Makrofagutarming reduserer sykdomspatologi i faktor H-avhengig immunkompleksmediert glomerulonefritt

KomplementfaktorH (FH) er en nøkkelregulator for den alternative komplementveien, hos mennesker og mus. Tidligere avslørte våre studier at fravær av FH fører til at C57BL6-musen blir mottakelig forkronisk serumsykdom(CSS) sammen med en økning inyre innfiltrasjon av makrofagersammenlignet med kontroller. For å forstå om den økte rekrutteringen av makrofager (Mϕs) til nyren kjørte innflammasjons- og forplantningsskade, undersøkte vi f.eksffect av Mϕ uttømming med klodronat i FH knockout-mus med CSS. Åtte uker gamle FHKO-mus ble behandlet med apoferritin (4 mg/mus) i 5 uker og med enten vehikel (PBS) eller klodronat (50 mg/kg ip, 3 ganger/uke de siste 3 ukene). Administrasjonen avklodronat reduserte monocytter og Mϕs i nyreneav>80%. 

Nyrefunksjonvurdert av BUN og albumin forble nærmere normalt ved uttømming av Mϕs. Klodronatbehandling forhindret endringen i cytokiner, TNF og IL-6, og økning i genekspresjon av bindevevsvekstfaktor (CTGF), TGF -1, matrisemetalloproteinase-9 (MMP9),fibronektin, laminin og kollagen i FHKO-mus med CSS (P < 0:05). Klodronatbehandling førte til relativ beskyttelse motimmunkompleks- (IC-) mediert sykdomspatologi under CSS som vurdert avsignifisterkt redusert glomerulær patologi(GN) og ekstracellulær matrise. Resultatene våre tyder på at komplementaktivering er en av mekanismene som regulerer makrofaglandskapet og dermedfibrose. Den nøyaktige mekanismen gjenstår å dechiffrere. Kort fortalt viser våre data at Mϕs spiller en kritisk rolle i FH-avhengige ICGN og Mϕ uttømmingreduserer sykdomsprogresjonen.

KLIKK HER FOR Å FÅ NATURLIG ORGANISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 25 % ECHINACOSIDE OG 9 % ACTEOSIDE FOR NYREFUNKSJON

1. Introduksjon

Kronisk nyre sykdom(CKD) er et globalt helseproblem; 10 % av disse er immunkompleks (IC-) mediert og forekommer ved serumsyke, infeksjoner og autoimmune sykdommer. [1]. Det står det i USAs Renal Data Systems årsrapportpersoner med CKD«har tydeligvis høy risiko for å dø» med en 10-dobbelt økt forekomst over tre tiår der berørte pasienter mistet 70 % av levetiden. I følge NIDDK har omtrent 14 % av den voksne befolkningen blitt diagnostisert med nyresykdom, noe som gjør det til den niende ledende dødsårsaken [2]. Nyren er svært utsatt for komplement-mediert skade, spesielt i autoimmune og inflammatoriske omgivelser [3, 4].

Komplementsystemet deltar i medfødte og adaptive immunresponser og gir en første forsvarslinje mot mikroorganismer [5, 6]. Den består av tre aktiveringsveier, som initieres på unike måter, og består av mer enn 30 plasma- og celleassosierte proteiner [7]. Den alternative veien er konstant på vakt og reguleres av proteiner som komplementfaktor H (FH). FH er et sirkulerende protein som hovedsakelig syntetiseres av leveren [8]. FH-mangelfulle (fh-/-) mus behandlet med apoferritin utvikler kronisk serumsyke (CSS) som fører til diffus proliferativ glomerulonefritt (GN) innen 5 uker etter behandling, mens kullkamerat C57BL/6 mus som er tilstrekkelig faktor H (FH) har lite glomerulær betennelse [9]. F4/80+ makrofaginfiltrasjon skjer i nyrene og observeres rundt IC-avleiringer i fh-/- musene. Komplementaktivering genererer anafylatoksiner, C3a og C5a, som deltar i handel med Mϕs til betennelsesstedet. Hemming av C5a/C5aR1-signalering reduserte Mϕs i nyrene [10]. I denne innstillingen,nyreskadeer assosiert med nyreinfiltrasjon, men mekanismene som kan være involvert i å forårsakenyreskadeforbli ukjent.

Figur 1: FH endrer makrofagmarkørgener i nyrene til mus med FH-avhengig ICGN. Kvantitativ PCR i sanntid for CD204 og CD206 ved bruk av mRNA isolert fra nyrene etter 5 uker med saltvann eller apoferritin. Uttrykket er normalisert til GAPDH (n=6/gruppe). ∗P < 0:01. Grafer viser foldendringen av gener i apoferritin-behandlede fh-/- mus (n=6) sammenlignet med fh-/- mus behandlet med saltvann (n=6).

