Melanin-avfargingsaktivitet av antioksidantenzymer, glutationperoksidase, tiolperoksidase og katalase

Ta kontakt med:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· Uk Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Abstrakt

Melanin er den viktigste faktoren for å bestemme hudfarge. Mange forskningsinnsats blir utført for å dekomponere de allerede produserte melaninforbindelsene i huden for skjønnhet. Denne forskningen undersøkte effektene på å redusere melaninfargen til de tre antioksidantenzymene, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX) og Catalase, i lysosomal fraksjon. Melaninløsning ble behandlet med enzymene og hydrogenperoksid, og deretter reagert i 48 timer. GPX og TPX avfarget melanin, og mellom dem var GPX mer effektiv, men Catalase var ikke effektiv. GPX hemmet også produksjonen av melanin i B16F10 melanomceller. GPX, som finnes i nesten alle mikroorganismer, spiller en viktig rolle i den cellulære forsvarsmekanismen av reaktive oksygenarter. I tillegg var det ikke cellegift, men var signifikant effektivt for å avfarge melaninfarge. Derfor, i det biologiske og mikrobiologiske feltet, er muligheten for bruk i hudblekingskosmetikk høy.

Nøkkelord Melanin · Glutationperoksidase (GPX) · Tiolperoksidase (TPX) · Katalase · B16F10 · Lysosom

Cistanche er en hudblekende ingrediens.

Introduksjon

Et rent ansikt er et av de essensielle skjønnhetselementene for moderne mennesker, spesielt asiater er entusiastiske for hvit hud. Melaninforbindelsen er den viktigste faktoren for å bestemme hudfarge. Det skiller seg fra eumelanin som har svart eller brun farge, og pheomelanin, som resulterer i en rosa til rød nyanse [1]. Melaninforbindelsen syntetiseres ved tyrosinoksidasjon i melanocyttceller, som finnes i det basale laget av epidermis; og hovedrollen til dette pigmentet i huden er å beskytte dermis ved å blokkere skadelig ultrafiolett stråling [2, 3]. Men hvis for mange melaninforbindelser er tilstede i huden, gjør det huden mørk og uren, og kan forårsake hyperpigmentering, som melasma [4].

Det har vært mange studier relatert til hudpleiekosmetikk som løser disse problemene, men de fleste av de nå utviklede hudblekende kosmetikkene har en funksjon for å hemme melaninsyntesen gjennom flere mekanismer, som å blokkere oksidasjonen av tyrosin, eller UV-stråler som kan fremme melaninsyntese [5]. Disse produktene bruker lang tid på å være effektive, og er ikke effektive for spesifikke symptomer, slik som hyperpigmentering [6]. For tiden er en typisk metode for å fjerne melanin som allerede er laget laserbehandling [7]. Hvis det utvikles materialer som kan løse disse problemene uten slike prosedyrer, vil de ha stor nytte i det biologiske og kosmetiske området.

I tidligere forskning prøvde vi å finne en måte å avfarge melaninforbindelsene som allerede er produsert. Det har vært forskningsrapporter om lysosom- og melaninkorrelasjon. Det er svært sannsynlig at differensierte keratinocytter spesielt degraderer de ytre melanosomene i henhold til den typen grunnleggende autofagifunksjoner som kontrollerer mengden av cellulære organeller, eller fjerner de defekte organellene, slik som peroksisom [8]. Den autofagiske banen, fra cytoplasma til lysosomer, spiller en vesentlig rolle i nedbrytningen av melanosomer i humane epidermalkeratinocytter [9]. Disse dataene gir bevis på at lysosomale spesifikke enzymer bidrar til melanin-nedbrytning. Tidligere fant vi melaninfarge-reduksjonsaktiviteten til enzymet i lysosomal fraksjon, et kompleks som inneholder hydrolysater for å bryte ned avfallsmateriale og cellulærrester i peroksisomer og lysosomer [10, 11]. Denne artikkelen studerte effekten av de tre utvalgte enzymene, Glutathione peroxidase, Thiol peroxidase, Catalase, i lysosomal fraksjon for å redusere melaninfargen. Disse peroksidasene virker for å forsvare seg mot celleskade forårsaket av reaktive oksygenarter (ROS), og er tilstede i alle eukaryoter [12].

Reaktive oksygenarter (ROS) dannes som et naturlig biprodukt av normal metabolisme av oksygen i cellene, og kan økes av miljøstress. Høyt generert ROS kan skade celler. De skadelige effektene av ROS på cellen er som følger [12, 13]: skade på DNA eller RNA, oksidasjoner av flerumettede fettsyrer i lipider, oksidasjoner av aminosyrer i proteiner og oksidativ deaktivering av spesifikke enzymer ved oksidasjon av kofaktorer. Cellene nøytraliserer ROS av et antioksidasjonssystem for å forhindre slik vevsskade. I dette systemet er superoksidanionet som produseres av metabolismen svært ødeleggende; selv om det omdannes til hydrogenperoksid av Superoxide dismutase (SOD), er hydrogenperoksidet fortsatt reaktivt. Hydrogenperoksidet omdannes til H2O av Catalase, og konsumeres i produksjonen av Glutationdisulfide (GSSG) fra Glutation ved katalyse av GPX. TPX fungerer på samme måte som GPX [13].

Denne studien undersøkte den melanin-avfargede effekten av tre antioksidantenzymer, GPX, TPX og Catalase. Som et resultat var GPX og TPX effektive for å redusere melaninfarge. Blant dem hadde GPX ingen cytotoksisitet ved den optimale konsentrasjonen av melanin-avfargingsaktivitet, og hemmet effektivt melaninsyntese. Derfor gir det bevis på at GPX spiller en viktig rolle i mekanismen for melaninavfarging av lysosomfraksjonen, ikke bare antioksidantaktivitet, og tilbyr potensialet til et nytt blekende kosmetisk middel som et enkelt enzym.

Materialer og metoder

Peroksidaser og peroksidaseaktivitetsanalyse

Konsentrasjonen av de tre peroksidasene (Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase og Catalase) ble bestemt ved hjelp av analysesett (Peroxidase-analysesett, D2PD-100, QuantiChromTM) kjøpt fra Bioassay Systems. Glutathione peroxidase 2(GPX2, NBP1-78,824, Novus) og Thiol peroxidase (TPX,NBP1-78,805, Novus) ble kjøpt fra Novus, andCatalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich ) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich.

Dette analysesettet bruker H2O2 og et elektrondonorfargestoff som danner resorufin under peroksidasen. Analysen ble utført ved romtemperatur (RT), og intensiteten til fargen ble målt ved 57 0 nm. Peroksidasene ble reagert med elektrondonorfargestoffet med 0,6 prosent hydrogenperoksid i 10 minutter ved romtemperatur. Etter reaksjon ble stoppreagenset tilsatt, og absorbansen til prøven ble målt ved mikroplatespektrofotometri. Aktiviteten ble beregnet som følger:

Peroksidaseaktivitet=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Reaksjonsvol(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Sample Vol(𝜇L)

(U/L). En enhet (U) enzym vil katalysere dannelsen av 1 μmol resorufin per min under analysebetingelsene. Her er RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN og RH2O absorpsjonen av henholdsvis prøven, prøveblank, resorufin og vann; og n er prøvefortynningsfaktoren. [Resorufin] for denne analysen er 50 μM. Reaksjonsvolum er 100 μL, og prøvevolum i denne studien er 10 μL.

Melaninavfarging med glutationperoksidase (GPX), tiolperoksidase (TPX) og katalase

Melaninløsningen inneholder {{0}},1 mM PBS (fosfatbufret saltvann, pH: 7,0) og melaninpulver (Synthetic,Sigma) som ble fremstilt ved oksidasjon av tyrosin med hydrogenperoksid. Melanininnholdet ble målt ved absorbansen ved 450 nm. For å bestemme melaninkonsentrasjonen ble det utarbeidet en standardkurve fra en autentisk standard av syntetisk melanin (R2=0.999, data ikke vist).

For å bekrefte melaninavfargingen ble 100 ppm melaninløsning inneholdende (50 til 1000) μU/L peroksidaser (GPX, TPX, Catalase) med 1 mM hydrogenperoksid reagert ved RT og målt hver dag. Melaninavfargingsverdien ble bestemt ved å trekke melaninkonsentrasjonen etter reaksjonen fra startverdien.

Cistanche hemmer melaninsyntesen.

Cellekultur

B16F10-musmelanomcellene (KCLB 80008) ble kjøpt fra Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea). Cellene ble dyrket i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) inneholdende 4500 mg/L glukose, 4 mM l-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, som ble tilsatt 10 prosent føtalt bovint serum (FBS), 20 mM HEPES, 1 prosent penicillin, og cellene ble inkubert i en fuktig tilstand inneholdende 5 prosent CO2 ved 37 grader. Mediet ble byttet ut hver 2. dag (d), og cellene ble høstet ved å bruke trypsin/EDTA-løsning.

Celleviabilitetsanalyse (MTT-analyse)

Den toksiske effekten av glutationperoksidase på B16F10 melanoma-celle ble bekreftet av MTT-analyse, en generell metode som ble brukt for å bestemme effekten av en prøve på levedyktigheten til adherente celler. Denne analysen bruker 3-(4,5-dimetyl-tiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) som kan reduseres til formazan av mitokondrie enzym i levedyktige celler. De 3 × 103 cellene ble sådd per brønn i en 96-brønnplate og inkubert i 24 timer. Deretter ble en prøve tilsatt hver brønn og inkubert i 72 timer. Deretter ble mediet byttet ut til et som inneholdt 0,5 mg/ml MTT, og inkubert i 2 timer. Deretter ble MTT-fargereagenset fjernet, og det genererte formazan ble oppløst av DMSO i 30 minutter. Til slutt ble konsentrasjonene av formazan målt ved 570 nm ved bruk av mikroplatespektrofotometri. Cellelevedyktigheten ble beregnet som følger: cellelevedyktighet (prosent )=(Aprøve − Ablank)/(Akontroll − Ablank)*100.

cistanche på hindi

Melanininnholdsanalyse

De 3 × 105 B16F10-cellene ble sådd per brønn i en 6-brønnplate og inkubert i 24 timer for å feste seg. Mediet til hver brønn ble byttet ut med en som inneholdt forskjellige konsentrasjoner av enzym og 10 nM -MSH, deretter inkubert i 72 timer. Etter det ble alle brønnene vasket med DPBS-buffer og høstet ved bruk av 0,5 prosent trypsin/EDTA-løsning. Pelletene av celler oppnådd gjennom sentrifugering ble lysert med 200 μL 1 N NaOH inneholdende 10 prosent DMSO i 1 time ved 80 grader. Til slutt ble det lyserte melanininnholdet målt ved absorbansen ved 450 nm. Melaninproduksjonshemmingseffektiviteten til enzymet ble bestemt ved sammenligning med positiv kontroll ved bruk av 100 mg/ml arbutin.

Resultater

Peroksidaseaktivitet av glutationperoksidase (GPX), tiolperoksidase (TPX) og katalase

Denne studien er utvidet forskning på anvendelsen av lysosomal fraksjonsbehandling for avfarging av melaninforbindelser in vitro og in vivo. I tidligere studie fant vi at lysosomfraksjon isolert fra Hela-celler, S. cerevisiae, egg fra høne har effekten av å redusere melaninfargen, ogeffektiviteten av melaninavfarging var assosiert med peroksidaseaktiviteten til lysosomfraksjonen som ikke er membranbundet mikrosomfraksjon, inkludert lysosomer og peroksisomer. For å bekrefte melaninfarge-reduksjonseffekten av peroksidaser, ble tre peroksidaser valgt, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX) og Catalase. Disse enzymene spiller en viktig rolle i å redusere oksidativt stress forårsaket av reaktive oksygenarter i celler [14].

