MikroRNA i nyreutvikling og sykdom Ⅱ

Nyreutvikling

Depattedyrs nyre(eller metanephros) er et vital organ som spiller en kritisk rolle iutskillelse av metabolsk avfall,regulering av ekstracellulært væskevolum, ogvedlikehold av elektrolyttogsyre-base homeostase. Dessuten produserer nyren viktige hormoner, som f.ekserytropoietin, kalsitriol,renin, ogprostaglandiner(48). Den funksjonelle kapasiteten til nyrene korrelerer med antall fungerende nefroner som dannes under nyreutvikling før fødselen, også kalt nefronbegavelse. Hver menneskelig nyre inneholder i gjennomsnitt 1,000,000 nefroner, selv om dette tallet varierer betydelig, med estimater fra 200,000 til 2,000,{{8 }} nefroner (49, 50). Medaldring,tap av funksjonell nefronreserveoppstår over tid (51, 52); derfor er lav nefronbegavelse ved fødsel assosiert med økt risiko for å utvikle hypertensjon og kronisk nyresykdom (CKD) senere i livet (53–55). Dessuten er CAKUT, som fører til redusert nefrontilførsel og nefronfunksjon, den ledende årsaken til nyresvikt hos barn, noe som resulterer i betydelig sykelighet og dødelighet assosiert med transplantasjon og dialyse (56, 57). Dermed gir en bedre forståelse av de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for etableringen av nefrontall og normal nefrondannelse innsikt i nye veier for å forutsi, forebygge og behandle nyresykdom hos barn.

HVOR LANG TAR DET FOR CISTANCHE Å JOBBE FOR NYRESYKDOMSPASIENTER?

Metanefri nyreutviklingstarter rundt embryonal dag 10.5 (E10.5) hos mus og rundt femte svangerskapsuke hos mennesker (58). Som respons på induktive signaler fra det metanefrie mesenkymet, strekker ureterknoppen seg fra den kaudale enden av Wolffian-kanalen og invaderer inn i det tilstøtende mesenkymet (Figur 2). Samtidig induserer morfogener som kommer fra den ureteriske knoppen kondensering av det metanefrie mesenkymet for å danne cap-mesenkymet (også kalt nefron-progenitorer) rundt tuppen av ureterknoppen. Etter hvert som nefrogenesen skrider frem, gjennomgår ureterknoppen påfølgende runder med forgrening, forlengelse og differensiering for å generere samlingskanalene i nyrene. En underpopulasjon av nefronforløpere gjennomgår mesenkymal-epitelial overgang for å danne nyrevesikler, som etter polarisering og forlengelse blir komma- og S-formede kroppsstrukturer. Til slutt smelter den distale delen av den S-formede kroppen sammen med samlekanalen for å danne et funksjonelt nefron (59–61). Den S-formede kroppen gjennomgår ytterligere differensiering for å danne de modne celletypene til nefronet, bortsett fra samlekanalen. Foxd1+ stromale stamceller er tilstøtende nefronprogenitorceller i den ytre kortikale eller nefrogene sonen av den utviklende nyren (figur 2) (62). Signaler fra det kortikale stroma antas å hemme nefronstamcelleutvidelsen og stimulere dens differensiering, da ablasjon av nyrestromaet resulterer i nedsatt nefronstamfaderdifferensiering (63). Foxd1+ stamceller gir opphav til alle stromale celler i den metanefrie nyren, inkludert nyrekortikale og medullære interstitielle celler, pericytter, perivaskulære fibroblaster, mesangiale celler og vaskulære glatte muskelceller (64, 65). Forstyrrelser i alle trinn i denne prosessen kan føre til CAKUT, den viktigste årsaken til CKD i barndommen (66, 67).

Det modne nefronet er sammensatt av en glomerulus som fungerer som filtreringsenheten og et rørformet bakre sorpsjonsrom som er delt inn i en proksimal kronglete tubulus, en løkke av Henle, en distal kronglete tubulus og en samlekanal (Figur 2). Filtreringsbarrieren til glomerulus (som omfatter det fenestrerte endotelet, den glomerulære basalmembranen, fotprosesser og spaltemembraner til podocytter) tillater filtrering av plasma og små oppløste stoffer, samtidig som proteiner som albumin og immunglobuliner holdes selektivt i blodet (68, 69). I mellomtiden er det rørformede reabsorpsjonsrommet ansvarlig for vedlikehold av vannhomeostase, reabsorpsjon av oppløste stoffer (inkludert natrium, kalium, kalsium, fosfor, magnesium, glukose og mange andre), og utskillelse av syre og annet avfall.

MiRNA i den utviklende nyren

I studier i betingede transgene mus har miRNA-er dukket opp som kritiske regulatorer av nyremorfo-genese i flere cellelinjer. De første studiene som evaluerte en funksjonell rolle for miRNA i nyreutviklingen benyttet betinget sletting av Dicer (70) i ​​forskjellige nyrelinjer. Dicer er imidlertid også kjent for å ha miRNA-uavhengige roller (71), noe som har komplisert tolkningen av disse modellene. Betinget sletting av Dicer i tidlige metanefriske mesenkym- eller nefronforfedre resulterer i forsterket apoptose av nefronforfedre, forhøyede nivåer av det proapoptotiske proteinet Bim og for tidlig opphør av nefrogenese (72–75) (tabell 1). Interessant nok reduserer tapet av Bim-ekspresjon i Dicer-mangelfulle nefron pro genitorer apoptose og gjenoppretter delvis nefrondannelse. To miRNA-er uttrykt i nefron-progenitorer, miR-17 og miR-106, ble identifisert som suppressorer av BIM-ekspresjon (76). Sammen indikerer disse funnene at miRNA-er kontrollerer balansen mellom overlevelse og apoptose i nefronforfedre for å sikre dannelsen av et korrekt antall nefroner gjennom nefrogenesen.

Figur 2. Skjematisk illustrasjon av stadier av metanefri nyreutvikling. Signaler fra ureterknoppen utløser kondensering av det metanefrie mesenkymet for å danne en hette av nefronforløpere (cap mesenchyme) rundt ureterknoppspissene. Cap mesenchyme gjennomgår en mesenchymal-epitelial overgang for å danne nyrevesikler, som utvikler seg sekvensielt til komma- og S-formede legemer. Disse strukturene kobles til urinrørets knoppstilk, som gir opphav til samlekanalen. Celler i det proksimale domenet til den S-formede kroppen differensierer til spesialiserte epitelceller i det modne nyrelegemet (dvs. podocytter og Bowmans kapselceller), mens celler i de midtre og distale delene differensierer til de tubulære segmentene av nefron (proksimale tubuli) , løkker av Henle og distale tubuli). Laget med BioRender.com.

Betinget sletting av Dicer i ureterknoppen resulterer i et spekter av abnormiteter som minner sterkt om CAKUT, inkludert nyredysplasi og utvikling av samlende kanalcyster (73, 77, 78). Prematur terminering av forgreningsmorfogenese (som respons på redusert ekspresjon av Wnt11 og c-Ret fra ureterknoppen) er sannsynligvis den viktigste medvirkende faktoren for nyredysplasi (73). Begynnelsen av cystedannelse skjer rundt E15.5 og er assosiert med defekter i primær cilia-lengde, økt apoptotisk celledød og overdreven celleproliferasjon (73). Siden Dicer har viktige miRNA-uavhengige roller i cellen, har betinget sletting av Dgcr8 blitt brukt for å bekrefte at fenotypene observert i betingede Dicer-knockout-modeller faktisk er et resultat av tap av miRNA. Dyr med Dgcr8-delesjon i det distale nefronet og derivater av oppsamlingskanalen utvikler hydronefrose og samlekanalcyster (79), en CAKUT-lignende fenotype som ligner tapet av Dicer-aktivitet i ureterknoppen.