Monocytter (Mo) generert av hematopoietiske celler [11] migrerer gjennom endotelet inn i vevene, hvor de differensierer til Mϕs. Markører som F4/80-, CD11b-, CD68- og Fc-reseptorer kan identifisere Mϕ-ene. Mϕs er kritisk involvert i nyreskade, reparasjon og fibrose i forskjellige eksperimentelle modeller for nyresykdom [12, 13]. Nylig viste våre studier at nyreskade i FH-avhengig ICGN er assosiert med nyreinfiltrasjon av Mϕs. Dessuten har tidligere studier vist at hemming av renal Mϕ-infiltrasjon reduserer arterielt trykk og forhindrer glomerulær skade og fibrose i forskjellige dyremodeller av nefropati [14, 15]. Så vidt vi vet, har virkningen av Mϕ-uttømming under nyreskade assosiert med FH-avhengig ICGN imidlertid ikke blitt adressert. Derfor undersøkte denne studien rollen til Mϕs på nyreskaden assosiert med FH-avhengig ICGN ved bruk av liposomklodronat. Klodronat (klodronsyre) er et bisfosfonat som metaboliseres til en ikke-hydrolyserbar ATP-analog [16]. Eksperimentene våre viser at Mϕs spiller en nøkkelrolle i tap av nyrefunksjon i en setting med uregulert komplementaktivering. Derfor kan reduksjon av Mϕs eller instruere Mϕs om å anta en reparasjonsfenotype redusere sykdomspatologi og kan utnyttes terapeutisk.

2. Materialer og metoder

2.1. Forsøksdyr.

fh−/− musestammen ble generert og vennlig levert av Drs. Matthew Pickering og Marina Botto (Imperial College of London) og gikk kontinuerlig tilbake til C57BL/6-stammen i laboratoriet vårt i over 10 generasjoner. Kullmate FH-tilstrekkelige mus fungerte som kontrollene (n=8/gruppe) Genotyping ble utført ved bruk av PCR-baserte tilnærminger. Mus ble holdt ved en temperatur på 20–22 grader C i 12 timer lys–12 timer mørk belysningssyklus, i sterile, ventilerte bur med mat og vann ad lib. University of Chicago og University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee godkjente alle studier.

2.2. Protokoll for kronisk serumsyke.

CSS ble indusert i 6–8 ukers fH−/− eller villtype mus med daglig intraperitoneal administrering av 4 mg hestemilt apoferritin (Calzyme Laboratories) uten adjuvans [10, 17, 18] i 5 uker. Kullkamerater mottok intraperitoneale injeksjoner av saltvannsbærer samtidig

2.3. Nyrefunksjonsvurderinger.

Blod urea nitrogen (BUN) konsentrasjoner ble bestemt med en Beckman Autoanalyzer (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Urinalbuminkonsentrasjoner ble målt med et musealbumin ELISA-sett (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) og normalisert til urinkreatinin målt kolorimetrisk (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) som beskrevet tidligere [19].

Figur 2: Klodronat reduserer i økende grad nyremakrofager hos mus med FH-avhengig ICGN. Gitt er flowcytometriprofilene til F4/80+ monocytter/Mϕs på dag 0, 2, 4 og 7, representativt. Ekspresjonen av F4/80+-celler ble bestemt ved flowcytometri. Data ble analysert ved bruk av FlowJo V10-programvare. F4/80+-celler reduseres betydelig ved hvert tidspunkt og når mindre enn 10 % på dag 7. Hvert tidspunkt n=6.

2.4. Histologi.

Nyrer ble innebygd i parafin og for malinfikserte, og fire-mikrometer seksjoner ble generert. Snittene ble farget med Periodic Acid-Schiff og undersøkt av en nyrepatolog (AC) på en blind måte. For hvert lysbilde ble proliferativ glomerulonefritt og glomerulo-sklerose gradert fra 0 til 4 som beskrevet tidligere [20]. For immunfluorescensmikroskopi ble nyrevevet hurtigfrosset i 2-metylbutan forhåndskjølt i tørris. Fire-mikron kryostatseksjoner ble behandlet for immunfluorescens (IF) farging. Snitt ble fikset i 4 % paraformaldehyd og farget med Alexa488-konjugert anti-mus C3 (Cappel) og Alexa 555 anti-mus IgG. En semi-kvantitativ poengsum for fargingsintensitet og distribusjon fra 0 til 4 ble gitt på en blind måte som beskrevet tidligere [19].

2.5. QRT-PCR.

Nyrene ble høstet, og totalt RNA ble ekstrahert fra vevet ved å bruke TRIzol-reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen, USA). cDNA ble syntetisert ved bruk av SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen). qRT-PCR ble utført ved bruk av Power SYBR Green PCR Master mix på ABI 7700 sekvensdetektor (Applied Biosystems). PCR-amplifisering ble utført i et totalt volum på 25 ul inneholdende 12,5 ul 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 6,25 ul nukleasefritt vann, 5 ul cDNA og 1,25 ul av de riktige primerne (IDT). Alle qPCR-primere (tabell 1) ble designet med Primer3-programvaren (Whitehead Institute for Biomedical Research) for å sikre spesifisitet og sensitivitet. For å kvantifisere nivåene av mRNA, normaliserte vi ekspresjonen av målgenene til glyceraldehyd-3- fosfatdehydrogenase. Relative mRNA-ekspresjonsnivåer ble beregnet ved å bruke 2 - ΔΔCt-metoden og ble normalisert til ekspresjonsnivåene til GAPDH.

2.6. Statistikk.

Alle resultater er gjennomsnitt ± SD fra minst {{0}} mus i hver gruppe. Enten en uparret tosidet test (data med normalfordeling) eller Mann–Whitney U-testen (data uten normalfordeling) ble brukt til å sammenligne 2 grupper med GraphPad Prism 5.0. Den statistiske signifikansen uttrykkes som følger: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; og ns: ikke signifikant.

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportøren i Kina:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Handle for flere spesifikasjoner:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop