Melanocyttaktiveringsmekanismer og rasjonelle terapeutiske behandlinger av Solar Lentigos

Abstrakt:For å karakterisere patobiologien til solar lentigos (SL), avslørte analyser ved semikvantitativ RT-PCR, Western blotting og immunhistokjemi det oppregulerte uttrykket av endotelin (EDN)-1/endotelin B-reseptorer (EDNBR), stamcellefaktor (SCF) )/c-KIT, og tumornekrosefaktor (TNF) i lesjonsepidermis, som stod i kontrast til det nedregulerte uttrykket av interleukin (IL) 1 . Disse funnene støtter sterkt hypotesen om at tidligere gjentatt UVB-eksponering utløser keratinocytter til kontinuerlig å produsere TNF. TNF stimulerer deretter utskillelsen av EDN-er og produksjonen av SCF på en autokrin måte, noe som fører til kontinuerlig melanogen aktivering av nærliggende melanocytter, som forårsaker SL-er. En klinisk studie av 36 pasienter med SL-er i seks måneder behandlet med et M. Chamomilla-ekstrakt med en potent evne til å oppheve den EDN-1-induserte økningen i DNA-syntese og melanisering av humane melanocytter i kultur, avslørte en signifikant forbedring i pigmentskåre og fargeforskjeller uttrykt som L-verdier. En annen klinisk studie med entyrosinasehemmer L-askorbat-2-fosfat 3 Na (ASP) viste at L-verdiene i testlotion (6 prosent APS)-behandlet hud økte signifikant i SLs og i ikke-lesjonell hud med en signifikant høyere ∆L-verdi i SLs når sammenlignet med ikke-lesjonell hud. Summen av disse funnene tyder sterkt på at kombinert lokalbehandling med EDN-signalblokkere ogtyrosinaseinhibitorer er et ønskelig terapeutisk valg for SLs.

Nøkkelord: solar lentigo; endotelin; stamcellefaktor; keratinocyttvekstfaktor; interleukin-1; tumor nekrose faktor; intracellulær signalering; kalsiummobilisering; signalblokkering; M. chamomilla; askorbat-fosfat Na; Whitening agent; tyrosinasehemmer

Cistanche er en tyrosinasehemmer.

Klikk for å cistanche-effekter for å hemme tyrosinase

1. Introduksjon

Den hyppigst forekommende epidermale hyperpigmentære lidelsen i asiatisk hud er solar lentigos (SL), som vanligvis forekommer i ansiktet og på håndryggen. I motsetning til UVB-indusert hyperpigmentering (UVB-melanose), som, avhengig av personens alder, forsvinner innen to uker til noen måneder etter seponering av UVB-eksponeringen, utvikles SL-er på soleksponert hud, spesielt ansiktet, og aldri forsvinne på grunn av mulig DNA-skade i keratinocyttene fremkalt av gjentatt UVB-bestråling av lesjonsepidermis. Generelt er hyperpigmentære lidelser generelt målrettet av antipigmenterende midler og inkluderer UVB-melanose, SLs og melasma. Basert på frekvensen av den endelige diagnosen for pasienter med ulike pigmentforstyrrelser i Japan, har SL den høyeste forekomsten, og forekommer hos omtrent 60 prosent av alle pasienter med hyperpigmentære lidelser, mens melasma og postinflammatorisk hyperpigmentering (inkludert UVB-melanose) forekommer i så lavt som henholdsvis 5,2 prosent og 3,3 prosent av pasientene [1]. Dette antyder at SL-er er et dominerende mål for anti-pigmenterende midler for asiatisk hud. Imidlertid har det vært få publiserte artikler om de kliniske effektene av anti-pigmenterende midler på SL fordi mange anti-pigmenterende midler fungerer somtyrosinasehemmere og det er ikke forventet dettyrosinaseinhibering ville være tilstrekkelig til å forbedre hyperpigmenteringen av SL-er. I tillegg virker det vanskelig å rasjonelt designe en effektiv terapeutisk topisk behandling for SL-er fordi lite er kjent om melanocyttaktiveringsmekanismene i lesjonsepidermis. I denne oversiktsartikkelen karakteriserer vi patobiologien til SL-er i henhold til lokal behandling for SL-er fordi lite er kjent om melanocyttaktiveringsmekanismene i lesjonsepidermis. I denne oversiktsartikkelen karakteriserer vi patobiologien til SL-er i henhold til de kjente melanogene parakrine cytokinnettverkene, og basert på de oppdagede melanocyttaktiveringsmekanismene i lesjonsepidermis til SL-er, introduserer vi rasjonelle kliniske tilnærminger for topisk behandling for SL-er for å forbedre hyperpigmenteringen nivå.

2. Kliniske egenskaper

SL-er utvikler seg klinisk som flate, godt omskrevne hudflekker med varierende farger og størrelser, som ofte vises i ansiktet og på håndryggen (Figur 1a) [2]. Histokjemien til SL-lesjoner farget med Hemoxylin & Eosin avslørte lett akantose og pigmentering langs basalcellelaget (Figur 1b) [2]. Det er to mønstre når det gjelder de histopatologiske egenskapene til SL i ansiktet: det ene mønsteret viste en flatet epidermis med basal melanose, og det andre mønsteret viste epidermal hyperplasi med forlengede rete-rygger sammensatt av dypt pigmenterte basaloidceller [3].

