrer ikke celledød fra lysosomal membranpermeabilisering. Etter å ha demonstrert at kaspaseaktivering (som er nødvendig for apoptose og pyroptose) er unødvendig for DC661-indusert celledød, antok vi at cathepsinfrigjøring fra lysosomer kunne forårsake kaspaseavhengig celledød. Kjemisk (DC661) eller genetisk (PPT1 siRNA [siPPT1]) hemming av PPT1 produserte lysosomal membranpermeabilisering (LMP), mens HDSF, en mindre kraftig irreversibel hemmer av PPT1 som blir utarmet raskt i cellekultur, ikke kunne indusere LMP, som målt av galectin-3–positiv puncta (Figur 4A). LMP resulterer i frigjøring av katepsiner og annet lysosomalt innhold i cytoplasmaet og antas å være et nøkkelproksimalt trekk ved lysosombasert celledød. LMP indusert av DC661 var assosiert med en signifikant økning i cytoplasmatisk cathepsin-L-aktivitet, som ble signifikant blokkert med en cysteinproteasehemmer E64 (figur 4B). Tidligere rapporter har antydet at cathepsinfrigjøring fra frakturerte lysosomer fremmer kaspaseaktivering, noe som fører til apoptotisk celledød (16–18). Fullstendig cathepsin-hemming forhindret ikke kaspasespaltning (Figur 4C) og reddet ikke DC661-indusert cytotoksisitet i kortsiktige og langsiktige levedyktighetsanalyser ved melanom (Figur 4, D og E), tykktarmskreft og bukspyttkjertel kreftceller (Supplerende figur 6, A–C). Disse resultatene motvirker det kanoniske synet på lysosomal celledød som drevet av katepsinmediert celledød. I tillegg til frigjøring av katepsin fra utette lysosomer, har kalsiumfrigjøring fra lysosomer vært involvert i cellulær dysfunksjon når PPT1 er svekket (19). DC661-behandling resulterte i omfattende kalsiumfrigjøring, som ble opphevet ved forbehandling av celle permanent kalsium (Ca2+) chelator, BAPTA-AM. (Figur 4F). Spesielt forhindret ikke BAPTA-AM DC661-indusert LMP (figur 4G) eller caspasespaltning (tilleggsfigur 6, D og E) og, viktigst av alt, reddet ikke DC661-indusert cytotoksisitet ( Figur 4H). Disse funnene ble også observert i både RKO- og MIA PaCa-2-cellelinjer, der ingen signifikante forskjeller i IC50-verdier ble observert med BAPTA-AM og DC661 (tilleggsfigur 6F), som antydet at LMP-assosiert celledød er ikke avhengig av kalsium eller katepsiner.
Figur 2. DC661-indusert apoptose og nekroptose. (EN)
Figur 3. DC661-indusert ferroptose og pyroptose. (EN)
LLP driver LMP. Etter å ha fastslått at hemmere av store celledødsveier (apoptose, nekroptose, ferroptose og pyroptose), katepsiner (PepA og E64) og ionekelatorer (BAPTA-AM [Ca2+] og DFO [Fe{{3} }]) forhindret ikke celledød ved DC661, og da vi fant bevis på lipidperoksidasjon ved C-11-BODIPY, utførte vi en global lipidomanalyse 2 og 4 timer etter DC661-behandling. DC661 induserte tidlig og vedvarende 3- til 10-dobling i hver klasse lysofosfolipid (figur 5A). I kontrast ble det sett minimale eller ingen endringer i fosfolipidklasser, inkludert fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol, fosfatidylglyserol og fosfatidinsyre (tilleggsfigur 7A). Lysofosfolipidarter kan genereres av ROS, som oksiderer den mettede fettsyrekjeden som deretter spaltes av fosfolipaser (20). For å avgjøre om antioksidanter kunne forhindre ROS-mediert lipidskade, undersøkte vi DC661-indusert cytotoksisitet i nærvær av pan-ROS-oppfangeren N-acetylcystein (NAC) (21, 22) og antatte lipidperoksidasjonshemmere Trolox (23) ) og vitamin C (askorbinsyre) (24, 25). I motsetning til noen av de andre midlene som er testet så langt, reddet samtidig behandling med NAC DC661-assosiert cytotoksisitet på tvers av flere cellelinjer (figur 5B og tilleggsfigur 7B). Langsiktige CFU-analyser viste at NAC, i motsetning til alle celledødshemmere, ionekelatorer og cathepsin-hemmere testet her, forhindret de cytotoksiske effektene av DC661 i A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 og MC38-celler ( figur 5C og tilleggsfigur 7C). Interessant nok reddet ikke Trolox og vitamin C DC661 cytotoksisitet i humant melanom, tykktarmskreft, kreftceller i bukspyttkjertelen og murine melanom og kolorektale kreftceller (figur 5D og tilleggsfigur 7, D–H). Denne forskjellen fikk oss til å teste om NAC, Trolox og vitamin C påvirket LMP. Resultatene våre viste at NAC var den eneste antioksidanten som signifikant reduserte DC661-indusert LMP (Figur 5E). Vi antok at LLP driver LMP-produksjon av DC661, som kan tilbakeføres av NAC, men ikke av Trolox og vitamin C. For å studere prosessen med LLP brukte vi den fluorescerende sonden FOAM-LPO (26), som spesifikt lokaliserer seg til lysosomet og produserer et spektralskifte fra 586 til 512 nm (rødt til grønt) når det utsettes for lipidperoksider. Vi fant at DC661 induserte LLP sammenlignet med kontroll (figur 5F). NAC reduserte lipidperoksidasjon i lysosomene til DC661-behandlede melanomceller, mens Trolox og vitamin C ikke klarte å redusere LLP (Figur 5F). NAC, Trolox og vitamin C alene hadde ingen signifikant effekt på lipidperoksidasjon. Knockdown av PPT1 (tilleggsfigur 8A), eller behandling med høye konsentrasjoner av HCQ (tilleggsfigur 8B) induserte også LMP som kunne reverseres av NAC, mens kjemisk hemming av ULK1 ikke induserte LMP (tilleggsfigur 8C). Viktigere nedbrytning av siPPT1 inkluderte også LLP som kunne reverseres med NAC (tilleggsfigur 8D) Disse resultatene viste at PPT1-hemming induserer LLP som kan reddes av NAC og sannsynligvis er årsaken til PPT1--hemming-indusert LMP. Videre antydet disse funnene at LLP er kritisk for lysosomal celledød.
Kinesisk urt cistanche plante-Antitumor
Import av cystein til lysosomer av MFSD12 demper lysosomal celledød. Av de 3 lipidperoksidasjonshemmerne var det bare NAC som forhindret LLP. En fersk rapport viste at hovedtilrettelegger-superfamiliedomenet som inneholder 12 (MFSD12) er en viktig komponent i cysteinimportøren for lysosomer og melanosomer (27). Vi begrunnet at NAC, eller dets metabolitt cystein, transporteres inn i lysosomet gjennom MFSD12, hvor cystein blir oksidert til disulfid, cystein. For å teste denne hypotesen sammenlignet vi evnen til NAC til å redde DC661-cytotoksisitet i siNT- og siMFSD12 A375P-hGal{10}}EGFP-celler. Resultatene våre viste at NAC reddet DC661-indusert LMP i siNT-celler, men ikke reddet LMP i siMFSD12-celler (Figur 6A). NAC reduserte LLP av DC661-behandlede siNT-A375P-celler, men ikke siMFSD12-celler. siMFSD12-celler behandlet med DMSO eller NAC hadde økt basal LLP (Figur 6B) sammenlignet med siNT-celler. Mens NAC reddet DC661-cytotoksisitet i siNT-celler, ble NACs evne til å redde DC661-cytotoksisitet fullstendig opphevet i siMSFD12-celler (figur 6C). Dette viste at MFSD12 knockdown blokkerer de cytobeskyttende effektene av NAC mot DC661. NAC deacetyleres av acylase i cytosolen (28). For å bestemme om NAC-behandling produserer en akkumulering av cystein eller cystin i lysosomer, brukte vi lysosomal immunutfellingsteknikk (Lyso-IP) (29) for å rense lysosomer fra DMSO og NAC-behandlede A375P-celler (figur 6D og tilleggsfigur 9A) og utførte målrettet metabolomikk for å kvantifisere NAC og relaterte metabolitter. Som forventet ble NAC påvist i NAC-behandlet helcellelysat og assosierte ubundne fraksjoner. L-cysteinnivåer ble betydelig økt innenfor NAC-behandlede lysosomer. L-cystin var bare påviselig innenfor NAC-behandlede lysosomer. Påfallende nok fant vi ikke en signifikant økning i glutation (redusert) i de NAC-behandlede gruppene (Figur 6E); dette var overraskende fordi det er en vanlig oppfatning at NAC-behandling induserer økt produksjon av glutation, og korrigerer redoksbalansen. Disse resultatene tyder på at cystein importert til lysosomer gjennom MFSD12-importøren er avgjørende for å redde LLP, LMP og lysosomal celledød. LLP er immunogen. Noen former for regulert celledød indusert av DC661 (pyroptose, nekroptose, ferroptose) har blitt identifisert som immunogene. Tidligere har immunogen celledød blitt beskrevet for kjemoterapimedisiner basert på karakteristiske trekk, som inkluderer visning av skadeassosierte molekylære mønstre, inkludert celleoverflateekspresjon av CALR og frigjøring av HMGB1-protein og adenosintrifosfat (ATP) (30). CALR fungerer som et "spis-meg"-signal når det utsettes for celleoverflater under cellestress. Ekstracellulær frigjøring av HMGB1 og ATP fungerer som et "finn-meg"-signal gjenkjent av fagocytiske celler. Vi sammenlignet to modeller: B16F10-celler, som i syngene tumormodeller er nesten fullstendig blottet for tumorinfiltrerende lymfocytter, og MC38-celler, som i syngene tumormodeller har tumorinfiltrerende lymfocytter. Først demonstrerte vi at DC661- eller siPpt1-behandling signifikant induserer overflate CALR-ekspresjon som kan oppheves fullstendig med NAC-sambehandling i MC38-celler (figur 7, A og B). Lignende funn ble observert i B16F10-celler (figur 7C). Inhibitorer av store celledødsveier (apoptose, nekroptose, ferroptose og pyroptose) klarte ikke å forhindre overflateuttrykk av CALR (figur 7D). For å bestemme om immunogen celledød indusert av DC661 skyldes MHC klasse I-oppregulering, ble B16F10- og MC38-celler behandlet med DC661 (3 μM) eller DMSO i 24 timer. Vi fant at DC661-behandling ikke økte uttrykket av MHC klasse I og immunproteasom oppregulering (figur 7E og tilleggsfigur 9, B og C).
Figur 4. Cathepsin-hemming eller kalsiumkelering forhindrer ikke DC661-indusert celledød. (EN)
For å forstå effekten av autofagi-hemming på T-celle-priming, utførte vi et in vitro-priming- og samkultureksperiment ved bruk av C57BL6/J-splenocytter som tidligere beskrevet (31). For priming eksponerte vi splenocytter for DC661-- eller DMSO-behandlede B16F10- eller MC38-celler. Deretter ble disse primete splenocyttene dyrket med levende B16F10- eller MC38-celler, og cytotoksisitet ble målt (figur 8A). Splenocytter primet med DC661-behandlede B16F10-celler ga en betydelig økning i IFN- sammenlignet med splenocytter eksponert for DMSO-behandlede B16F10-celler. Primet T-celle-mediert drap av prolifererende B16F10-celler ble betydelig økt i DC661-primede splenocytter sammenlignet med DMSO-primede splenocytter (Figur 8, B og C). MC38-celler behandlet med DC661 produserte enda mer IFN- og primet T-celle-cytotoksisitet sammenlignet med B16F10-celler (figur 8, D og E). NAC-sambehandling med DC661 var i stand til å fullstendig oppheve IFN-frigjøring fra splenocytter og butt-primet T-celle cytotoksisitet (figur 8, F og G). Knockdown av calreticulin av siCalr i MC38-celler (tilleggsfigur 9D) opphevet primingseffektiviteten til DC661-behandling og reduserte signifikant primet T-celles cytotoksisitet (figur 8, H og I). Til sammen støtter disse dataene en mekanistisk rolle av LLP-assosiert CALR-oppregulering for å fremme antitumorcelle-T-celleimmunitet. Deretter utvidet vi disse in vitro-funnene til en in vivo antitumorvaksinasjonsstudie i immunkompetente og immundefekte musemodeller. For denne analysen ble in vitro frysetint eller DC661-behandlede B16F10- eller MC38-celler injisert sc på venstre flanke for å beskytte immunkompetente C57BL/6- eller NOD/SCID-mus mot gjenutfordring med levende tumorceller av samme type injisert 7 dager senere inn i høyre flanke (Figur 9A). DC661-behandlede B16F10-celler klarte ikke å forhindre tumoravvisning til tross for in vitro-analyser, noe som tyder på at DC661 induserte immunogen celledød (figur 9B og tilleggsfigur 9E). I motsetning til dette fremmet inokulering av en flanke med DC661-behandlede MC38-celler fullstendig avvisning av levende MC38-celler implantert på den motsatte flanken (figur 9C og tilleggsfigur 9F). For å finne ut om adaptiv immunitet var kritisk for vaksineeffekten DC661 så ut til å ha med MC38-svulster, gjentok vi eksperimentet i NOD/SCID-mus. Påfallende nok fant vi at DC661-behandlede MC38-celler ikke induserte avvisning av gjenutsatt svulst hos immundefekte NOD/SCID-mus (figur 9D og tilleggsfigur 9G), noe som indikerer at adaptiv immunitet var nødvendig for den observerte vaksineeffekten. For å teste robustheten til dette funnet valgte vi en annen velkjent immunogen musekreftcellelinje, CT26, og utførte vaksinasjonseksperimentet som ovenfor. Som forventet ga implantasjonen av DC661-behandlede CT26-celler i en flanke av musen en vaksinelignende effekt og forhindret utveksten av levende CT26-celler implantert på den andre flanken (figur 9E og tilleggsfigur 9H). Funnene våre antydet at DC661-indusert LLP er kritisk for LMP-mediert immunogen celledød, som reverseres ved import av cystein til lysosom av lysosomal transportør MFSD12 (Figur 9F).
Diskusjon
Lysosomal inhibering ser ut til å være en lovende terapeutisk tilnærming i prekliniske studier, og kliniske studier med HCQ har gitt oppmuntrende, men blandede resultater (1, 32). PPT1 er det molekylære målet for HCQ, og mer potente PPT1-hemmere, som DC661 (2) og GNS561 (3), induserer LMP-mediert celledød in vitro. Den nøyaktige mekanismen for lysosomal celledød og dens rolle i tumorimmunogenisitet har ikke blitt fullstendig belyst. Antitumorimmunitet forsterkes når autofagihemming kombineres med immunterapi (9, 10, 31). Foreslåtte mekanismer for celle-iboende immunogenisitet etter autofagi-hemming inkluderer MHC klasse I og immunoproteasom oppregulering, som begge støtter forbedret antigenbehandling og presentasjon. I tillegg, tap av autofagiproteiner eller autofaghemming av klorokin forsterket CD8+ T-cellerespons ved å øke overflatenivåene av MHC klasse I i dendrittiske celler (33). Vi har tidligere vist at systemisk PPT1-hemming kan repolarisere makrofager fra en M2 til M1-fenotype. PPT1-hemmere kan øke STING-nivåer, noe som fører til IFN-frigjøring og forsterkning av T-celle-mediert drap i melanommodeller (31). Her demonstrerte vi at LLP i seg selv produserer en tumorcelle-iboende immunogen form for celledød. Vi fant at lysosomal inhibering induserte svært få proteinendringer i kreftceller, og de mest signifikant forhøyede proteinene inkluderte autofagiske lastreseptorer og apoptoseregulatorer. Vår tilnærming rettet mot noen av disse genene på tvers av funksjoner viste at medikamentinduserte proteiner sannsynligvis ikke var de viktigste regulatorene for celledød. Genetisk hemming av ULK1 eller ATG7 reddet heller ikke DC661 cytotoksisitet. Vi demonstrerte at lysosomal hemming aktiverer flere former for programmert celledød, inkludert apoptose, nekroptose, ferroptose og pyroptose, men hver av disse var unødvendig for medikamentindusert cytotoksisitet. Det er verdt å merke seg at programmerte celledødsmekanismer kan overlappe, og samtidig målretting av flere celledødsmekanismer kan gi cytobeskyttelse mot celledød etter lysosomal membranpermeabilisering. Vårt arbeid har utelukket katepsin- og kalsiumavhengige mekanismer for lysosomal celledød og fremhevet viktigheten av LLP som den kritiske determinanten for celledød. Vi fant bevis på LLP som var reversibel av en antioksidant som ble transportert inn i lysosomet, NAC og var kritisk for lysosomal membranpermeabilisering og cytotoksisitet. NAC var det eneste middelet som var i stand til å dempe eller reversere DC661-indusert celledød, og denne kapasiteten var avhengig av tilstedeværelsen av den lysosomale cysteintransportøren MFSD12. Mangel på lysosomal penetrasjon er sannsynligvis grunnen til at andre antatte lipidperoksidasjonshemmere, Trolox og vitamin C, ikke var i stand til å forhindre DC661 cytotoksisitet. NAC omdannes til cystein, som importeres til lysosomene og oksiderer til sin disulfidform, cystin. Cystin eksporteres til cytosolen av en annen lysosomal transportør, cystinose, hvor det reduseres til cystein som remobiliserer interne næringskilder, reaktiverer målet for rapamycinkompleks 1 og fremmer autofagi (34). Denne oksidasjonsreduksjonssyklusen av cystein til cystin (lysosomer) og tilbake til cystein (cytosol) kan være en mulig redningsmekanisme for NAC mot DC661 cytotoksisitet eller mer generell lysosomal skade på tvers av andre sykdomskontekster hvor NAC har vist seg å være nyttig terapeutisk (35) . NAC reverserte ikke bare DC661-indusert LLP og LMP, men også en overflateekspresjon av den immunogene celledødsmarkøren kalretikulin. Celleoverflateekspresjon av CALR-protein var nødvendig for den forbedrede T-celle-medierte cytotoksisiteten indusert av DC661--primede splenocytter, noe som viser at lysosomal inhibering produserer en spesifikk form for celle-iboende immunogenisitet.
Mens tidligere studier har vist at lysosomal hemming kan øke antitumoraktiviteten til immunkontrollpunkthemming i etablerte flanketumorer (9, 31), er vår studie den første vi vet som viser en vaksinelignende effekt for MC38-svulster, men ikke B16-svulster i tumorceller forbehandlet med DC661 før implantasjon. Dette viser at lysosomal celledød kan indusere celle-iboende immunogenisitet, men disse endringene i seg selv er ikke sannsynlig nok til å reversere et "immun kaldt" tumormikromiljø til et "immunt varmt" tumormikromiljø. Våre tidligere studier i "immun kalde" tumormikromiljømodeller B16 og BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 genetisk konstruerte musemodeller (31) viste at systemisk lysosomal hemming ga effekter på tumorassosierte makrofager og myeloidcelleavledede suppressorceller som var tilstrekkelige til å forsterke effekten av immunterapi. Det kan være tilfelle at celle-iboende immunogenisitet også spiller en rolle i disse immunforkjølelsessvulstene som blir mer responsive på ICD etter lysosomal inhibering. Den vaksinelignende effekten av lysosomal inhibering observert i et kontrollert laboratoriemiljø kan kanskje ikke oversettes til klinikken, men det kan forklare hvorfor noen pasienter behandlet med dabrafenib, trametinib og HCQ i tidligere behandlet BRAF mutant melanom hadde et så dypt og holdbart svar på dette regimet (32). Ytterligere studier er nødvendig for å forstå hvordan PPT1-hemming produserer lysosomal ROS og lipidperoksidasjon. PPT1-avhengig regulering av V-ATPase og lysosomal forsuring er ikke en tilstrekkelig forklaring fordi bafilomycin hemmer lysosomal forsuring, men produserer ikke LMP (data ikke vist). Implikasjonene av disse funnene antyder at lysosomale hemmere som forbedrer tumorcelle-iboende immunogenisitet kan kombineres rasjonelt med terapier som forbedrer T-celleaktivering, eller infiltrasjon i tumormikromiljøet, og potensielt gi synergistiske effekter.
Figur 5. N-acetylcystein forhindrer DC661-indusert celledød. (EN)
Metoder
Cellekultur. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) og muse B16F10 (CRL-6475) cellelinjer ble kjøpt fra ATCC. Human A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 og mus YUMM1.7 (WT, Gsdme EV og Gsdme KO1 og KO2) linjer ble oppnådd internt. Muse MC38 og CT26 celler ble levert av Andy Minn, University of Pennsylvania. FL5.12 og IL-3-avhengige Bax-/-Bak-/- (Bax/Bak DKO) primære benmargsceller ble hentet fra Kathryn E. Wellen, University of Pennsylvania. Den menneskelige Panc-1 (CRL-1469, ATCC) cellelinjen ble levert av Ben Z. Stanger, University of Pennsylvania. Muse YUMMER 1.7 cellelinjen ble oppnådd fra Xiaowei (George) Xu, University of Pennsylvania. Alle cellelinjer ble testet for Mycoplasma halvårlig av University of Pennsylvania Core-fasiliteter og autentisert ved bruk av kort-tandem gjentatt fingeravtrykk av Wistar Institute Genomics core. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 og Bax/Bak DKO cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 og MC38 cellelinjer ble dyrket i DMEM (Invitrogen, 11995); og YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV og Gsdme KO1 og KO2) celler (15) ble dyrket i DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Kulturmedier ble supplert med 10 % føtalt storfeserum (12306C, MilliporeSigma) og 1 x antibiotisk antimykotisk løsning (Gibco, 15140-122). FL5.12 og Bax/Bak DKO-cellelinjer ble opprettholdt i komplette RPMI-medier supplert med 50 μM -merkaptoetanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) og 0,35 ng/mL og 3,5 ng /mL IL-3, henholdsvis. YUMMER1.7 og YUMM1.7 (WT, Gsdme EV og Gsdme KO) cellelinjer ble opprettholdt i komplette medier supplert med 1× MEM NEAA (Gibco, 11140-050). WM35- og WM793-celler ble dyrket i MCDB-medium 153 (MilliporeSigma, M7403), inneholdende 10 % FBS i 1× Leibovitz L-15-medium (Corning, 10-045-CV), 7,5 % w/v natriumbikarbonat ( Corning, 25-035-CI), 1 x antibiotisk antimykotisk løsning (Gibco, 15140-122) og 5 ug/ml insulin (MilliporeSigma, I0516). Celler ble dyrket ved 37 grader i nærvær av 5 % CO2. Kjemikalier og reagenser. Kjemikalier kjøpt inkluderer HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) og DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) ble brukt til å farge cellene for kalsium i henhold til produsentens instruksjoner. En liste over antistoffer og inhibitorer er gitt i tilleggstabell 1 og tilleggstabell 2.
Figur 6. NAC reverserer LLP på en MFSD12-avhengig måte. (A–C)
Proteinekstraksjon og fordøyelse for væskekromatografi – tandem massespektrometrianalyse for proteomikk. {{0}}.7 × 106 A375P melanomceller ble dyrket i 60 mm kulturskåler. Celler ble behandlet med DMSO (kontroll), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) eller HCQ (3{{70}} μM) i 24 timer ved ca. 5{{ 112}} % sammenløp. Frosne cellepelleter ble lysert med 50 mM Tris pH 7,4, 1 % SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/ml pepstatin, og 1 ug/ml leupeptin. Klarte lysater (10 ug hver) ble elektroforert 0,5 cm til en bis-tris-gel etterfulgt av fiksering og farging med kolloidal Coomassie. Hver 0,5 cm gelbane ble skåret ut, avfarget, redusert med tris (2-karboksyetyl) fosfin, alkylert med jodacetamid og fordøyd med trypsin som beskrevet tidligere (36). Digests (1 ug) ble analysert ved væskekromatografi – tandem massespektrometri (LC-MS/MS) på et Q-Exactive Plus massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) i tråd med en nanoAQUITY UPLC (Waters). Analytisk separasjon ble utført på en 1,7 μm × 250 mm Peptide BEH C18-kolonne (Waters, 186003546) ved bruk av en 245-minutt gradient med 0,1 % maursyre i vann (mobil fase A) og acetonitril (mobil fase B) som følger : 5 %–30 % B i løpet av 225 minutter, 30 %–80 % B over 5 minutter, 15-minutt hold på 80 % B, og gå tilbake til startforholdene. Fulle MS-spektre ble oppnådd ved 70,000 oppløsning, med et skanneområde på 400–2,000 m/z, et mål for automatisk forsterkningskontroll på 3 × 106 ioner og en maksimal injeksjonstid på 50 millisekunder. Dataavhengige MS2-spektre ble innhentet for de 20 mest tallrike ionene ved 17 500 oppløsning, med en isolasjonsbredde på 1,5 m/z, automatisk forsterkningsmål på 5 × 104 ioner og maksimal injeksjonstid på 50 millisekunder. Peptidmatch ble satt til foretrukket, og ikke-tildelte og enkeltladede ioner ble avvist (37). Rå MS-data ble analysert ved bruk av MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) med en Uniprot human sekvensdatabase (åpnet 10. oktober 2019) og en felles forurensningsdatabase, inkludert trypsin, keratiner, bovine proteiner, og mykoplasma (38). Tryptisk peptidspesifisitet med maksimalt 2 savnede spaltninger, fiksert modifikasjon på cystein (karbamidometylering), og variabel metioninoksidasjon eller N-terminal acetylering ble brukt i søket (39). En grenseverdi på 1 % FDR ble brukt for peptider og proteiner. Match mellom løpene ble aktivert; proteiner ble kvantifisert ved bruk av merkefri kvantifisering (40). Statistisk analyse ble utført ved bruk av Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Proteiner måtte identifiseres av minst 3 unike peptider og ha 3 gyldige verdier (ikke-null kvantifisering) innenfor en prøvegruppe, og forurensninger og reversproteiner ble filtrert fra datasettet. Manglende verdier ble imputert fra en normalfordeling. Parvise sammenligninger mellom tilstander ble utført på proteinnivå ved å bruke en 2-tailed Student's t-test med permutasjonsbasert FDR med s0=0.1 og 250 randomiseringer. Signifikante endringer ble definert som FDR på mindre enn 5 % og en absolutt fold endring større enn 1,5 eller 2,0, som spesifisert. Lyso-IP. A375P-celler ble infisert med pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirus og selektert ved bruk av 1 mg/ml puromycin (MilliporeSigma, P4512). Omtrent 3 × 106 HA-merkede A375P-celler ble behandlet med enten 10 mM NAC eller vannbærerkontroll i 24 timer under kulturbetingelser beskrevet tidligere. Etter behandling ble cellene vasket i PBS, høstet i 0,5 mL kald KPBS og forsiktig homogenisert ved bruk av 20 slag i en 2 mL Dounce-homogenisator. Omtrent 2,5 % av homogenatet ble reservert for helcellelysatanalyse, og resten ble sentrifugert ved 3,000g i 2 minutter ved 4 grader for å fjerne cellemembranrester. Homogenat supernatant ble deretter overført til et rent 1,5 ml rør og inkubert med 50 μL anti-HA-kuler (Pierce, 88836) eller anti-DDK/Flag-perler (OriGene, TA150042) i 15 minutter ved 4 grader. Prøver ble deretter presipitert ved å plassere rør på DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) og vippet forsiktig i 2 minutter ved romtemperatur. Supernatanten ble reservert for ubundet fraksjonsanalyse. IP ble vasket 3 ganger med KPBS inneholdende 8 mM CaCl2. Lyso-IP ble ekstrahert i 80 % MeOH for metabolomikkanalyse. Lipidekstraksjon og analyse ved bruk av LC-MS/MS for globalt lipidom. Melanoma A375P-celler ble sådd i 60 mm skåler med 0,7 × 106 celler per skål. Når cellene hadde omtrent 50 % konfluens, ble de behandlet med DMSO (kontroll), DC661 (3 μM) eller HCQ (30 μM) i 24 timer. Celler ble vasket 2 ganger med HBSS, skrapet inn i iskald metanol og overført til glassrør for lipidekstraksjon med kloroform/metanol/0,88 % NaCl (2:1:1) inneholdende en EquiSPLASH intern lipidstandard (Avanti Polar Lipids). Prøver ble vortexet og deretter sonikert i vannbad i 5 minutter på is. Etter sentrifugering ved 500 g i 15 minutter ved 40 grader, ble den nedre fasen overført til et annet glassrør. Den øvre fasen ble ekstrahert på nytt ved bruk av en syntetisk nedre fase. Etter sonikering og sentrifugering ble den nedre fasen kombinert med den første samlingen i nedre fase. Prøvene ble tørket under nitrogen, resuspendert i 10 % kloroform/90 % metanol og overført til LTQ-glass. Lipidprøver ble analysert på et Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X massespektrometer og Vanquish Horizon UHPLC-system. Den analytiske separasjonen brukte en Accucore C30-kolonne (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) med 50:50 acetonitril/vann og 88:10:2 isopropanol/acetonitril/vann, hver inneholdende 5 mM ammoniumformiat og 0,1 % maursyre. LC-MS/MS-data ble innhentet separat i positive og negative polariteter med følgende instrumentparametere: MS1 scan 120,000 oppløsning; dataavhengig MS2 på de 20 mest rike ionene ved 15,000 oppløsning; 0,4 m/z isolasjonsbredde; og en trinnvis normalisert kollisjonsenergi på 20:30:40 (43).
Figur 7. N-acetylcystein forhindrer DC661-indusert overflateekspresjon av kalretikulin. (A–D)
Lipider ble identifisert og kvantifisert ved bruk av LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). De identifiserte lipidartene ble filtrert etter forventede addukter og identifiseringsgrad basert på klasse. Topparealer ble normalisert til EquiSPLASH-standardene for støttede klasser og videre normalisert basert på det totale arealet for hver prøve for å korrigere for variasjon i celleantall. Statistisk analyse ble utført på log-transformerte data ved bruk av Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Metabolittekstraksjon og analyse ved bruk av LC-MS/MS for metabalon. Polare metabolitter ble ekstrahert fra hele celler, Lyso-IP ubundne fraksjoner og Lyso-IP bundne prøver ved bruk av 80% metanol og ble lagret ved –8{{30}} grader før væskekromatografi -massespektrometri (LC-MS) analyse. Ekstrakter ble analysert med LC-MS ved bruk av et Thermo Scientific Q-Exactive HF-X massespektrometer med en HESI II-sonde på linje med et Thermo Vanquish Horizon UHPLC-system. LC-separasjon ble utført ved bruk av en ZIC-HILIC-kolonne (2,1 mm × 150 mm, 5 μm partikkelstørrelse, EMD Millipore) med en ZIC-HILIC-beskyttelseskolonne (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) holdt ved 45 grader med en strømningshastighet på 0,2 ml/min. Kromatografi ble utført under sure forhold for å redusere reaktiviteten til tiolgrupper. Mobil fase A var vann og B var acetonitril, begge inneholdende 0,1 % maursyre. LC-gradienten var 85 % B i 2 minutter, 85 % B til 20 % B i løpet av 15 minutter, 20 % B til 85 % B i løpet av 0,1 minutter og 85 % B i 8,9 minutter. Autosampler ble holdt ved 4 grader, og 4 μL av hver prøve ble injisert per analyse. Følgende MS-parametre ble brukt: strømningshastighet for kappegass, 40 AU; strømningshastighet for hjelpegass, 10 AU; strømningshastighet for sveipegass, 2 AU; ekstra gassvarmer temperatur, 350 grader; sprayspenning, 3,75 kV for positiv modus og 3,5 kV for negativ modus; kapillær temperatur, 375 grader; og trakt RF-nivå, 40 %. Alle prøvene ble analysert med full MS med polaritetsbytte. Full MS-skanning ble innhentet fra 65 til 975 m/z ved 120,000 oppløsning med et automatisk forsterkningsmål på 1 × 106 ioner og en maksimal injeksjonstid på 100 millisekunder. Rådata ble analysert med TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Målrettede metabolitter ble identifisert ved nøyaktig masse og retensjonstid i deres foretrukne polaritet basert på analytiske standarder. Toppdeteksjon brukte ICIS-algoritmen med en utjevning på 1. Relativ kvantifisering ble utført ved bruk av et integrert toppareal, og disse verdiene ble korrigert til den totale mengden per prøve (definert som det totale topparealet). PPT1-CRISPR/Cas9-redigering. A375P PPT1-ikke-mål- og KO-celler ble fremstilt som tidligere beskrevet (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) var en gave fra Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139). Guide RNA-oligoer (IDT) ble annealet, fosforylert og deretter ligert inn i BbsI-fordøyd og defosforylert pX459-plasmid etter Zhang-lab-protokoller, tilgjengelig gjennom Addgene. Ligerte plasmider ble transformert til Stbl3-celler (Invitrogen). Sekvensering av plasmidpreps bekreftet tilstedeværelsen av de ønskede guide-RNA-sekvensene. A375P-celler ble transfektert ved bruk av Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), etterfulgt av puromycin-seleksjon. Surveyor-analyser bekreftet redigering av PPT1-genet ved CRISPR/Cas9, og PPT1-knockdown ble bekreftet ved Western blotting med PPT1-antistoff (Origene). Sekvenser for guide-RNA-oligoer er som følger: ikke-mål-guide-RNA fremover (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), ikke-mål-guide-RNA-revers (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), menneskelig PPT1-guide RNA 1 fremover (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), menneskelig PPT1-guide RNA 1-guide 1. PPT1-guide 1. PPT1-guide 1. PPT1-guide fremover (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), og human PPT1 guide RNA 3 bakover (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Klonene dyrket fra enkeltceller brukt i denne artikkelen inkluderer følgende: klon C8 er human guide 1 og klon B5 er human guide 3. Immunoblotting. En million celler ble belagt i en 10 cm skål, og behandlinger ble gitt neste dag; cellene ble samlet ved skraping. Helcellelysater ble fremstilt ved bruk av SDS-lysebuffer. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved å bruke et Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30–50 ug protein ble brukt til SDS-PAGE og ble overført til en PVDF-membran (Bio-Rad, 1620177). Membranen ble blokkert ved bruk av 5 % BSA eller 5 % skummet melk, i henhold til optimaliserte forhold, og inkubert med primært antistoff over natten ved 4 grader. PVDF-membraner ble vasket med 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) og inkubert i 1 time ved romtemperatur med artsspesifikt HRP-konjugert sekundært antistoff. Membraner ble deretter vasket og utviklet ved bruk av Pierce ECL Western Blotting-substrat (Thermo Fisher Scientific, 32106) og autoradiografifilmer (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). For pyroptosestudier ble proteinlysater separert ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Etter blokkering i 5 % BSA ble PVDF-membraner inkubert med de angitte primære antistoffene over natten ved 4 grader, vasket i PBS/Tween og inkubert med peroksidase-koblede sekundære antistoffer. Immunreaktivitet ble påvist ved bruk av HRP-konjugerte sekundære antistoffer (CalBioTech), et kjemiluminescenssubstrat (Thermo Fisher Scientific) og et ChemicDoc MP-bildesystem (Bio-Rad). For eksperimenter som involverte supernatant, ble celler dyrket i et FBS-fritt medium for å unngå forvrengning av SDS-PAGE. Cellesupernatanter ble høstet og sentrifugert i 10 minutter ved 500 g ved 4 grader for å fjerne celleavfall. De resulterende supernatantene ble konsentrert 10x ved bruk av Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) ved sentrifugering i 30 minutter ved 4500 g ved 4 grader. Konsentrater ble blandet med prøvebuffer og analysert via Western blotting som beskrevet ovenfor. Proteingelfarging ble utført ved å bruke Ponceau-rødfarging. LMP og cathepsin L aktivitetsanalyse. Humant pEGFP-hGal3-plasmid var en gave fra Tamotsu Yoshimori (Addgene-plasmid, 73080) og ble brukt til å lage A375P-Galectin{139}}-linjen. pEGFP-C1 kontrollplasmidvektor-ryggrad ble kjøpt (novo prolabs, V012024). Plasmider ble transfektert (1 ug/ml) inn i A375P-celler ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) i henhold til produsentens protokoll; transfekterte celler ble stabilt selektert ved bruk av G418 (Gibco, 10131035). For LMP ble totalt 25 A375P-galectin-3 puncta-positive celler i flere bildefelt talt. Prosentandelen av puncta-positive celler ble beregnet i hvert felt separat, og en gjennomsnittlig prosentandel ble beregnet for hver gruppe. Magic Red Cathepsin L-analysesettet (Abcam, ab270774) ble brukt i henhold til produsentens protokoll. Celler ble avbildet under et Zeiss Axio Observer 7 invertert mikroskop. Magic Red rå integrert intensitet ble beregnet ved hjelp av Fiji - ImageJ programvare (NIH). MTT (3-[4, 5-dimetyltiazol-2-yl]-2, 5 difenyltetrazoliumbromid) cellelevedyktighetsanalyse. 2000 celler ble sådd ut i tre eksemplarer i hver brønn i en 96-brønnplate, og 3-dagers MTT-analyser ble utført ved bruk av Cell viability Kit (Roche, 11465007001) i henhold til produsentens protokoll. Inhibitorforbehandling ble gitt i 1 time, etterfulgt av samtidig behandling av cellene med inhibitorer med eller uten DC661. Den ikke-lineære regresjonsmetoden (kurvetilpasning) ble brukt for å beregne IC50.
cistanche tubulosa-forbedre immunsystemet
Klikk her for å se Cistanche Enhance Immunity-produkter
【Be om mer】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Kolonidannelsesanalyse. 2,000 celler per brønn ble sådd i en 6-brønnplate og ble behandlet neste dag; cellene ble holdt under behandlingen i totalt 8 dager. Kolonier dannet i hver brønn ble vasket med PBS, fiksert med kald metanol ved –20 grader i 20 minutter og farget med Krystallfiolett 0,5 % vandig løsning (V5265; MilliporeSigma).
Trypanblått fargeekskluderingsanalyse. Reaksjonsblandingen for Trypan blå-analysen ble fremstilt ved å blande 1 del 0,4 % trypanblått (25- 900-CI, Corning) og 1 del fortynnede celleprøver. Blandingen ble inkubert i 1 minutt, og cellene ble telt på Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).
Figur 8. DC661-indusert calreticulin overflateekspresjon primer T-celler mot tumorceller. (EN)
Figur 9. Inokulering av DC661-behandlede celler gir tumoravvisning i spesifikke sammenhenger. (EN)
SKUM-LPO. LLP ble studert ved bruk av en fluorescerende probe, FOAMLPO. FOAM-LPO ble syntetisert som tidligere beskrevet (26). Celler ble dyrket på et 8-brønns μslide (ibid, 80807) og behandlet med inhibitorer og med eller uten DC661. Celler ble inkubert med media inneholdende FOAM-LPO (1 M) i en atmosfære av 5 % CO2 og 95 % luft i 5 minutter ved 37 grader. Cellene ble vasket to ganger med media, og deretter ble cellene observert under mikroskopet (Zeiss Axio Observer 7 invertert mikroskop) for å oppdage fluorescensskifting fra 586 til 512 nm som respons på LLP. qRT-PCR og primere. A375P (3 × 105 ) celler ble dyrket i 60 mm skåler og ble behandlet med DMSO eller DC661 (3 μM) i 24 timer. Totalt RNA ble isolert med et RNA-isolasjonssett (QIAGEN, 74134) i henhold til produsentens protokoll. cDNA ble syntetisert ved å bruke et iScript Reverse Transcriptase-sett med 500 ng renset RNA i henhold til produsentens protokoll (Thermo Scientific, K1642). qPCR-reaksjonen ble satt opp med SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) som inneholdt 1 μL cDNA. Alle målinger ble utført i tre eksemplarer, og BACTIN ble brukt som intern standard for ΔCT-beregninger. Genekspresjonsanalyse ble utført ved bruk av følgende primere: PTGS2/COX-2 fremover (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 revers (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS fremover (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS revers (GACCAGGATGATCGTCAACAG) (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 revers (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN fremover (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) og BACTIN revers (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
siRNA-transfeksjon. Genetiske knockdown-studier for human ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 og MFSD12 ble utført i A375P-cellelinjer. Genetiske hemmingsstudier for mus Ppt1 og Calreticulin ble utført i MC38-celler. Ikke-mål siRNA (sc{{10}}), human ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), mus Ppt1/Cln1 (sc-142398) og Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNA-er ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Disse siRNA-ene består av samlinger av 3–5 målspesifikke siRNA-er. Flowcytometri. Ferroptose-induksjon ble målt ved å bruke C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). A375P-celler ble sådd i en 6-brønnplate og behandlet med DMSO, ferrostatin{{40}} (10 μM), lepperoksstatin-1 (2 μM), elastin (5 μM) ), DC661 (3 μM), eller en kombinasjon i 24 timer. Celler ble høstet ved sentrifugering ved 300 g i 5 minutter. Celler ble resuspendert i 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) inneholdende 1 μM C11-BODIPY og inkubert ved 37 grader i 15 minutter. Celler ble pelletert og resuspendert i 500 μL 1X HBSS, og fluorescensintensiteten ble målt på et BD LSRII-cytometer ved bruk av 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Kvantifisering av celleoverflateekspresjon av calreticulin for immunogen celledød ble utført som tidligere beskrevet (45) ved flowcytometri. B16F10- eller MC38-celler ble dyrket og behandlet med NAC (10 mM) eller DC661 (3 μM) i 24 timer. MC38-celler ble behandlet med siPpt1 eller siNT i 48 timer i nærvær eller fravær av 10 mM NAC i 24 timer. Celler ble farget med CALR-antistoff (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 geit-anti-kanin andre antistoff (Invitrogen) og propidiumjodid (PI) (Biolegend, 421301). Fargede prøver ble tatt på et BD LSRII flowcytometer ved bruk av 710/50 Blue og 670/30 Red for å fange henholdsvis PI- og CALR-fluorescens (University of Pennsylvania Flow Core-anlegg), og analysen ble begrenset til CALR-positive og PI-negative celler for å unngå falske positive hendelser. T-celle-priming og prosentvis cytotoksisitet. B16 eller MC38 tumorceller (5 × 104) ble dyrket og behandlet med NAC (10 mM) eller DC661 (1 μM eller 3 μM), henholdsvis i 24 timer. For Calr genetisk hemming ble MC38-celler behandlet med Calr siRNA eller nontarget siRNA (siNT) i 48 timer, etterfulgt av behandling med enten DMSO eller 3 μM DC661 i 24 timer. Splenocytter ble deretter dyrket med DC661 med eller uten B16- eller MC38-celler i nærvær av IL-2 (5 IE/ml) og samdyrket i 72 timer. Priming ble bekreftet ved IFN-ELISA (Biolegend, 430815) av supernatanten. Primede splenocytter ble deretter dyrket sammen med nydyrkede B16- eller MC38-celler med mål-til-effektor-forhold (B16 eller MC38 til splenocytter) på 1:20 og 1:50 for henholdsvis B16- og MC38-celler. Den B16- eller MC38-celledødsassosierte LDH-frigjøringen og deretter prosentvis cytotoksisitet ble målt i henhold til produsentens protokoll (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Antitumorvaksinasjonsanalyser og kjemoterapistudier med etablerte kreftmodeller. Seks til åtte uker gamle WT C57BL/6 hunnmus, NOD/SCID og BALB/c mus ble hentet fra The Jackson Laboratory. For antitumorvaksinasjonseksperimenter ble WT B16F10-, MC38- og CT26-celler behandlet med DC661 (3 μM) i 36 timer i 175 cm2 kolber. Deretter ble supernatanter og løsrevne celler samlet i et 50 ml falkrør. Cellene ble sentrifugert og vasket med iskald PBS. For vaksinasjon ble 150 μL cellulær suspensjon injisert sc i venstre flanke av immunkompetente C57BL/6-mus, immundefekte NOD/SCID-mus (1,8 × 104 B16F10-celler, 1,5 × 106 MC38-celler per mus), eller syngenisk BALB. × 106 CT26-celler per mus). Fryse-tint celler resuspendert i PBS ble injisert som en negativ kontroll. En uke senere ble levende kreftceller av samme type (3 × 104 B16F10-celler, 2 × 105 MC38-celler eller 5 × 105 CT26-celler per mus) injisert med et like stort volum av Matrigel (Corning, 354248) i høyre flanke av vaksinerte mus. Tumorer ble målt ved hjelp av elektroniske skyvelære, og volumet ble beregnet som L × W2 × 0,5. Tumorvekst ble regelmessig overvåket de påfølgende dagene, og fravær av tumorer ble ansett som en indikasjon på effektiv antitumorvaksinasjon. DC661-MC38-vaksinasjonsstudier ble gjentatt i NOD/SCID-mus. Statistikk. Statistisk signifikans ble bestemt ved å bruke studentens uparrede, 2-halede t-test ved sammenligning av 2 grupper. 1-måten ANOVA-testen ble brukt når mer enn 2 grupper ble sammenlignet. En nullhypotese ble signifikant forkastet hvis P-verdien var mindre enn 0,05. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. Studiegodkjenning. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med protokollene godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Pennsylvania.
Kinesisk urt cistanche plante-Antitumor
Referanser
1. Zeh HJ, et al. En randomisert fase II preoperativ studie av autofagi-hemming med høydose hydroksyklorokin og gemcitabin/Nab-paclitaxel hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.
2. Rebecca VW, et al. PPT1 fremmer tumorvekst og er det molekylære målet for klorokinderivater i kreft. Kreft Oppdag. 2019;9(2):220–229.
3. Brun S, et al. GNS561, en ny autofagi-hemmer aktiv mot kreftstamceller i hepatocellulært karsinom og levermetastaser fra kolorektal kreft. J Kreft. 2021;12(18):5432–5438.
4. Brun S, et al. GNS561, en PPT1-hemmer i klinisk stadium, er effektiv mot hepatocellulært karsinom via modulering av lysosomale funksjoner. Autofagi. 2022;18(3):678–694.
5. Oberle C, et al. Lysosomal membranpermeabilisering og cathepsinfrigjøring er en Bax/Bak-avhengig, forsterkende hendelse av apoptose i fibroblaster og monocytter. Celledød er forskjellig. 2010;17(7):1167–1178.
6. Boya P, Kroemer G. Lysosomal membranpermeabilisering ved celledød. Onkogen. 2008;27(50):6434–6451.
7. Rebecca VW, et al. En enhetlig tilnærming til målretting av lysosomets nedbrytende og vekstsignalerende roller. Kreft Oppdag. 2017;7(11):1266–1283.
8. Tang R, et al. Ferroptose, nekroptose og pyroptose i antikreftimmunitet. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.
9. Yamamoto K, et al. Autofagi fremmer immununnvikelse av kreft i bukspyttkjertelen ved å degradere MHCI. Natur. 2020;581(7806):100–105.
10. Deng J, et al. ULK1-hemming overvinner kompromittert antigenpresentasjon og gjenoppretter antitumorimmunitet i LKB1 mutant lungekreft. Nat Cancer. 2021;2(5):503–514.
11. Lazarou M, et al. Ubiquitin kinase PINK1 rekrutterer autofagi-reseptorer for å indusere mitofagi. Natur. 2015;524(7565):309–314.
12. Choi YB, et al. TAX1BP1 begrenser virusindusert apoptose ved å lette kløemediert nedbrytning av mitokondriell adapter MAVS. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.
13. Rikka S, et al. Bnip3 svekker mitokondriell bioenergi og stimulerer mitokondriell omsetning. Celledød er forskjellig. 2011;18(4):721–731.
14. Leu JI, et al. Mekanistisk grunnlag for svekket ferroptose i celler som uttrykker den afrikansk-sentriske S47-varianten av p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.
15. Erkes DA, et al. Mutante BRAF- og MEK-hemmere regulerer tumorimmune mikromiljøet via pyroptose. Kreft Oppdag. 2020;10(2):254–269.
16. Serrano-Puebla A, Boya P. Lysosomal membranpermeabilisering ved celledød: nye bevis og implikasjoner for helse og sykdom. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.
17. Thirusangu P, et al. Kinakrin-indusert autofagi i eggstokkreft utløser katepsin-L-mediert lysosomal/mitokondriell membranpermeabilisering og celledød. Kreft (Basel). 2021;13(9):2004.
18. Michellet MC, et al. Cathepsin-avhengig apoptose utløst av supraoptimal aktivering av T-lymfocytter: en mulig mekanisme for høydosetoleranse. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.
19. Mondal A, et al. Ppt1-mangel dysregulerer lysosomal Ca++-homeostase og bidrar til patogenesen i en musemodell av CLN1-sykdom. J Arve Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. Fosfolipaser og reaktive oksygenarter avledet lipidbiomarkører hos friske og syke mennesker og dyr - et fokus på lysofosfatidylkolin. Front Physiol. 2021;12:732319.
21. Fu R, et al. Effekten av N-acetylcystein i fenotypisk undertrykkelse av musemodeller av Niemann-Pick sykdom, type C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.
22. Boz Z, et al. N-acetylcystein forhindrer olanzapin-indusert oksidativt stress i mHypoA-59 hypotalamiske nevroner. Sci Rep. 2020;10(1):19185.
23. Khare S, et al. ASS1 og ASL undertrykker vekst i klarcellet nyrecellekarsinom via endret nitrogenmetabolisme. Kreft Metab. 2021;9(1):40.
24. Gęgotek A, et al. Sammenligning av den beskyttende effekten av askorbinsyre på redoks- og endocannabinoidsysteminteraksjoner in vitro-dyrkede humane hudfibroblaster utsatt for UV-stråling og hydrogenperoksid. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.
25. De Raedt T, et al. Utnyttelse av kreftcellesårbarheter for å utvikle en kombinasjonsterapi for ras-drevne svulster. Kreftcelle. 2011;20(3):400–413.
26. Zhang X, et al. Overvåking av lipidperoksidasjon i skumceller med lysosommålbar og ratiometrisk sonde. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.
27. Wei CY, et al. Bioinformatikkbasert analyse avslører forhøyet MFSD12 som en nøkkelpromoter for celleproliferasjon og et potensielt terapeutisk mål ved melanom. Onkogen. 2019;38(11):1876–1891.
28. Aldini G, et al. N-acetylcystein som en antioksidant og disulfidbrytende middel: grunnene. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Lysosomal metabolomikk avslører V-ATPase- og mTOR-avhengig regulering av aminosyreutstrømning fra lysosomer. Vitenskap. 2017;358(6364):807–813.
30. Zhou J, et al. Immunogen celledød i kreftterapi: Tilstedeværende og nye induktorer. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. PPT1-hemming øker antitumoraktiviteten til anti-PD-1-antistoff ved melanom. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.
32. Mehnert JM, et al. BAMM (BRAF autophagy and MEK inhibition in melanoma): en fase I/II-studie av dabrafenib, trametinib og hydroksyklorokin ved avansert BRAFV600-mutant melanom. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Makroautofagiproteiner kontrollerer MHC klasse I-nivåer på dendrittiske celler og former antivirale CD8(+) T-celleresponser. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.
34. Jouandin P, et al. Lysosomal cysteinmobilisering former responsen til TORC1 og vevsvekst på faste. Vitenskap. 2022;375(6582):eabc4203.
35. Schwalfenberg GK. N-acetylcystein: en gjennomgang av klinisk nytte (et gammelt medikament med nye triks). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.
36. Beer LA, et al. Systematisk oppdagelse av biomarkører for ektopisk graviditetsserum ved bruk av 3-D-proteinprofilering kombinert med etikettfri kvantifisering. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. Den primære effekten på proteomet til ARID1A-mutert klarcellet ovariekarsinom er nedreguleringen av mevalonatveien på post-transkripsjonelt nivå. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.
38. Cox J, Mann M. MaxQuant muliggjør høye peptididentifikasjonshastigheter, individualisert ppb-område massenøyaktighet og proteomomfattende proteinkvantifisering. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.
39. Cox J, et al. Andromeda: en peptidsøkemotor integrert i MaxQuant-miljøet. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.
40. Cox J, et al. Nøyaktig proteomomfattende merkefri kvantifisering ved forsinket normalisering og ekstraksjon av maksimalt peptidforhold, kalt MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.
41. Tyanova S, et al. Perseus beregningsplattform for omfattende analyse av (prote)omikkdata. Nat-metoder. 2016;13(9):731–740.
42. Tyanova S, Cox J. Perseus: en bioinformatikkplattform for integrerende analyse av proteomikkdata i kreftforskning. Metoder Mol Biol. 2018;1711:133–148.
43. Alicea GM, et al. Endringer i aldrende fibroblastlipidmetabolisme induserer aldersavhengig melanomcelleresistens mot målrettet terapi via fettsyretransportøren FATP2. Kreft Oppdag. 2020;10(9):1282–1295.
44. Ran FA, et al. Genomteknikk ved hjelp av CRISPR-Cas9-systemet. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.
45. Liu P, et al. Kvantifisering av kalretikulineksponering assosiert med immunogen celledød. Metoder Enzymol. 2020;632:1–13.
