Metaanalyse av NAD(P)(H) kvantifiseringsresultater viser variasjon mellom pattedyrvev Ⅱ

Effekten av pre-mortem versus post-mortem vevsinnsamling på NAD(P)(H)-nivåer.

Vi spådde at det kan være en observerbar forskjell i NAD(P)(H) redokstilstand som er avhengig av prosedyrer for vevshøsting. For å svare på dette spørsmålet undersøkte vi effekten av pre-versus post-mortem vevsinnsamlingsprosedyrer på NAD(P)(H) redoksstatus. For denne analysen sammenlignet vi verdier fra rottelevervev gitt det større antallet studier som definerer deres offerprotokoll. Når de ble avslørt, uttalte alle de gjennomgåtte studiene at vevsprøvene ble holdt kalde og umiddelbart ekstrahert på is eller frosset ved -80 grader før NAD(P)(H)-målinger. Denne analysen bestemte at det ikke var noen signifikant forskjell i NAD pluss konsentrasjoner i rottelever (fig. 6a) mellom vev ekstrahert før eller etter eutanasi. Imidlertid er de rapporterte NADH-nivåene i rottelever betydelig høyere i post-mortem prøver (fig. 6b). Ingen forskjeller i totale NAD(H)-nivåer (fig. 6c) ble observert, men NAD pluss/NADH-forholdet var lavere i vev samlet etter eutanasi (fig. 6d), noe som er i samsvar med variasjonen observert i NADH-nivåer. NADP pluss, NADPH og NADP pluss/NADPH-forholdet resulterer i rottelever gruppert etter vevshøsttidspunkt er vist i tilleggsfigur 9; Det utilstrekkelige antallet obduksjonsprøver tillater oss imidlertid ikke å tolke effekten av vevshøsttidspunkt på NADP(H)-nivåer. I muselever var det ingen forskjell mellom pre- og post-mortem NAD pluss-nivåer, men antallet rapporterende studier var begrensende (fig. 6e). NeiNADH,NADP pluss, ellerNADPHpost mortem data imuselevervar tilgjengelig for sammenligning.

Klikk her for å få Hebrs Cistanche

Diskusjon

Mange nyere studier har vist at NAD(P)(H)-regulering er avgjørende for cellulær homeostase og redoksstatus. Data innhentet fra gnagere har ført til studier som undersøkte nivåer av NAD pluss i humant blod, som en mindre invasiv indikator på NAD plussnivåer i hele kroppen. Nyere kliniske studier viste at NAD pluss-nivåer ble redusert i sykdomstilstander23,47 og forhøyet etter NAD pluss boostingstrategier23,44,48,49. Vi utførte en meta-analyse av alle studier publisert mellom 1946 og 20. juni 2021, som inneholdt kvantitative data for NAD(P)(H)-nivåer hos pattedyrarter med spesielt fokus på mus, rotter og mennesker ettersom de representerer de mest studerte arter i det biomedisinske feltet. Denne analysen ble delvis gjort for å bestemme gjennomsnittlig standardnivå av NAD(P)(H)-konsentrasjoner i normalt pattedyrvev gitt den velkjente variansen i disse målene på tvers av studier. Vi håper at disse dataene kan brukes til å stimulere standardiserte protokoller innen NAD pluss-forskning og for å fremme bruken av NAD(P)(H)-nivåer og redoksforhold som pålitelige biomarkører for sykdoms- og behandlingsregimer.

Til tross for betydelig variasjon i mål på tvers av gnagervev, viste denne metaanalysen lignende gjennomsnittlige NAD pluss-nivåer på tvers av vev med noen unntak. Interessant nok viste museskjelettmuskulatur lavere median NAD pluss-nivåer (fig. 2a) enn andre svært metabolske vev (dvs. lever, nyre, hjerte og hjerne). Dette kan indikere forskjellige NAD(H) redoksstatuser i skjelettmuskulatur eller kan peke på større problemer med metabolittekstraksjon i fibrøst vev. Imidlertid kunne disse observasjonene ikke verifiseres hos mennesker på grunn av mangel på prøvetakende vev utover blod og muskler.

Det er mange potensielle faktorer som kan påvirke nøyaktigheten av fysiologiske NAD(P)(H)-målinger i vevsprøver. Når rapportert, beskrev alle studier at vev ble høstet og direkte nedsenket i flytende nitrogen, eller holdt på is før frysing eller prosessering for å bevare de varmefølsomme fraksjonene (NAD pluss og NADP pluss ). Effekten av pH på de forskjellige NAD(P)(H)-fraksjonene, slik som den syrelabile naturen til de reduserte NAD(P)H-formene, har ført til bruk av pH-nøytrale ekstraksjonsløsninger i flertallet av studiene . Men gitt den raske interkonverteringen av de reduserte og oksiderte metabolittene og effekten av anoksi på NAD(H)50–53, er det også viktig å sikre rask ekstraksjon av vevsmetabolitter og passende prosedyrer for å slukke cellulær NAD(P)(H) )-redoks/konsumenzymer, for eksempel gjennom deproteinisering. På denne måten indikerer vår analyse av pre-versus post mortem vevsinnsamling at post mortem analyse favoriserer reduksjonen av NAD pluss. Reduksjonen av vevs-NAD pluss er tidligere beskrevet in vivo i hjernen, hjertet og leveren til rotter utsatt for en forlenget 2.{10}}h hypoksisk atmosfære54, et miljø som delvis kan rekapituleres av lengre perioder med post- ofre innsamling av vev før hurtigfrysing. Dette kan indikere at ekstrahering av vev under bedøvelse eller prioritering av umiddelbar høsting av vev beregnet på å brukes til metabolittanalyse etter ofring, bør skje for å oppnå representative NAD(P)(H)-målinger.

Det er også potensialet for ulike kvantifiseringsmetoder, som hver har forskjellige begrensninger, for å bidra til den totale variasjonen i NAD(P)(H)-målinger. I de siste to tiårene var de mest brukte metodene enzymsyklusanalyser, LC–MS og HPLC. Hver av disse metodene påvirkes av metabolittekstraksjonsteknikker, kvantifiseringsparametere og implementering av riktig kvalitetskontroll. Ved å bruke LC–MS, Lu et al. har vist at interkonverteringen mellom reduserte og oksiderte former av NAD(P)(H)-metabolitter skjer med forskjellige hastigheter i forskjellige ekstraksjonsbuffere eller løsningsmidler med acetonitril:metanol:vann med 0.1 M maursyreblanding som gir høyest gjenoppretting med færrest interkonverteringer31. Ved bruk av LC–MS kan imidlertid denne interkonverteringen overvåkes mellom individuelle prøver av en studie ved å spike med interne kontroller som NAD(P)(H)-isotoper, noe som er en fordel med LC–MS-teknikken fremfor HPLC og enzym sykkelanalyser31,33,55. Ikke desto mindre, selv med godt kontrollerte LC–MS-teknikker, kan forskjellige faktorer forstyrre det målte signalet, inkludert matriseeffekter og variasjoner i ioniseringseffektivitet. For eksempel bruker noen studier 13C-merkede gjærekstrakter som interne standarder i LC-MS-basert metabolomikk. Imidlertid kan spiking av den ekstraherte prøvemetabolittmatrisen med en 13C-merket gjærekstraktmetabolittmatrise ha ulike konsekvenser, for eksempel ioneundertrykkelse, som reduserer signalet til merkede og/eller umerkede metabolitter, og kan føre til feil i den absolutte kvantifiseringen hvis ikke oppdaget ved en grundig kvalitetsvurdering56. Også, selv om LC–MS-teknikker teoretisk tillater måling av flere NAD(P)(H)-metabolitter i ett eksperiment, er det fortsatt begrensninger siden optimale fortynninger må kjøres hvis metabolittene av interesse har store konsentrasjonsforskjeller. Til tross for fordelene deres i forhold til de enklere enzymsyklusanalysene, krever kompleksiteten til LC–MS-metoder nødvendigheten av grundig optimalisering. Nylig har nye analytiske metoder, som NAD pluss biosensorer og bildebasert massespektrometri, blitt utviklet, men det er fortsatt ikke nok kvantitative data generert fra disse teknikkene til å inkludere i en metaanalyse. Selv om en studie inkludert i metaanalysen vår brukte en papirbasert bioluminescerende biosensor for å måle NAD pluss-nivåer i muselever og andre prøvetyper57. Denne studien ble inkludert i den bioluminescerende analysegruppen på grunn av den lignende metoden for deteksjon (fig. 1a).

Metoder

Datautvinning.

Numeriske data for NAD(P)(H)-metabolitter ble enten hentet direkte fra artiklene eller trukket ut fra artikkelfigurer ved bruk av en semi-automatisk dataekstraksjonsprogramvare (WebPlotDigitizer58). I tillegg, der det er aktuelt, ble tidspunktene for vevsprøvetaking i forhold til ofring og/eller vev/blodprøvemetoder (dvs. metode for anestesi og/eller eutanasi, vevshåndtering og lagringstemperatur) registrert. For dyremodeller ble arten, egenskaper (f.eks. stamme, genotype, alder og vekt) og miljøforhold (f.eks. søvnsyklus, type diett, fôringsfrekvens og fôringstilstand i forhold til vevsprøvetaking) registrert. I tillegg, for alle studier, ble behandlinger (f.eks. farmakologiske behandlinger, operasjoner, bestråling, tumorinduksjon og andre prosedyrer brukt på studieobjektene) og all studiegruppeinformasjon (f.eks. behandlings- eller sykdomsgrupper og tilsvarende kontroller) hentet ut. Til slutt, metoden for NAD(P)(H) kvantifiseringsmetode (f.eks. enzymatiske analyser, massespektrometri-basert, HPLC, NMR, bioluminescens) og publikasjonsspesifikasjoner (dvs. publikasjonstittel, referansekode [DOI, Medline UI, PMID] eller hyperkobling og utgivelsesår) ble notert (Tilleggsmateriell 2).

Dataanalyse. Før analyse ble alle konsentrasjoner konvertert til nmol/g vev eller nmol/g proteiner for vevsprøver eller nmol/ml for blodfraksjoner. På grunn av det lave antallet resultater normalisert til proteininnhold, viser vi kun resultater normalisert til vevsvekt og blodvolum. Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism versjon 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, California, USA,DatatilgjengelighetAlle data hentet ut og analysert i løpet av denne studien er inkludert i denne publiserte artikkelen og dens tillegginformasjon fles.Mottatt: 29. april 2022; Godkjent: 7. februar 2023

Referanser

10. Kjærlighet, NR et al. NAD-kinase kontrollerer dyrenes NADP-biosyntese og moduleres via evolusjonært divergerende kalmodulinavhengige mekanismer. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 1386–1391 (2015).

Spør om mer:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: pluss 86 15292862950