Aktiviteten til disse enzymene ble bestemt ved hjelp av analysesett (Peroxidase-analysesett, D2PD-100, QuantiChrom™). Denne metoden var basert på oksidasjon av elektrondonorfargestoff som danner en rosa farge under peroksidasereaksjonen [15]. Peroksidaseaktiviteten ble uttrykt ved bruk av følgende enheter: 1 enhet=1 U=dannelsen av 1 µmol resorufin per min under analysebetingelsene. Tabell 1 oppsummerer aktiviteten og konsentrasjonen av de tre peroksidasene, GPX, TPX og Catalase.

Melanin avfargingsaktivitet av glutationperoksidase (GPX), tiolperoksidase (TPX) og katalase

For å bekrefte melaninavfargingseffekten til peroksidasene ble 100 ppm melaninløsning behandlet med 1 mM hydrogenperoksid og (50 til 1000) µU/L konsentrasjon av hver peroksidase. Prøvene ble reagert i 2 dager ved RT, deretter sammenlignet med startkonsentrasjonen. Figur 1 viser melanin-reduksjonen etter 48 timer. Figur 1 viser bevis på at TPX og GPX har melanin-avfargingsaktivitet. Katalasen hadde ingen effekt på å redusere melaninfarge (fig. 1a). TPX var effektiv til å avfarge melaninforbindelser, og effektiviteten var best når den ble behandlet ved en konsentrasjon på 1 µU/ml (fig. 1b). GPX hadde også en melaninfargereduksjonsaktivitet, som var best ved konsentrasjon på 0,2 µU/ml, og avtok gradvis ved høyere konsentrasjoner (fig. 1c). Denne verdien representerer 175 prosent forbedret melaninfargereduksjon sammenlignet med kontrollen behandlet med kun hydrogenperoksid. GPX var mer effektiv med tanke på konsentrasjon og peroksidaseaktivitet sammenlignet med TPX. Behandlingen av 0,2 µU/mL GPX og 1 mM hydrogenperoksid tilmelaninløsning avfarget 13 prosent av 100 ppm melanin for 4 d (fig.2). Imidlertid viste verken GPX eller TPX noen fargereduksjonseffekt under fravær av hydrogenperoksid (data ikke vist).

Tabell 1 Spesifikke data for enzymene, Glutathione Peroxidase 2, Thiol Peroxidase og Catalase

Effekt av glutationperoksidase (GPX) og H2O2 på B16F10-cellelevedyktighet

Effekten av GPX på levedyktigheten til B16F10 melanomceller ble bekreftet ved MTT-analyse, før inhiberingstesten for melaninsyntese. For å finne den riktige konsentrasjonen av hydrogenperoksid å behandle, ble cytotoksisitet vurdert ved behandling med hydrogenperoksid i 72 timer ved forskjellige konsentrasjoner. Under konsentrasjonen på 0.1 mM hadde H2O2 ingen celletoksisitet for cellene i 72 timer, mens det ved konsentrasjon over 1 mM ble observert stor toksisitet. (Fig. 3a). Effekten av GPX på celleoverlevelse ble deretter vurdert i nærvær av 0.1 mM hydrogenperoksid, som ikke var cytotoksisk. GPX hadde ingen cytotoksisitet til B16F10-celler under konsentrasjonen på 0,5 μU/ml, noe som var effektivt i studier av melanindefarging (fig. 3b).

Figur 1Den relative melaninfargereduksjonen sammenlignet med behandling av kun hydrogenperoksid.

Effekt av glutationperoksidase (GPX) og H2O2 på melaninsyntese i B16F10 melanomceller

Vi undersøkte effekten av GPX, som var mest effektiv på melaninavfarging, på melaninsyntese i melanocytter. Figur 4 viser melanininnholdet i B16F10melanomceller behandlet med hver prøve i 72 timer. Behandlingen med 0,05 μU/mL GPX og 0,1 mM H2O2 induserte mest inhibering av melanogenese med 43 prosent sammenlignet med kontroll (bare behandling med -MSH). Dette var 153 prosent høyere enn den positive kontrollen (behandling med Arbutin og -MSH), og 22 prosent høyere enn for hydrogenperoksid uten enzym, mens behandling av GPX ikke viste dramatisk melaninreduksjon i fravær av hydrogenperoksid støtter også dette synet (data ikke vist). Som et resultat hemmet GPX produksjonen av melaninforbindelser, men melaninsyntesen i cellene ble mer påvirket av hydrogenperoksidetan av GPX.

Diskusjon

I denne studien fant våre forskere den optimale konsentrasjonen og effekten av GPX, TPX og Catalase, antioksidantenzymer som reduserer oksidativt stress i celler, på avfarging av melaninforbindelser. Som et resultat av ekstracellulære eksperimenter ved bruk av syntetiserte melaninforbindelser, har GPX og TPX en melaninavfargingseffekt, men Catalased gjør det ikke. Det er rapporter om at lignin-nedbrytende enzymer i enkelte sopp, som en laccase, ligninperoksidase, kan bryte ned melanin i nærvær av hydrogenperoksid [16–18]. Gjennom denne studien ble det bekreftet at antioksidantenzymene, som finnes i alle eukaryoter og ikke lignin-nedbrytende enzymer, har melanin-avfargingsaktivitet. Selv om GPX og TPX også kan redusere melaninfarge i nærvær av hydrogenperoksid, har disse enzymene muligheten til å fungere som en hovedkomponent i melaninavfargingsmekanismen til lysosomfraksjonen.

GPX, som var mest effektivt for å redusere melanin colorin vitro, ble behandlet med B16F10 melanomceller for å bestemme effekten på melaninsyntesen. I B16F10 melanomceller var GPX ikke cytotoksisk ved konsentrasjoner som var effektive i avfarging av melaninforbindelser, og konsentrasjonen av hydrogenperoksid behandlet sammen var 0,1 mM, uten toksisitet. Behandling av hydrogenperoksid hemmet melaninsyntesen i stor grad, og når man jobbet med GPX, var effektiviteten bedre, mens det ikke var noen konsentrasjonsavhengighet av stoffet. Siden hydrogenperoksid raskt forbrukes av enzymer, kan det tolkes som at jo høyere konsentrasjon av enzym som skal behandles, jo lavere er inhiberingen av melaninsyntese av hydrogenperoksid. Det faktum at behandling av GPX ikke viste dramatisk melaninreduksjon i fravær av hydrogenperoksid støtter også dette synet (data ikke vist). Som et resultat hemmet GPX produksjonen av melaninforbindelser, men melaninsyntesen i cellene ble mer påvirket av hydrogenperoksidetan av GPX. Disse resultatene tyder på at antioksidantenzymer induserer nedbrytning av melanin i autofagimekanismer som fordøyer melanosomer.

cistanche tabletter

For mer informasjon, vennligst klikk her.

Konklusjon

Vår studie viser at glutationperoksidase (GPX) og tiolperoksidase (TPX) bidrar til melaninavfarging, og GPX hemmet effektivt melaninsyntese. Resultatene støtter hypotesen om at antioksidantenzymer induserer nedbrytning av melanin i autofagimekanismer som fordøyer melanosomer. For å komme til en sikker konklusjon kan det være nødvendig å studere mekanismen for melanosomfordøyelse i hudceller, keratinocytter og melanocytter.