Studier fra to uavhengige grupper viste at ablasjon av Dicer fra Foxd1+ nyrestroma-linjen og dens derivater resulterer i et spekter av nyreanomalier, med konsistente funn angående hypoplastiske nyrer, redusert glomerulært antall, unormal glomerulær modning og defekt vaskulær mønster (80, 81). Selv om begge gruppene beskrev stort sett samsvarende fenotyper ved bruk av lignende musemodeller, ble to distinkte forskjeller notert. Nakagawa et al. observert mangel på indre medulla og papilla, samt nedgang i nefrogen sone (80). I motsetning til dette, Phua et al. viste en utvidelse av nefronprogenitor-populasjonen og bevart nyrepapill (81). Nakagawa et al. foreslått at disse defektene er relatert til forstyrrelsen av Wnt-banens signalering, noe som resulterer i endringer i stromalcellemigrasjon og -proliferasjon, på grunn av nedregulering av stromalcelle miRNA, miR-214, miR-199a{{7 }}p, og miR-199a-3p (80). Studien av Phua et al. antydet at endringer i apoptotiske programmer (inkludert utvidet ekspresjon av Bim- og p53-effektorgener) bidrar til fenotypiske defekter (81). Det kan tenkes at genetiske bakgrunnsforskjeller og/eller effektiviteten av Cre-mediert rekombinasjon kan være ansvarlig for forskjellene disse studiene beskriver. Ikke desto mindre er de beskrevne fenotypene i samsvar med de kjente mangefasetterte rollene til nyrestroma i nyreutvikling, og mekanismene som ligger til grunn for disse fenotypene er sannsynligvis komplekse gitt arten av en Dicer-sletting. Ytterligere studier som undersøker spesifikke miRNA-er i forskjellige stromale subpopulasjoner er nødvendig for å bedre definere de regulatoriske mekanismene som spiller.

Nyere arbeid har adressert spørsmålet om funksjonen til spesifikke miRNA-er i både utviklende nyre- og nefronforfedre. Ved å bruke en human embryonal stamcellemodell, Bantounas et al. viste at hemming av miR-199a~214-klyngen resulterer i dysmorfe glomeruli, avvikende proksimale tubuli, redusert WT1-ekspresjon og økte interstitielle kapillærer i nyrelignende organoider (82). Interessant nok resulterer global sletting av hypoksi-responsiv miR-210 i et mannsspesifikt nefronunderskudd (83). For eksempel, betinget sletting av miR-17~92-klyngen i nefronforløpere og deres derivater i mus svekker progenitorcelleproliferasjon og reduserer antallet utviklende nefroner. Som et resultat utvikler mutante mus proteinuri, nyrefibrose og nedsatt nyrefunksjon (84). Dysregulerte nivåer av miR-17~92 målgenet, CFTR, er implisert i den defekte spredningen av stamceller og redusert nefrontilførsel i denne musemodellen (85).

Liten RNA-sekvensering (smRNA-Seq) har i økende grad blitt brukt til å profilere miRNA-ekspresjonsmønstre og for oppdagelsen av nye miRNA-arter. smRNA-Seq av E15.5 nefrogene mesenkymale celler identifiserte 162 kommenterte miRNA som er differensielt uttrykt i denne cellepopulasjonen sammenlignet med hele nyrer og 49 nye miRNA-arter (86). Interessant nok ble nivåene av miR-200-familiens miRNA-er betydelig redusert i nefronforfedre. Gitt at medlemmer av miR-200-familien er nøkkelregulatorer av mesenkymal-epitelial overgang i samlekanalen (87), spekulerer vi i at deres uttrykk kan være tett regulert for å sikre normal epiteldifferensiering av nefronforløpere under nyreutvikling.

MiRNA-funksjon i det modne nefronet

I tillegg til deres behov under nyreutvikling, regulerer miRNA en rekke biologiske prosesser i de store cellelinjene som danner det modne nefronet (69, 88–91). I tråd med dette er segmentspesifikke uttrykk for miRNA langs nefronet beskrevet, inkludert miR-143 og miR-195a i glomerulus, miR-107 og miR{{7} }a i den proksimale tubuli, miR-193 og miR-378a i den tykke ascenderende lem, miR-874 og miR-155 i distale convoluted tubuli, og miR{{ 12}}c i samlekanalen (87). Dessuten støtter funksjonelle studier i avdelinger av det modne nefronet distinkte roller for miRNA.