3. Mekanismer for melanocyttaktivering i Solar Lentigo basert på melanogent parakrint cytokinnettverk

3.1. Melanocyttnummer og tyrosinaseuttrykk

Selv om det har vært noen argumenter om det økte antallet melanocytter i SL-er, avslørte immunhistokjemisk analyse ved bruk av den melanocyttspesifikke markøren MART-1 et økt antall melanocytter i solar lentigo [5–7]. Imidlertid er den faktiske tettheten av melanocyttene langs grensen mellom dermis og epidermis i SLs lik den i perilesjonell kontrollhud på grunn av økt spredning av keratinocytter [7]. Immunhistokjemi ved bruk av anti-tyrosinaseavslørte dettyrosinase-positive melanocytter ble signifikant økt 2- ganger i lesjonsepidermis til SLs [4]. Genanalyse ved semikvantitativ RT-PCR avslørte at tyrosinase-mRNA-ekspresjonsnivået er signifikant oppregulert med 2.3- ganger i lesjonsepidermis [4]. Funnene ovenfor støtter muligheten for at det er en stimulering av både proliferasjon og melanisering i SL lesjonsmelanocytter. Derfor antok vi at litt prolifererende keratinocytter i SL-er utløser aktiveringen av nabomelanocytter ved å utskille melanocyttstimulerende cytokiner.

3.2. Melanogene parakrine cytokinnettverk

Vi, og andre grupper, har belyst at det er flere viktige melanogene parakrine cytokinnettverk mellom hudceller (Figur 2). Disse inkluderer hovedsakelig endotelin (EDN)-1 [8–15], membranbundet stamcellefaktor (mSCF) [16], proopiomelanokortin (POMC) [17–20], prostaglandin E2 [21], granulocyttmakrofager kolonistimuleringsfaktor (GM-CSF) [22], grunnleggende fibroblastvekstfaktor [23], vekstrelatert onkogen [24] og keratinocyttvekstfaktor (KGF) [25,26] involvert i keratinocytt/melanocytt-interaksjoner og løselig SCF [27 ], hepatocytvekstfaktor (HGF) [8,10,27–29] og KGF [30] involvert i fibroblast/melanocytt-interaksjoner. Basert på de belyste melanogene parakrinecytokinnettverkene inkludert deres korresponderende reseptorer, er det viktig å bestemme hvilke melanogene parakrine cytokinnettverk som er involvert og spesifikt aktivert in vivo i hyperpigmenteringsmekanismene i lesjonsepidermis til SLs.

3.3. Store parakrine cytokiner og reseptorer ansvarlig for melanocyttaktivering i SL

Blant de ovennevnte melanogene cytokinene og deres korresponderende reseptorer, bestemte vi først rollen til grunnleggende fibroblastvekstfaktor (bFGF) og vekstrelatert onkogen (GRO) i epidermis til SLs. Grunnleggende FGF ble funnet å være overuttrykt i UVB-eksponerte humane keratinocytter, hvis homogenater hadde det distinkte potensialet til å stimulere melanogenese og spredning av humane melanocytter i kultur, selv om kofaktorer med evne til å øke sykliske AMP-nivåer i hovedsak er nødvendige for melanogen stimulering [23 ]. GRO ble identifisert av vår forskningsgruppe som et melanogent cytokin som spiller en viktig rolle i fenylazo-naftol-indusert hyperpigmentering etter sin allergiske reaksjon i brunaktig gul marsvinhud [24,31]. Semikvantitativ RT-PCR avslørte at det ikke var noen endring i genekspresjonsnivåene av bFGF og GRO i SL lesjonsepidermis sammenlignet med ikke-lesjonell epidermis [2]. I samsvar med mRNA-ekspresjonsnivået til bFGF og GRO, avslørte immunhistokjemi at det ikke var noen forskjell i immunfargingsintensiteten med anti-bFGF (figur 1c,d) og anti-GRO (figur 1e,f) mellom SL-lesjon og ikke-lesjon epidermis [2]. Disse funnene indikerte ingen involvering av bFGF eller GRO som iboende melanogene cytokiner for melanocyttaktiveringsmekanismen i SL.

I den biologiske mekanismen til UVB-indusert hyperpigmentering oppreguleres uttrykket av EDN1, et vasokonstriktorpeptid opprinnelig isolert fra endotelceller fra svin [32], og mSCF [16] på en autokrin måte ved virkningen av den UVB-stimulerte frigjøringen av interleukin ( IL)-1 via generering av reaktive oksygenarter (ROS) [15]. Disse cytokinene får nabomelanocytter til å øke deres uttrykk for de kritiske melaninsyntetiserende enzymene tyrosinase [14,33], EDNBR [34] og melanosommatriseprotein PMEL17 [34] samt proliferasjonsrelaterte enzymer som syklisk avhengig kinase (CDK)2 [34], som fører til hyperpigmentering i UVB-eksponert hud. Basert på de viktigste melanogene cytokinene som hovedsakelig er involvert i UVB-melanose, bestemte vi deretter rollen til EDN1 i melanocyteaktiveringsmekanismen i epidermis til SLs. Karakterisering av mRNA-ekspresjonsnivået til EDN1 i epidermis ved semikvantitativ RT-PCR-analyse viste at det var en markant økning i ekspresjon med gjennomsnittlig 3.2- ganger i SL lesjonsepidermis sammenlignet med ikke-lesjonsepidermis [4]. I samsvar med det økte genekspresjonsnivået til EDN1, var det økt immunfarging med anti-EDN1 gjennom hele SL lesjonsepidermis (Figur 1g, h) [4].

I tillegg til EDN1, bestemte vi deretter rollen til EDN-reseptorer i melanocyttaktiveringsmekanismen som ligger til grunn for SL-er. Bindingen av EDN til reseptoren er det første trinnet i den store parakrine avstamningen mellom keratinocytter og melanocytter som oppregulerer hudpigmentering [11,14,35,36]. EDN-reseptorer er syv-transmembrane G-protein-koblede reseptorer med to isoformer (A og B) som interagerer spesifikt med EDN1 og med alle former for EDN-er (EDN1, EDN2 og EDN3), henholdsvis [37]. Når det gjelder de hemmende effektene av EDN-reseptorantagonister på den EDN-stimulerte proliferasjonen av humane melanocytter i kultur, oppstod en signifikant hemmende effekt bare i nærvær av BQ 788, anendothelin B-reseptor (EDNBR) antagonist, men ikke av BQ123 eller BQ610, en endothelin En reseptor (EDNAR) antagonist [9], som indikerte at EDN1/EDN reseptor signalering er mediert via EDNBR. Semikvantitativ RT-PCR-analyse av uttrykket av EDNBR-mRNA avslørte at blant de forskjellige typer hudceller er melanocytter den eneste vesentlige celletypen som uttrykker EDNBR. Siden vi allerede har vist at EDN1 utskilt av keratinocytter utløser aktiveringen av den intracellulære proteinkinase C (PKC) via EDNBR [35], bestemte vi om ekspresjonsnivået til EDNBR også ble fremhevet i melanocytter i den lesjonelle SL-epidermis. Semikvantitativ RT-PCR-analyse av EDNBRmRNA i epidermis til SL-er viste et markant økt uttrykk med gjennomsnittlig 6.8- ganger i den lesjonelle SL-epidermis [4]. I samsvar med den økte ekspresjonen av EDNBR mRNA, var det økt immunfarging med anti-EDNBR lokalisert i melanocytter i den lesjonelle SL-epidermis (Figur 1i,j) [4]. Summen av disse funnene antyder sterkt den koordinerte økningen i uttrykket av EDN1 og dets reseptorbinding i lesjonsepidermis til SLs.

Basert på de viktigste melanogene cytokinene involvert i UVB-melanose, bestemte vi deretter rollen til SCF i melanocyttaktiveringsmekanismen i den lesjonelle SL-epidermis. Vi har allerede rapportert at UVB-eksponering av dyrkede humane keratinocytter så vel som human epidermis i betydelig grad stimulerer uttrykket av SCF på både gen- og proteinnivå [15,16]. Semikvantitativ RT-PCR-analyse av SCF-mRNA i epidermis til SLs demonstrerte det markant økte uttrykket med et gjennomsnitt på 3.9- ganger i den lesjonelle SL-epidermis sammenlignet med ikke-lesjonell epidermis [2]. Western blotting for SCF i huden til seks pasienter med SL viste at det var en signifikant økning på gjennomsnittlig 1.6- ganger i SCF-protein i den lesjonelle SL-epidermis sammenlignet med ikke-lesjonell epidermis [2].

I samsvar med det økte gen- og proteinekspresjonsnivået til SCF, var det økt immunfarging med anti-SCF gjennom den lesjonelle SL-epidermis (Figur 1k,l) [2]. Det var et argument om hvorvidt SCF oppregulert på proteinnivå i lesionalepidermis er den løselige typen eller den membranbundne typen. Hvis basalmembran-permeabel-løselig SCF er oppregulert i epidermis, bør mastceller som er tilstede i dermis aktiveres for å proliferere og øke i antall. Siden toluidinblåttfarging i SL-er ikke viste noen økning i antall mastceller i lesjons-SL-dermis [2], er det sannsynlig at typen SCF som er oppregulert i SL-er, er den membranbundne typen.

I tillegg til SCF, bestemte vi deretter rollen til SCF-reseptoren c-KIT i melanocyttaktiveringsmekanismen som ligger til grunn for SL-er. Vi har allerede rapportert at UVB-eksponering av dyrkede humane melanocytter så vel som human epidermis i betydelig grad stimulerer ekspresjonen av c-KIT på både gen- og proteinnivå [15,38]. Videre, i den UVB-stimulerte pigmenteringen av brungul marsvinhud, opphevet et blokkerende antistoff mot c-KIT det økte antallet dopa-positive melanocytter samt hyperpigmentering i en tidlig fase av den UVB-induserte pigmenteringsprosessen signifikant [16] , som sterkt indikerer at bindingen av SCF til c-KIT spiller en viktig rolle i UVB-indusert aktivering av melanocytter, noe som fører til hyperpigmentering. Samtidig med økt ekspresjon av SCF på gen- og proteinnivå, ble genekspresjonsnivået til c-KIT-reseptoren også økt med gjennomsnittlig 2.{13}} ganger i den lesjonelle SL-epidermis [2]. I samsvar med det økte uttrykket av c-KIT mRNA, var det økt immunfarging med c-KIT-antistoffet lokalisert i melanocytter i den lesjonelle SL-epidermis (Figur 1m,n) [2]. Dette antyder at det er en koordinert økning i uttrykket av SCF og dets reseptor c-KIT i den lesjonelle SL-epidermis.

På den annen side har andre grupper antatt at keratinocyttvekstfaktor (KGF)/KGF-reseptor (KGFR) spiller en viktig rolle i initieringen av SL-dannelse og i økt pigmentering kun i epidermis i tidligere SL-stadier [25]. I lesjonsepidermis [30] og/eller dermis [25] av SL-er, oppreguleres KGF-ekspresjon bare på immunfargingsnivået, selv om ytterligere studier på gen- og proteinekspresjonen er nødvendig for eventuelle endelige konklusjoner om det som et iboende cytokin som forårsaker SLs. Mens IL-1 er kjent for å få keratinocytter til å stimulere produksjonen av KGF, er det fortsatt uklart hvordan KGF-ekspresjon er oppregulert i lesjonsepidermis der IL-1-ekspresjon er ganske nedregulert [2]. Selvfølgelig bør det avgjøres om TNF (som er oppregulert i lesjonsepidermis) har en evne til å stimulere KGF-produksjon. Siden KGF-ekspresjon i huden primært er begrenset til dermale fibroblaster, er det sannsynlig at økt ekspresjon av KGF av dermale fibroblaster i lesjonsdermis av SLs [25] er assosiert med både økt proliferasjon av keratinocytter og stimulert melanogenese. Dermed er det sannsynlig at dermale fibroblaster vedvarende aktiveres av UV-eksponering for å frigjøre KGF, som virker direkte eller indirekte grundige keratinocytter for å modulere uttrykket av SCF, og bidrar til hyperpigmentering av SL [25].

Vi bestemte deretter de biologiske mekanismene som EDN1-sekresjon er oppregulert i den lesjonelle epidermis til SLs. Det er velkjent at biologiske faktorer assosiert med stimulering av EDN-sekresjon av humane keratinocytter inkluderer IL-1, tumornekrosefaktor (TNF) og endotelinkonverterende enzym (ECE)-1. Våre funn på autokrine cytokinstimulering assosiert med UVB-melanose viste at oppreguleringen av IL-1 hovedsakelig er ansvarlig for å stimulere produksjonen av EDN1 og SCF i UVB-eksponerte humane keratinocytter [12,16]. Dermed har IL-1 og blitt funnet å være potente stimulatorer av EDN-sekresjon med en forsinket topp i humane keratinocytter i kultur som ligner mønsteret til UVB-indusert sekresjon av EDN [11]. Det er også velkjent at UVB-bestråling i betydelig grad stimulerer frigjøringen av IL-1, men ikke IL-1 i dyrkede humane keratinocytter, og at et blokkerende antistoff mot IL-1 signifikant opphever den økte sekresjonen av EDN1 [11], noe som indikerer at UVB-indusert hyperpigmentering medieres via aktivering av epidermale melanocytter som følge av økt utskillelse av EDN1 av UVB-eksponerte keratinocytter. I tillegg har uttrykket av mSCF-protein blitt funnet å bli betydelig stimulert ved behandling med IL-1 i humane keratinocytter i kultur [16]. Derfor bestemte vi deretter om IL-1 også ble oppregulert for å stimulere uttrykket av EDN1 og/eller SCF i lesjonsepidermis til SL-er. Interessant nok viste semikvantitativ RT-PCR-analyse at uttrykket av IL-1 mRNA er ganske nedregulert i lesjonsepidermis [16]. I samsvar med denne RT-PCR-analysen avslørte immunhistokjemi med et IL-1-antistoff en svakere immunfarging i den lesjonelle epidermis enn i den ikke-lesjonelle epidermis (Figur 1o,p) [2], noe som antydet at IL{ {33}} er ikke ansvarlig for økt ekspresjon av EDN1 og SCF i lesjonsepidermis til SL.

Når det gjelder mekanismer som ligger til grunn for det økte uttrykket av EDN1 i SL-er, i tillegg til IL-1, ble TNF ved 10 ng/mL rapportert av Tsuboiet al. å være en potent stimulator (10- ganger) av EDN-sekresjon av dyrkede humane keratinocytter [39]. Når det gjelder mekanismen som ligger til grunn for det økte uttrykket av SCF i SL-er, undersøkte vi deretter effekten av TNF på SCF-ekspresjon i dyrkede humane keratinocytter. Western blotting ved bruk av ananti-SCF-antistoff viste at TNF signifikant stimulerer produksjonen av mSCF [15]. Derfor bestemte vi deretter om TNF er oppregulert for å stimulere uttrykket av EDN1 og/eller SCF i lesjonsepidermis til SL-er. Interessant nok avslørte semikvantitativ RT-PCR-analyse at uttrykket av TNF mRNA er betydelig oppregulert i den lesjonelle SL-epidermis [2]. I samsvar med RT-PCR-analysen viste immunhistokjemi med et anti-TNF-antistoff sterkere immunfarging i den lesjonelle SL-epidermis enn i den ikke-lesjonelle epidermis (Figur 1q, r) [2]. Dermed kunne det tenkes at det oppregulerte uttrykket av TNF hovedsakelig er ansvarlig for det økte uttrykket av EDN1 og SCF i lesjonsepidermis til SLs.

Når det gjelder mekanismen involvert i det økte uttrykket av EDN1, bestemte vi deretter om ECE-1 er oppregulert i den lesjonelle SL-epidermis. Siden ingen studier har beskrevet uttrykket av ECE-1 i humane keratinocytter på dette tidspunktet, karakteriserte vi ECE-1 i dyrkede humane keratinocytter sammenlignet med endotelceller. Analyse av ECE-1-aktivitet i ulike typer hudceller viste at humane keratinocytter og ikke humane melanocytter har ECE-1-aktivitet, som forekommer i mindre grad enn i endotelceller [40]. Western blotting, ved bruk av antistoffer vi forberedte mot ECE-1, viste at ECE-1-proteinet finnes i humane endotelceller, humane fibroblaster og humane keratinocytter, men ikke i humane melanocytter [40]. Analyser av ECE-1-aktivitet i supernatanter etter immunutfelling med ECE-1-antistoffet viste at endotelceller og humane keratinocytter har påvisbare aktiviteter av ECE-1 ved pH 6,8, som korrelerer godt med ECE-1 {15}} immunutfelt med antistoffet vårt mot ECE-1 [40]. Semikvantitativ RT-PCR-analyse av ECE-1 mRNA-nivåer avslørte at IL-1, men ikke TNF, hadde en liten stimulerende effekt på ECE-1-genekspresjon i dyrkede humane keratinocytter [40]. I samsvar med RT-PCR-analysen viste Western blotting at IL-1, men ikke TNF, stimulerte ECE-1-proteinekspresjon i dyrkede humane keratinocytter [40]. Til slutt bestemte vi om ECE-1 også er oppregulert for å stimulere EDN1-ekspresjon i lesjonsepidermis til SL-er. I samsvar med mangelen på en stimulerende effekt av TNF , som er oppregulert i SL-er, var det ingen forskjell i mRNA-ekspresjonsnivået til ECE -1 mellom lesjon og den ikke-lesjonelle epidermis til SL-er [2], noe som tyder på at ECE-1 er ikke ansvarlig for økt utskillelse av EDN1 i SL-er.

Figur 3 viser en oppsummering av autokrin stimulering i humane keratinocytter i kultur. Når det gjelder de biologiske mekanismene som fører til aktivering av EDN- og SCF-signalkaskader [9], antyder in vitro-studiene våre en interessant kontrast at mens oppreguleringen av IL-1 hovedsakelig er ansvarlig for å stimulere EDN1- og SCF-produksjon i UVB- melanose, er oppreguleringen av TNF hovedsakelig assosiert med den stimulerte produksjonen av de samme to cytokinene i SL-er.

3.4. Synergistiske stimulerende effekter av kombinasjonen av EDN1 og SCF

Vi har allerede rapportert at det er en synergi i den stimulerte DNA-syntesen i dyrkede humane melanocytter målt ved 14C-tymidin-inkorporering i samtidig tilstedeværelse av SCF og EDN1 [41]. Det var også en lignende synergi i stimuleringen av melaninsyntese målt ved 14C-tiouracil-inkorporering i dyrkede humane melanocytter i samtidig tilstedeværelse av SCF og EDN1 [41]. Derimot var det ingen slik synergi mellom EDN1 og den granulocyttmakrofagkolonistimulerende faktoren (GM-CSF) eller HGF [13,42]. Når det gjelder signalmekanismene som er involvert i de synergistiske effektene, fant vi at krysstalen mellom SCF- og EDN1-signalering ble initiert gjennom tyrosinfosforyleringen av c-KIT som stimuleres indirekte av aktivert PKC, som forbedrer dannelsen av Shc-Grb{ {18}}SOS-kompleks som igjen fører til synergistisk aktivering av Ras/Raf-1/MEK/MAP kinaseløkken [41].

3.5. Gjensidige interaksjoner mellom EDN/EDNBR og SCF/c-KIT

Vi bestemte deretter om den økte produksjonen av SCF utløser EDNBR-ekspresjon eller dens affinitet til EDN-liganden i humane melanocytter i tillegg til dens stimulerende effekt på deres spredning. Western blotting-analyse viste at SCF kan stimulere uttrykket av EDNBR-protein i dyrkede humane melanocytter [43]. Når affiniteten til EDNBR til liganden ble evaluert i dyrkede humane melanocytter ved bruk av en ligandbindingsanalyse, ble bindingen av 125I-merket EDN1 til EDNBR funnet å være betydelig økt to dager etter inkubering med SCF [43]. Til sammen indikerer disse funnene at SCF uttrykt i den tidlige fasen kan øke uttrykket av EDNBR, noe som fører til at melanocytter blir mer følsomme for den senere sekresjonen av EDN1. På den annen side, når dyrkede humane melanocytter ble behandlet i 48 timer med EDN1 ved 10 nM, avslørte ligandbindingsanalysen ved bruk av 125I-SCF at EDN1 tydelig forbedret bindingsaffiniteten til SCF til c-KITreseptoren [43].

4. Sammendrag av patobiologien til SL-er

Tabell 1 viser en oppsummering av de parakrine cytokinnettverkene som forekommer ved ulike epidermale hyperpigmentære lidelser. Med hensyn til disse nettverkene er SL veldig lik UVB-melanose bortsett fra de forårsakende cytokinene som TNF for økt produksjon av EDN1 og SCF.