Mus som mangler enten Dicer eller Drosha i podocytter, viser markert proteinuri, glomerulosklerose og rask progresjon til nyresvikt, sekundært til forstyrrelse av den glomerulære filtrasjonsbarrieren (90–93). I silico-analyser avdekket at forskjellige oppregulerte transkripsjoner i mutante glomeruli inneholder målsekvenser for miR-30-familiemedlemmer. Som alle fire miR-30 familiemedlemmer (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d og miR-30c{ {9}}) er normalt sterkt uttrykt i podocytter, kan disse miRNA-ene være ansvarlige for podocyttavvik og forstyrrelse av den glomerulære filtrasjonsbarrieren hos mutante mus (91).

Noe overraskende påvirker sletting av Dicer fra postnatale pattedyrs proksimale tubuli ikke nyreutvikling, histologi eller funksjon, men beskytter mot nyreiskemi/reperfusjonsskade. Mutante mus viser bedre nyrefunksjon, redusert nyreskade, lavere tubulær apoptose og forbedret overlevelse sammenlignet med sine WT-kullkamerater (94). Dette gjenspeiler sannsynligvis "summen" av effekten av sletting av flere miRNA-er i den proksimale tubulus, ettersom annet arbeid siden har vist at uttrykket av spesifikke miRNA-er er beskyttende ved nyreiskemi/reperfusjonsskade (f.eks. miR-16 og miR-21; ref. 95, 96); mens andre er skadelige (f.eks. miR-182; ref. 97).

Selv om miRNA ser ut til å være unødvendig for proksimal tubulusfunksjon, er de essensielle for distale nefroner og samlekanalhomeostase (79, 88, 98). Innsamling av kanalspesifikk inaktivering av Dicer og andre kritiske miRNA biogenese-assosierte gener (inkludert Dgcr8, Ago1, 2, 3 og 4) forårsaker nyresvikt hos voksne mus på grunn av progressiv tubulointerstitiell fibrose og interstitiell betennelse (88). Dette innledes med en delvis epitel-mesenkymal overgang (EMT) av samlende kanalceller, og nedregulering av miR{12}}-familiemedlemmer, som hemmer EMT (88). Likeledes resulterer ablasjon av enten Dicer eller Dgcr8 fra distale nefron- og ureteriske knopperderivater i nyreabnormaliteter og nyresvikt (78, 98), som til slutt er assosiert med nedregulering av miR-200-familiemedlemmer (98). Økt ekspresjon av miR-200-målgenet Pkd1 i disse mutante musene forstyrrer tubulogenesen og produserer cystelignende strukturer (98). Disse forskjellene i kravet til funksjonelle miRNAer i proksimale tubuli og distale nefron/samlingskanal kan forklares av segmentfordelingen av miRNA langs lengden av nefronet og samlekanalen i WT-nyrene (88).

Delesjon av Dicer i renin-utskillende celler i det juxtaglomerulære apparatet resulterer i underskudd av juxtaglomerulære celler, reduserte sirkulerende reninnivåer med påfølgende reduksjon i arterielt blodtrykk, redusert nyrefunksjon, stripete mønster av interstitiell fibrose og vaskulære abnormiteter (89). Reduksjonen i juxtaglomerulære celler antyder et krav om modne miRNA-er for å opprettholde deres fenotype. Senere ble miR-330 og miR-125b-5p identifisert som potensielle kandidater som henholdsvis hemmer eller fremmer glattmuskelfenotypen til juxtaglomerulære celler (99).

Andre aktive forskningsområder på miRNA ved akutt nyreskade (8–10), polycystisk nyresykdom (11) og nyretransplantasjon (10), har blitt omfattende behandlet i andre nylige oversikter.