Når det gjelder de biologiske mekanismene som fører til de økte aktivitetene til EDN- og SCF-signalkaskadene, antydet våre in vitro-studier at mens oppreguleringen av IL-1 hovedsakelig er ansvarlig for å stimulere EDN1- og SCF-produksjonen ved UVB-melanose, er oppreguleringen av TNF er assosiert med den stimulerte produksjonen av de samme to cytokinene i SL-er. Figur 4 viser et sammendrag av de komplekse forholdene mellom SCF- og EDN1-koblingene i epidermis til SL-er. Det inkluderer synergisme mellom SCF og EDN1 samt aktivering av EDNBR og c-KIT av henholdsvis SCF og EDN1. Frigjøringen av TNF av keratinocytter simulerer produksjonen av SCF og EDN på en autokrin måte, som begge viser en synergistisk effekt på melanocyttaktivering så vel som en stimulerende effekt på ekspresjonen av deres tilsvarende reseptorer, c-KIT og EDNBR. Disse synergistiske og intercellulære interaksjonene letter melanocyttaktivering i større grad i lesjonsepidermisen til SL-er enn i den UVB-eksponerte epidermis, noe som fører til mer intensiv hyperpigmentering av SL-er.

Samlet antyder resultatene våre at to signalkaskader, EDN1/EDNBR og mSCF/c-KIT, spiller en iboende og koordinert rolle som fremhever mitogenesen og melanogenesen til melanocytter i den hyperpigmenterte epidermis til SLs. Figur 5 viser den biologiske sekvensen for hyperpigmenteringsmekanismer involvert i SL-er, der ukjente tumorigene faktorer på grunn av kumulativ DNA-skade i den fjerne fortiden forårsaker at keratinocytter produserer og utskiller TNF. Dermed får TNF keratinocytter til å overprodusere melanogene cytokiner som SCF og EDN1 på en autokrin måte, og trigger tilstøtende melanocytter for å stimulere melaninsyntese, noe som fører til epidermal hyperpigmentering.

5. Terapeutiske aktuelle behandlingsmetoder

Basert på det koordinerte melanogene parakrine nettverket og aktiverte signalmekanismer som fører til melanocyttaktivering i lesionalSL-epidermis, er blokkering av essensiell melanogen intracellulær signalering en ønskelig terapeutisk tilnærming for å oppnå antipigmenterende effekter på SL-er. En slik tilnærming kan forårsake hypopigmentering, men bør ikke være effektiv i ikke-lesjonell hud der slike signalkaskader ikke aktiveres i melanocytter. På den annen side er hemming av tyrosinaseaktivitet en annen tilnærming for å forbedre hyperpigmenteringen i SLs, selv om det kan forårsake hypopigmentering og kan også være effektivt i ikke-lesjonell hud.

5.1. Blokkering av essensiell melanogen intracellulær signalering

Siden nesten alle mutasjoner som fører til genetiske hypopigmentære forstyrrelser forekommer i EDN1/EDNBR og SCF/c-KIT aksen [44] og siden det er en synergistisk stimulerende effekt av EDN1/SCF på celleproliferasjon og melanisering i dyrkede humane melanocytter, kan det tenkes at blokkering enten EDN1/EDNBR- eller SCF/c-KIT-signalering kan forhindre hyperpigmentering på grunn av det koordinerte økte uttrykket av EDN1 og SCF fordi en synergistisk stimulerende effekt ikke oppstår. Derfor forsøkte vi å oppnå antipigmenterende effekter på SL-er ved å blokkere EDN/EDNBR-signaleringslinjen.

Den EDN-aktiverte intracellulære signalveien består av binding til EDNBR, aktivering av PKC, MAP-kinasekaskaden og cAMP/PKA-kaskaden [34,35,41]. Dermed blir disse cellulære handlingene initiert av bindingen av EDN1 til den G-proteinkoblede EDNBR, etterfulgt av sekvensielle signaleringsprosesser som hovedsakelig består av PKC og MAPK. Etter binding til reseptoren, utløser EDN1 hydrolysen av polyfosfoinositide ved å aktivere fosfolipase C, som genererer inositol-trisfosfater (IP3) og diacylglycerol, mobiliserer henholdsvis intracellulær Ca pluss pluss og aktiverer PKC. PKC-aktivering oppnås ved translokasjon fra cytosolen til plasmamembranen og aktiverer Raf-1 gjennom fosforylering. Dermed ser Raf-1 ut til å være et konvergent punkt mellom PKC- og MAPK-veiene. Raf-1-aktivering fører til aktivering av en serie MAPK-vei-mellomprodukter bestående av MEK, ERK og RSK. Fosforylert Raf-1 aktiverer MEK ved fosforylering og aktiverte MEK fosforylerer ERK. Den aktiverte ERK fosforylerer deretter mikroftalmiassosiert transkripsjonsfaktor (MITF) ved serin 75, noe som fører til rekruttering av en ko-aktivator for å regulere genuttrykket av flere melanogene faktorer [41]. Samtidig resulterer aktivert MAPK i aktivering av RSK, som fosforylerer CREB, noe som fører til transkripsjon av MITF. På den annen side har aktivert PKC krysstale med adenylcyklase-kaskaden for å produsere cAMP[8], noe som fører til aktivering av PKA, som også aktiverer CREB ved fosforylering, noe som fører til økt uttrykk for MITF. Det økte nivået av MITF-protein stimulerer uttrykket av melanocyttspesifikke gener inkludert tyrosinase, PMEL17, EDNBR, c-KIT og CDK2.

Siden flere intracellulære signalveier fører til stimulert melanogenese i melanocytter, og EDN-signaleringskaskaden er spesifikt assosiert med PKC-veien, som involverer kalsiummobilisering fra det endoplasmatiske retikulum [13], brukte vi en kalsiummobiliseringsanalyse for å screene for EDNBR-antagonister fra en rekke forskjellige av urteekstrakter. Kalsiummobilisering fra det endoplasmatiske retikulum skjer etter generering av IP3 og diacylglycerol på grunn av hydrolyse av polyfosfoinositid gjennom aktivert fosfolipase C. Når humanmelanocytter behandles i kultur med EDN1, produserer mobiliseringen av kalsium som kan påvises av fura-2AM-reagensen fluorescens etter binding til frigjort kalsium, sett ved det hurtige utseendet til en gul farge som kan måles i sanntid ved å digital bildemikroskopi. Fra screening av mange urteekstrakter fant vi at pre-inkubasjon med et Matricaria chamomilla ekstrakt avbrøt kalsiummobiliseringen indusert av EDN1 [1], noe som antydet at det kan tjene som en effektiv antagonist mot EDNBR. M. chamomilla, vanligvis kjent som kamille, er en ettårig plante av den sammensatte familien Asteraceae. M. chamomilla er den mest populære kilden til urteproduktet kamille, selv om andre arter også brukes som kamille.

Basert på den hemmende effekten av prøver fraksjonert fra M. chamomilla-ekstraktet på EDN-{0}}indusert kalsiummobilisering i kulturhumane melanocytter, identifiserte vi spiroeter som dens aktive forbindelse med en potent evne til å avbryte kalsiummobilisering (Figur 6) ) [1]. Det er to isomerer av spiroeter (E og Z), og spiroeteren E-isomeren kan fullstendig oppheve kalsiummobilisering ved konsentrasjoner på mer enn 1 µM. Behandling med spiroeter E-isomeren ved 0,2 og 1,0 prosent konsentrasjoner reduserte den UVB-induserte pigmenteringen signifikant i brunaktig gul marsvinhud, evaluert av ∆L-verdien, som indikerte at blokkering av den EDN-mediert signalkaskade er effektivt for å forhindre UVB-indusert hyperpigmentering. Dette er viktig in vivo-bevis som viser den iboende involveringen av EDN-kaskaden i UVB-melanose. På den annen side, som forventet, når pre- eller co-inkubert i melanocyttkultur, hadde M. chamomilla-ekstraktet en potent evne til å oppheve EDN-1-indusert økning i DNA-syntese (målt ved 14C-tymidin-inkorporering) samt melaninsyntese (målt ved 14C-tiouracil-inkorporering) av dyrkede humane melanocytter. I en parallell studie med dyrkede humane keratinocytter, bekreftet vi at M.chamomilla-ekstraktet ikke hadde noen hemmende effekt på den IL-1 -induserte sekresjonen av EDN1 [1]. I tillegg, ved å bruke tyrosinaser avledet fra humanmelanocytter, bekreftet vi at M. chamomilla-ekstraktet ikke hadde noen hemmende effekt på tyrosinaseaktivitet in vitro i motsetning til de distinkte hemmende effektene av de velkjente blekemidlene, kojinsyre og arbutin [1]. Når M. chamomilla-ekstraktet ble påført daglig på brunaktig gul marsvineskinn i to uker umiddelbart etter UVB-bestråling, ble intensiteten av den UVB-induserte pigmenteringen betydelig redusert sammenlignet med behandling med 10 prosent arbutin eller bare bærer [1].

I en human klinisk studie ble det funnet at den topiske påføringen av M. chamomilla-ekstraktene på UVB-eksponert hud på underarmene i seks uker umiddelbart etter bestrålingen signifikant forhindret UVB-indusert hyperpigmentering målt med en fargeforskjellsmåler og uttrykt som en ∆ L-verdi.

Ved å bruke en voks som inneholder M. chamomilla ekstrakt, undersøkte vi de kliniske effektene på pigmenteringsinSL. I denne kliniske studien ble hver pigmentert flekk undersøkt for fargeendringer og graden av klinisk forbedring og validitet ble evaluert. En klinisk evaluering utført ved Tokyo Women's Medical University avslørte at behandling i to måneder med M.chamomilla-ekstraktet resulterte i at 48 prosent av forsøkspersonene viste en markant forbedring og 40 prosent med svak forbedring [1]. I endringene i pigmenteringsnivået målt ved ∆L-verdier, hadde alle pasienter med SL-er tydelige økninger over to i ∆L-verdien, et synlig gjenkjennelig nivå, etter behandling i 2~3 måneder. Det var en signifikant reduksjon i pigmenteringsnivået målt ved ∆L-verdier mellom 0, 1 og 2 måneder etter behandling (Figur 7). Totalt sett viste den kliniske evalueringen i tre måneder at behandling med M. chamomilla-ekstraktet resulterte i at 42 prosent av forsøkspersonene viste en markant forbedring, 12 prosent med en moderat forbedring og 25 prosent med svak forbedring. En annen klinisk studie utført på to relaterte dermatologiske sykehus i Tokyo viste at behandling med M. chamomilla-ekstraktet gradvis reduserte pigmenteringen og etter seks måneder resulterte det i at omtrent 70 prosent av forsøkspersonene viste mer enn liten forbedring, inkludert 10 prosent med forsvinning og 15 prosent med markert forbedring . Det var to tilfeller der SL-ene forsvant fullstendig etter omtrent seks måneders behandling, med ∆L-verdier som økte opp til 8,4 og 6,9 etter seks måneders behandling (Figur 8) [1].

Avslutningsvis, angående terapeutiske tilnærminger for SL-er ved å blokkere essensiell melanogen intracellulær signalering, antyder de ovennevnte kliniske studiene at blokkering av EDN1/EDNBR-assosiert signalering er en effektiv terapeutisk behandling for SL-er uten noen hypopigmenterende effekter.

5.2. Hemmer tyrosinaseaktivitet

Hemming av tyrosinaseaktivitet er en annen tilnærming for å forbedre hyperpigmenteringen i SLs som har mulige ulemper ved hypopigmentering, men den potensielle fordelen ved også å være effektiv i ikke-lesjonell hud. Siden blekemidler generelt er utviklet for å behandle UVB-melanose, har det ikke vært en klinisk dobbeltblindet studie for potensielle anti-pigmenterende effekter av blekemidler på SL. Vi utførte en dobbeltblindet halvansiktsstudie på 27 japanske kvinnelige frivillige med SL. I den kliniske studien ble lotioner med eller uten 6 prosent L-askorbat-2-fosfat 3 Na (APS) (henholdsvis testlotion/placebolotion) påført to ganger daglig i ansiktet i 24 uker [45]. Representative fotografier av ansiktene til forsøkspersoner nr. 012 og nr. 016 før og etter behandling viste at pigmenteringsnivået til de testlotion-behandlede SL-ene så ut til å synke litt i samsvar med en liten reduksjon i den testlotion-behandlede ikke-lesjonsbehandlede huden [ 45]. I motsetning til dette så pigmenteringsnivået til de placebo lotion-behandlede SL-ene og den ikke-lesjonelle huden ut til å forbli uendret. Mens L-verdiene i testlotion-behandlede SL-er økte signifikant etter 24 ukers behandling, forble L-verdiene i placebo-lotion-behandlede SL-er uendret (Figur 9) [45]. Sammenligninger av oL-verdier før og etter behandlingene viste en signifikant høyere oL-verdi i testlotion-behandlede SL-er enn i placebo-lotion-behandlede SL-er (Figur 9). Disse funnene tyder på at den APS-holdige testkremen hadde en signifikant sterkere anti-pigmenterende effekt på SL enn placebo lotion. Mens L-verdiene i testlotion-behandlet ikke-lesjonshud økte signifikant etter behandlingen i 24 uker, forble L-verdiene i placebo lotionbehandlet ikke-lesjonshud uendret. Sammenligning av oL-verdiene før og etter behandlingene avslørte en signifikant høyere oL-verdi i testlotion-behandlet ikke-lesjonshud enn i placebo-lotionbehandlet ikke-lesjonshud [45]. Disse funnene tyder på at testlotionen hadde en betydelig sterkere blekende effekt på ikke-lesjonell hud enn placebo lotionen. Sammenligning av de anti-pigmenterende effektene mellom SL-er og ikke-lesjonshud viste at selv om det var signifikant høyere oL-verdier mellom før- og etterbehandlingen med testlotionen i SL-er enn i den ikke-lesjonelle huden, forekom oL-verdiene på et lignende nivå i SLs og ikke-lesjonell hud uten noen signifikant forskjell mellom dem [45].

Cistanche hemmer tyrosinaseaktivitet.

Forholdet mellom L-verdiene og melaninindeksene for alle målinger under denne kliniske studien viste en signifikant korrelasjon mellom dem begge. Dette resultatet indikerte at en 2.0 ∆L verdi var omtrent ekvivalent med en 20 ∆ melaninindeks med en 10- ganger høyere sensitivitet i melaninindeksen enn L-verdien. En sammenligning mellom L-verdiene og melaninindeksene for hver måling ved uke 0 og 24 på SL-er viste signifikante korrelasjoner. Disse sammenligningene mellom L-verdiene og melaninindeksene indikerte at det var en markert distribusjonsforskyvning mot en lysere farge, slik som en større L-verdi og en mindre melaninindeks i de testlotion-behandlede SL-ene, mens det ikke var et så tydelig distribusjonsskifte i placebo-lotionen. -behandlede SLer [45].

Som konklusjon, angående en terapeutisk tilnærming for SL-er som bruker en tyrosinase-hemmer, indikerer summen av funnene ovenfor sterkt at APS har en svak, men signifikant anti-pigmenterende effekt på SL-er og en betydelig blekende effekt selv på normal farget sunn hud, uten noen hypopigmenterende effekt.

6. Konklusjoner

Avslutningsvis, angående melanocyttaktiveringsmekanismene og terapeutisk topisk behandling av SL-er, basert på funnene ovenfor av melanocyttaktiveringsmekanismen i SL-er, samt den kliniske effekten oppnådd ved bruk av en EDN-signalblokker og en tyrosinaseinhibitor, foreslås det sterkt at kombinert behandling av en EDN-signalblokker og en tyrosinasehemmer er en ønskelig terapeutisk behandling for SL-er.

cistanche tabletter

For mer informasjon, vennligst klikk på bildet.