MiRNA ved pediatriske nyresykdommer I denne delen gir vi en oversikt over rollen til miRNA i utviklingsmessige nyresykdommer, inkludert CAKUT- og Wilms-svulster. CAKUT er blant de hyppigste formene for misdannelser ved fødselen, og rammer omtrent 3–7 av 1000 levendefødte (100). Forstyrrelse av utviklingen av nyrene og nedre urinveier fører til et bredt spekter av kliniske manifestasjoner observert i CAKUT, inkludert nyreanomalier (dvs. renal agenesis, renal hypoplasi og dysplasi, og multicystiske dysplastiske nyrer), ureteropelvic anomalier (dvs. ureteropelvic junction obstruksjon), dupleks samlesystem, og anomalier i blæren og urinrøret (101–103). Denne fenotypiske heterogeniteten skyldes sannsynligvis komplekse interaksjoner mellom genetiske, epigenetiske og/eller prenatale miljøfaktorer som påvirker utviklingen av nyre og nedre urinveier, noe som resulterer i CAKUT (101). Mesteparten av vår nåværende kunnskap om CAKUT-patogenese har oppstått fra musemodeller og syndromiske former for CAKUT. Disse studiene har ført til identifisering av flere CAKUT-gener, hvorav mange er involvert i tidlig nyreutvikling, inkludert PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 og andre (101, 104, 105). Enkeltmutasjoner eller kopinummervarianter i proteinkodende gener forklarer imidlertid ikke flertallet av CAKUT-tilfellene (~80%) (101, 106).

Som nevnt ovenfor, resulterer uttømming av modne miRNA fra forskjellige cellelinjer i den utviklende nyren i musemodeller i nyreabnormaliteter som etterligner human CAKUT (73, 74, 78, 79). I tillegg forårsaker kimlinjeslettinger av MIR17HG, som koder for miR-17~92-klyngen, type 2 Feingold-syndrom hos mennesker (107). Selv om en renal fenotype hos pasienter med Feingold-syndrom type 2 med MIR17HG-mutasjoner forblir udefinert, er en 18 % forekomst av CAKUT rapportert i Feingold-syndromtilfeller assosiert med MYCN-mutasjoner (108, 109). Sammen antyder disse observasjonene at mutasjoner i miRNA-er uttrykt under nyreutvikling kan forårsake CAKUT hos mennesker, spesielt ettersom mange miRNA-er er svært konserverte mellom mus og mennesker.

For å teste denne hypotesen undersøkte en studie 1248 pasienter med ikke-syndromisk CAKUT fra 980 familier og så etter mutasjoner i 96 stamløkkeregioner av 73 nyreutviklingsmiRNA-gener (106). Innenfor denne kohorten ble 31 individer med 17 forskjellige enkeltnukleotidvarianter som påvirker 16 forskjellige miRNA-gener identifisert. Blant disse ble to nye varianter i miRNA funnet å være potensielt patogene. MIR19B1 (et medlem av miR-17~92-klyngen) var assosiert med tilstedeværelsen av høyre nyre-agenese, og MIR99A var assosiert med alvorlig vesikoureteral refluks og nyre-ptose. Dette overraskende lave antallet kandidat-patogene varianter skyldes delvis begrensningene i denne studien, da analysen kun tok for seg mutasjoner i miRNA-gener som var inkludert i kandidatgen-tilnærmingen og ikke oppdaget kopiantallvariasjoner og store DNA-omorganiseringer (106) .

I en alternativ tilnærming ble uretersegmenter fra pasienter med en rekke CAKUT analysert for differensiell transkripsjonsuttrykk via mikroarray, for tilstedeværelse av bioinformatisk forutsagte miRNA-mål, og modne miRNA-er via qPCR (110). Ved å bruke denne flerstrengede tilnærmingen ble syv miRNA-er identifisert med potensielle roller i CAKUT, og blant disse var has-miR-144 betydelig økt hos pasienter med CAKUT. Genontologianalyse indikerte at predikerte has-miR-144-målgener bidrar til biologiske prosesser involvert i CAKUT-utvikling, inkludert rørutvikling (22 målgener), utvikling av urogenital system (18 målgener), nyreutvikling (14 målgener) , og embryonal organutvikling (18 målgener) (110).

Ytterligere studier er nødvendig for å definere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for de patogene rollene til miRNA i CAKUT. Funn fra slike studier vil være avgjørende for å forbedre omsorgen for pasienter med CAKUT og forhindre deres progresjon til CKD, gi passende genetisk rådgivning for pasienter og deres familier, og utvikle nye terapeutiske strategier.